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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Para estudiar las interacciones chaperona-chaperona y chaperona-sustrato, realizamos pantallas de interacción sintética en Caenorhabditis elegans utilizando interferencia de ARN en combinación con mutaciones leves o sobreexpresión de chaperonas y monitoreamos la disfunción proteica específica del tejido a nivel del organismo.

Resumen

El correcto plegamiento y ensamblaje de proteínas y complejos proteicos es esencial para la función celular. Las células emplean vías de control de calidad que corrigen, secuestran o eliminan las proteínas dañadas para mantener un proteoma saludable, asegurando así la proteostasis celular y previniendo un mayor daño proteico. Debido a las funciones redundantes dentro de la red de proteostasis, la detección de fenotipos detectables mediante el derribo o mutaciones en genes que codifican chaperonas en el organismo multicelular Caenorhabditis elegans da como resultado la detección de fenotipos menores o nulos en la mayoría de los casos. Hemos desarrollado una estrategia de detección dirigida para identificar las chaperonas necesarias para una función específica y, por lo tanto, cerrar la brecha entre el fenotipo y la función. Específicamente, monitoreamos las nuevas interacciones de chaperonas utilizando pantallas de interacción sintética de ARNi, derribando la expresión de chaperonas, una chaperona a la vez, en animales portadores de una mutación en un gen que codifica chaperona o sobreexpresando una chaperona de interés. Al interrumpir dos chaperonas que individualmente no presentan fenotipo grueso, podemos identificar chaperonas que agravan o exponen un fenotipo específico cuando ambas perturban. Demostramos que este enfoque puede identificar conjuntos específicos de chaperonas que funcionan juntas para modular el plegamiento de una proteína o complejos de proteínas asociados con un fenotipo dado.

Introducción

Las células hacen frente al daño de las proteínas mediante el empleo de maquinarias de control de calidad que reparan, secuestran o eliminan cualquier proteína dañada1,2. El plegamiento y el ensamblaje de complejos de proteínas están respaldados por chaperonas moleculares, un grupo diverso de proteínas altamente conservadas que pueden reparar o secuestrar proteínas dañadas3,4,5,6,7. La eliminación de proteínas dañadas está mediada por el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS)8 o por la maquinaria de autofagia9 en colaboración con chaperonas10,11,12. La homeostasis proteica (proteostasis) se mantiene, por lo tanto, mediante redes de control de calidad compuestas por maquinarias de plegamiento y degradación3,13. Sin embargo, comprender las interacciones entre los diversos componentes de la red de proteostasis in vivo es un desafío importante. Si bien las pantallas de interacción proteína-proteína aportan información importante sobre las interacciones físicas y los complejos de chaperonas14,15, es deficiente comprender la organización y los mecanismos compensatorios dentro de las redes de chaperonas específicas de los tejidos in vivo.

Las interacciones genéticas se utilizan a menudo como una herramienta poderosa para examinar la relación entre pares de genes que están involucrados en vías biológicas comunes o compensatorias16,17,18. Tales relaciones se pueden medir combinando pares de mutaciones y cuantificando el impacto de una mutación en un gen en la gravedad fenotípica causada por una mutación en el segundo gen16. Si bien la mayoría de estas combinaciones no muestran ningún efecto en términos de fenotipo, algunas interacciones genéticas pueden agravar o aliviar la gravedad del fenotipo medido. Las mutaciones agravantes se observan cuando el fenotipo del mutante de doble deleción es más grave que el fenotipo esperado visto al combinar los mutantes de deleción simple, lo que implica que los dos genes funcionan en vías paralelas, afectando juntos a una función dada. Por el contrario, se observan mutaciones de alivio cuando el fenotipo del mutante de doble deleción es menos grave que el fenotipo observado con los mutantes de deleción simple, lo que implica que los dos genes actúan juntos como un complejo o participan en la misma vía16,18. En consecuencia, se han utilizado diversos fenotipos que se pueden cuantificar, incluidos fenotipos amplios, como la letalidad, las tasas de crecimiento y el tamaño de la cría, así como fenotipos específicos, como los reporteros transcripcionales, para identificar interacciones genéticas. Por ejemplo, Jonikas et al. se basaron en un reportero de estrés de ER para examinar las interacciones de la red de proteostasis de respuesta proteica desplegada por Saccharomyces cerevisiae ER utilizando análisis de deleción de genes por pares19.

Las pantallas de interacción genética implican el cruce sistemático de mutaciones de deleción por pares para generar un conjunto completo de mutantes dobles20. Sin embargo, en modelos animales, y específicamente en C. elegans,este enfoque a gran escala no es factible. En cambio, las cepas mutantes pueden ser probadas por sus patrones de interacción genética mediante la regulación a la baja de la expresión génica utilizando la interferencia de ARN (RNAi)21. C. elegans es un potente sistema para pantallas basado en RNAi22,23. En C. elegans, laentrega de ARN de doble cadena (dsRNA) se logra mediante la alimentación bacteriana, lo que lleva a la propagación de moléculas de dsRNA a numerosos tejidos. De esta manera, las moléculas de dsRNA introducidas impactan al animal a través de un procedimiento rápido y sencillo21. Una pantalla de interacción genética utilizando RNAi puede, por lo tanto, revelar el impacto de la regulación a la baja de un conjunto de genes o la mayoría de los genes codificantes de C. elegans utilizando bibliotecas de RNAi24. En dicha pantalla, los golpes que impactan en el comportamiento del mutante de interés pero no en la cepa de tipo salvaje son potenciales modificadores del fenotipo que se está monitoreando25. Aquí, aplicamos una combinación de mutaciones y cribado de ARNi para mapear sistemáticamente las interacciones de chaperonas específicas de tejidos en C. elegans.

Protocolo

1. Preparación de placas de medios de crecimiento de nematodos para RNAi

  1. A una botella de 1 L, agregue 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptona, 17 g de agar y agua destilada hasta 1 L y autoclave.
  2. Enfríe la botella a 55 °C.
  3. Añadir 25 mL de 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, y 1 mL de solución de colesterol (Tabla 1) para hacer nematodos medios de crecimiento (NGM).
  4. Añadir 1 ml de ampicilina (100 mg/ml) y 0,5 ml de 1 M de IPTG (Tabla 1) para hacer la solución de NGM-ARNi.
    NOTA: La bacteria E. coli HT115 (DE3) de uso común contiene una ADN polimerasa T7 inducible por IPTG utilizada para expresar los plásmidos que codifican dsRNA. Estos plásmidos también codifican para la resistencia a la ampicilina.
  5. Mezcle la solución tibia removiendo la botella.
  6. En la campana o utilizando procedimientos estériles, vierta la solución de NGM en placas o usando una bomba peristáltica, dispense la solución en placas. Utilice placas de 6 pozos, 12 pozos, 40 mm o 60 mm para esta pantalla. El agar debe llenar aproximadamente 2/3 de la profundidad de la placa.
  7. Deje que las placas se sequen durante la noche en el banco a temperatura ambiente, manteniendo las placas cubiertas. Las placas NGM para RNAi se pueden almacenar a 4 °C durante un mes.

2. Cultivo de bacterias RNAi y siembra de las placas

  1. En la campana o mediante procedimientos estériles, añadir 1 ml de ampicilina (100 mg/ml) y 2,5 ml de tetraciclina (5 mg/ml) (Tabla 1) a una solución de LB de 1 L preautoclave y mezclar.
    NOTA: Las bacterias HT115 (DE3) E. coli de uso común son resistentes a la tetraciclina.
  2. En la campana o utilizando procedimientos estériles, agregue 600 μL de solución de LB a cada pozo en placas estériles de 96 ormentos de 2 ml de profundidad. Lo mejor es utilizar una pipeta multicanal para dispensar los medios.
  3. Mediante procedimientos estériles, inocular pozos con bacterias HT115(DE3) E. coli transformadas con un plásmido codificante de dsRNA dirigido a un gen de interés o a un plásmido vacío, como control. Cubra las placas e incube a 37 °C durante la noche. Las bibliotecas que consisten en clones bacterianos que expresan dsRNA, correspondientes a ~ 94% de los genes predichos de C. elegans se construyeron previamente22,23 y están disponibles comercialmente. La biblioteca de acompañantes utilizada aquí fue construida por el laboratorio del Dr. Richard Morimoto26.
  4. Utilizando procedimientos estériles, seeste 75, 150 o 250 μL de bacterias en las placas de ARNi NGM de 12 pozos, 40 mm y 6 o 60 mm, respectivamente. Marque claramente el nombre del gen objetivo en la placa. Las bacterias deben cubrir el 30-50% de la superficie del agar y no deben tocar los bordes de la placa.
  5. Deje que las placas se sequen durante al menos 2 días en el banco a temperatura ambiente, manteniendo las placas cubiertas.
    NOTA: Las placas se pueden incubar a 37 °C durante la noche. Asegúrese de que los pozos interiores estén secos antes de usar o almacenar las placas. Para todos los fines a largo plazo (es decir, secado o almacenamiento) mantenga las placas en la oscuridad. Las placas secas y secuedradas se pueden almacenar a 4 °C hasta por un mes.

3. Sincronización no estresante de embriones

  1. Use una púa de gusano para mover alrededor de 100 huevos de una placa de gusano no sincronizada a una placa NGM recién secuenada.
  2. Cultive animales durante 5 días a 15 °C, 3,5 días a 20 °C o 2,5 días a 25 °C. Los animales deben llegar al primer día de puesta de huevos.
    NOTA: Los gusanos se cultivan comúnmente a 20 ° C. Sin embargo, diferentes cepas mutantes chaperonas pueden requerir temperaturas de cultivo específicas. Por ejemplo, muchas cepas sensibles a la temperatura se cultivan a 15 °C, pero se desplazan a 25 °C para exponer su fenotipo.
  3. Agregue 1 ml de tampón M9(Tabla 1)lentamente y lejos del césped bacteriano. Gire la placa para que el tampón cubra completamente la placa. Luego inclínelo hacia un lado y retire el líquido del plato y lave a los animales del plato.
    NOTA: Cuando se utilizan animales sensibles a la temperatura o mutantes chaperones, es mejor mantener los tampones utilizados en el protocolo a la temperatura de cultivo de los animales.
  4. Repita el paso 3.3 tres veces o hasta que todos los animales se laven del plato.
  5. Usando una punta de plástico estándar, corte un cuadrado de agar del plato lavado donde se concentran los huevos y coloque el trozo de agar en un plato NGM recién sembrado.
    NOTA: Se requieren ~ 200 huevos para producir suficientes animales que ponen huevos; demasiados animales consumen la bacteria demasiado rápido. Los niveles bajos de alimentos pueden afectar la proteostasis27.
  6. Cultive los animales durante 5 días a 15 °C, 3,5 días a 20 °C o 2,5 días a 25 °C. En este punto, las placas deben cubrirse con huevos sincronizados.
    NOTA: Los animales se pueden cambiar a una nueva placa durante un corto período de tiempo para una sincronización más estricta. Sin embargo, es importante usar solo adultos en las primeras etapas de la puesta de huevos, ya que los animales pueden retener los huevos en su útero afectando la sincronización.
  7. Agregue 1 ml de tampón M9 lentamente y lejos del césped bacteriano.
  8. Gire la placa para que el tampón cubra completamente la placa. Luego inclínelo hacia un lado y retire el líquido del plato y lave a los animales del plato.
  9. Repita el paso 3.7 tres veces o hasta que todos los animales se laven del plato.
  10. Agregue 1 ml de tampón M9 y use un raspador de células para liberar los huevos de la placa.
  11. Recoge el tampón M9 que contiene los huevos de las placas.
  12. Centrifugar el tampón M9 que contiene los huevos a 3.000 x g durante 2 min.
  13. Retire el sobrenadante y agregue el búfer M9 para alcanzar un volumen de 1 ml.
  14. Resuspenda los huevos para interrumpir cualquier trozo de huevos y bacterias.
  15. Repita el procedimiento de lavado descrito en los pasos 3.11-3.13 cinco veces. El pellet de huevo debe aparecer blanco. Si todavía es amarillo / marrón, repita el lavado hasta que se alcance un gránulo blanco.
    NOTA: Las bacterias que permanecen en los huevos pueden contaminar las bacterias que expresan dsRNA.
  16. Retire la mayor parte del sobrenadante, dejando unos 200 μL. Los huevos sincronizados se pueden usar para pantallas de ARNi.

4. Ensayos fenotípicos comunes

  1. Cultivo de animales durante experimentos
    1. Coloque una gota de ~ 30 huevos cerca del césped bacteriano en cada placa con semillas de ARNi. Como referencia, también coloque ~ 30 huevos en placas secuesdas con bacterias vacías que contienen vectores (L4440).
    2. Cultive animales sincronizados por la edad en placas con semillas de ARNi NGM. La duración del experimento dependerá de la etapa en la que se controlará a los animales y de la temperatura de cultivo. Ajuste la temperatura de cultivo cuando use animales mutantes sensibles a la temperatura. Ajuste la duración del cultivo cuando use animales mutantes con retraso en el desarrollo.
      NOTA: Si bien el tiempo puede variar, una vez que los animales alcanzan la edad adulta, la puesta de huevos (y el consumo rápido de alimentos resultante), así como el colapso de proteostsis dependiente de la edad28, podrían afectar los resultados. Por lo tanto, se recomienda puntuar a los animales antes del inicio de la puesta de huevos (día 1 de la edad adulta). Los animales de tipo salvaje alcanzan esta etapa después de 4,5 días a 15 °C, 3 días a 20 °C o 2 días a 25 °C.
    3. El número de repeticiones utilizadas dependerá del tamaño del conjunto de genes examinado. Para la biblioteca de chaperonas (97 genes), repita los experimentos al menos cuatro veces. El tamaño de la población depende del ensayo utilizado. En los ensayos de comportamiento discutidos aquí, puntúa >15 animales por condición experimental en cada repetición. Los datos y los análisis estadísticos también dependen en gran medida del tipo de ensayo utilizado. Los datos en los ensayos discutidos aquí se pueden presentar como medios ± SEM.
    4. Compare los animales tratados con ARNi y control de vectores vacíos como poblaciones independientes. Los valores de P se pueden calcular utilizando ANOVA unidireccional o bidireccional, dependiendo de los cambios examinados, es decir, agravando o aliviando solo o ambos. Al examinar un solo tratamiento de ARNi frente a control, los valores de P se pueden calcular utilizando la prueba de suma de rango de Mann-Whitney unidirección o bidireccional. Aparte de la significación estadística, considere un umbral para los aciertos basado en el grado de impacto en el fenotipo.
  2. Detención/retraso en el desarrollo
    1. Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias de control que contienen vectores vacíos alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.
    2. Monitoree a los animales usando un estereomicroscópica y cuente el número de larvas y adultos para calificar el porcentaje de animales con retraso en el desarrollo. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias de control que contienen vectores vacíos. El tratamiento con ARNi hsp-1 o hsp-90 da como resultado la detención del desarrollo de animales de tipo salvaje y se puede utilizar como un control positivo.
    3. Para calificar el porcentaje de animales con retraso en el desarrollo a lo largo del tiempo, repita el paso 4.2.2.
      NOTA: Si hay adultos que ponen huevos en el plato, transfiera los animales retrasados por el desarrollo a una nueva placa NGM-RNAi etiquetada para el mismo gen objetivo para evitar confusiones con la progenie.
  3. Defectos de esterilidad o puesta de huevos
    1. Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias vacías de control de vectores comiencen a poner huevos.
    2. Monitoree a los animales usando un estereomiroscopio y puntúe el porcentaje de animales sin óvulos visibles en su útero. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores.
    3. Alternativamente, monitoree a los animales usando un estereomiroscopio y puntúe el porcentaje de animales con un útero lleno de huevos, definido como EGg Poneción defectuosa (Egl-d) fenotipo29.
  4. Letalidad embrionaria
    1. Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales comiencen a poner huevos.
    2. Transfiera ~ 100 huevos a un plato vacío. Extiende los huevos en filas para simplificar el conteo.
    3. Anote el porcentaje de huevos no eclostos en el plato después de 24-48 horas. Como referencia, compare con los huevos de animales tratados con bacterias de control de vectores vacías.
  5. Ensayo de parálisis
    1. Para los adultos del día 1, cultive animales sincronizados por la edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias vacías de control de vectores alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.
    2. Dibuja una línea en la parte posterior de una placa de agar NGM normal usando un marcador fino.
    3. Coloque de 5 a 10 animales en la línea marcada.
    4. Configure un temporizador y espere 10 minutos.
    5. Puntúe el porcentaje de animales que permanecen en la línea como gusanos paralizados. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores. Los animales de tipo salvaje tratados con ARNi unc-45 muestran un fenotipo de parálisis severa y pueden usarse como control positivo.
      NOTA: Este ensayo destaca a los animales que muestran parálisis media a severa. Tales animales generalmente se encuentran rectos en el plato, en lugar de presentar la forma curva común. Además, un parche limpio de bacterias es visible alrededor de las cabezas de los gusanos paralizados.
  6. Ensayo de golpiza
    1. Cultive animales sincronizados por la edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados con bacterias vacías de control de vectores alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.
    2. Pipete 100 μL de tampón M9 a la temperatura de cultivo de los animales en una placa de 96 pozos.
    3. Coloque ~ 15 gusanos, uno por pozo, en los pozos que contienen tampón M9.
    4. Deje que los animales se ajusten durante 5 min.
    5. Examine a cada animal bajo el estereomitroscopio, inicie un temporizador contando 15 s y cuente el número de curvas corporales que cada animal realiza en ese período de tiempo. Los valores contados se pueden normalizar a curvas corporales por minuto. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores.
      NOTA: Este ensayo de motilidad es muy sensible y puede detectar diferencias muy leves entre los tratamientos. Sin embargo, la motilidad en líquido y la motilidad en agar pueden diferir.

5. Validación del derribo de proteínas

  1. Coloque 250-300 huevos sincronizados en una placa NGM-RNAi de 60 mm secuesta con las bacterias relevantes que expresan dsRNA o que contienen vectores vacíos (L4440).
    NOTA: El derribo de ARNi podría resultar en una acumulación aberrante de embriones, en una falta de embriones o en una detención del desarrollo que podría afectar la expresión génica. Esto debe tenerse en cuenta al determinar la edad de los animales que se examinarán.
  2. Para adultos del día 1, cultive animales durante 4,5 días a 15 °C, 3 días a 20 °C o 2 días a 25 °C.
  3. Recoger y transferir un total de 200 animales adultos jóvenes a la tapa de un relleno de tubo de 1,5 ml con 200 μL de PBS-T.
    NOTA: Cuando se utilizan animales sensibles a la temperatura o mutantes chaperones, es mejor mantener los tampones utilizados en el protocolo a la temperatura de cultivo de los animales.
  4. Cierre la tapa con cuidado y centrífuga a 1.000 x g durante 1 min.
  5. Añadir 800 μL de PBS-T(Tabla 1)y centrifugar a 1.000 x g durante 1 min.
  6. Retire con cuidado los 900 μL superiores.
  7. Repita los pasos 5.4-5.6 tres veces.
  8. Retire 900 μL, dejando 100 μL de solución que contiene los 200 gusanos.
  9. Añadir 25 μL de búfer de muestra 5x (Tabla 1).
  10. Calentar las muestras durante 10 min a 92°C mientras agita a 1000 rpm. Las muestras pueden congelarse y conservarse a -20 °C.
  11. Cargue 20 μL de cada muestra y ejecute en un gel SDS-PAGE.
  12. Realizar análisis de western blot utilizando anticuerpos apropiados para determinar la estabilidad relativa de la proteína.
  13. Determine la intensidad de las bandas utilizando software densitométrico, como el módulo de gel ImageJ disponible gratuitamente. Normalice todos los valores a los medidos en la(s) muestra(s) de control.
    NOTA: El objetivo de la eliminación de ARNi en nuestras pantallas es reducir los niveles de proteína de una chaperona / co-chaperona específica. Por lo tanto, la mejor manera de evaluar la eficiencia del derribo de ARNi es mediante el análisis de western blot. Esto requiere anticuerpos específicos. Alternativamente, la qPCR se puede utilizar para cuantificar los niveles de ARNm.

Resultados

Uso de mutaciones sensibles a la temperatura en UNC-45 para detectar interacciones agravantes o de alivio en condiciones permisivas o restrictivas, respectivamente
El ensamblaje y mantenimiento muscular ofrece un sistema eficaz para estudiar las interacciones de chaperonas específicas del tejido. La unidad funcional de los músculos contráctiles, el sarcómero, presenta una disposición cristalina de proteínas estructurales y reguladoras. La estabilidad de la proteína motora miosina y su incorpora...

Discusión

Sigue faltando una imagen integrada de la red de proteostasis que refleje cómo está organizada y funciona en diferentes células y tejidos metazoarios. Para abordar esta deficiencia, se requiere información específica sobre las interacciones de varios componentes de esta red, como las chaperonas moleculares, en tejidos específicos durante el curso del desarrollo y el envejecimiento. Aquí, mostramos cómo el uso de perturbaciones específicas del tejido nos permitió examinar la red de chaperonas en un tejido dado. ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Centro de Genética Caenorhabditis, financiado por el Centro Nacional de Recursos de Investigación (NCRR) de los NIH, por algunas de las cepas de nematodos. Los anticuerpos monoclonales desarrollados por H.F. Epstein se obtuvieron del Developmental Studies Hybridoma Bank desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por el Departamento de Biología de la Universidad de Iowa. Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Fundación de Ciencias de Israel (subvención No. 278/18) y por una subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel, y el Ministerio de Relaciones Exteriores y Cooperación Internacional, Dirección General de Promoción del País, República Italiana (subvención No. 3-14337). Agradecemos a los miembros del laboratorio Ben-Zvi por su ayuda en la preparación de este manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well-platesSPLBA3D16B
40 mm platesGreiner Bio-one627160
60 mm platesGreiner Bio-one628102
6-well platesThermo Scientific140675
96 well 2 mL 128.0/85mmGreiner Bio-one780278
AgarFormediumAGA03
AmpicillinFormedium69-52-3
bromophenol blueSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
CameraQimagingq30548
CholesterolAmresco0433-250G
ConfocalLeicaDM5500
Filter (0.22 µm)SigmaSCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscopeLeicaMZ165FC
GlycerolFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibodyHybridoma Bank5-6
Na2HPO4·7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Plate pouring pumpIntegradoes it p920
RNAi Chaperone libraryNANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß-mercaptoethanolBio world41300000-1
stereomicroscopeLeicaMZ6
TetracyclineDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

Referencias

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