Aplicación de microdisección láser para descubrir transcriptómica regional en tejido renal humano

Resumen

Describimos un protocolo para la microdisección láser de subsegmentos del riñón humano, incluyendo el glomérulo, tubérculo proximal, extremidad ascendente gruesa, conducto coleccionista e intersticio. A continuación, el ARN se aísla de los compartimentos obtenidos y se lleva a cabo la secuenciación de ARN para determinar los cambios en la firma transcriptómica dentro de cada subsegmento.

Resumen

El análisis de la expresión génica del tejido renal humano es una herramienta importante para entender la homeostasis y la fisiopatología de la enfermedad. Se necesita aumentar la resolución y profundidad de esta tecnología y extenderla al nivel de las células dentro del tejido. Aunque el uso de secuenciación única de ARN nuclear y unicelular se ha generalizado, las firmas de expresión de las células obtenidas de la disociación tisular no mantienen el contexto espacial. La microdisección láser (LMD) basada en marcadores fluorescentes específicos permitiría el aislamiento de estructuras específicas y grupos celulares de interés con localización conocida, permitiendo así la adquisición de firmas transcriptómicas ancladas espacialmente en el tejido renal. Hemos optimizado una metodología LMD, guiada por una mancha rápida a base de fluorescencia, para aislar cinco compartimentos distintos dentro del riñón humano y llevar a cabo la posterior secuenciación de ARN de valiosas muestras de tejido renal humano. También presentamos parámetros de control de calidad para permitir la evaluación de la adecuación de los especímenes recogidos. El flujo de trabajo descrito en este manuscrito muestra la viabilidad de este enfoque para aislar firmas transcriptómicas sub-segmentales con alta confianza. El enfoque metodológico que se presenta aquí también puede aplicarse a otros tipos de tejidos con la sustitución de marcadores de anticuerpos relevantes.

Introducción

Los avances tecnológicos en el estudio de muestras de tejidos han mejorado la comprensión del estado de salud y enfermedades en varios órganos. Estos avances han puesto de relieve que la patología puede comenzar en regiones limitadas o en tipos celulares específicos, pero tienen implicaciones importantes en todo el órgano. Por lo tanto, en la era actual de la medicina personalizada, es importante entender la biología tanto a nivel celular como regional y no sólo a nivel mundial^1. Esto es particularmente cierto en el riñón, que se compone de varias células especializadas y estructuras que inician y/o responden diferencialmente al estrés patológico. La patogénesis de varios tipos de enfermedad renal humana todavía no se entiende bien. Generar una metodología para estudiar los cambios en la expresión génica en segmentos tubulares específicos, estructuras o áreas del interstitium en el riñón humano mejorará la capacidad de descubrir cambios específicos de la región que podrían informar sobre la patogénesis de la enfermedad.

Los especímenes de biopsia renal humana son un recurso limitado y precioso. Por lo tanto, las tecnologías que interrogan la transcriptómica en el tejido renal deben optimizarse para economizar el tejido. Los métodos disponibles para estudiar la transcriptómica a nivel celular y regional incluyen secuenciación de ARN de una sola célula (scRNaseq), RNaseq nuclear único (snRNaseq), hibridación espacial in situ y microdissección láser (LMD). Este último es adecuado para el aislamiento preciso de regiones o estructuras de interés dentro de las secciones de tejido, para secuenciación y análisis de ARN aguas abajo^2,3,4,5. La LMD se puede adoptar para basarse en la identificación de tipos o estructuras celulares específicas basadas en marcadores validados utilizando imágenes basadas en fluorescencia durante la disección.

Las características únicas de la transcriptómica regional asistida por microdisección láser incluyen: 1) la preservación del contexto espacial de las células y estructuras, que complementa las tecnologías unicelulares donde las células se identifican por expresión en lugar de histológicamente; 2) la tecnología informa y es informada por otras tecnologías de imágenes porque un marcador de anticuerpos define firmas de expresión; 3) la capacidad de identificar estructuras incluso cuando los marcadores cambian en la enfermedad; 4) detección de transcripciones poco expresadas en aproximadamente 20.000 genes; y 5) notable economía de tejidos. La tecnología es escalable a una biopsia renal con menos de 100 μm de espesor de un núcleo necesario para la adquisición suficiente de ARN y permite el uso de tejido congelado archivado, que comúnmente están disponibles en grandes repositorios o centros académicos^6.

En el trabajo subsiguiente, describimos la tecnología de transcriptómica regional y a granel en detalle, optimizada con un nuevo protocolo de tinción rápida de fluorescencia para su uso con tejido renal humano. Este enfoque mejora las exploraciones lmd clásicas porque proporciona datos de expresión independientes para los subsegmentos de interstitium y nefrón en lugar de la expresión tubulointersticial agregada. Se incluyen las medidas de control y garantía de calidad implementadas para garantizar el rigor y la reproducibilidad. El protocolo permite la visualización de células y regiones de interés, lo que resulta en la adquisición satisfactoria de ARN de estas áreas aisladas para permitir la secuenciación de ARN aguas abajo.

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Protocolo

El estudio fue aprobado para su uso por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Indiana.

NOTA: Utilice este protocolo con tejido de nefrectomía renal (hasta 2 cm en las dimensiones X e Y) conservado en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y almacenado a -80 °C. Realice todo el trabajo de una manera que limite la contaminación por ARN, use guantes desechables limpios y una máscara facial. Asegúrese de la limpieza de todas las superficies. El equipo para el que se optimizó este protocolo es un sistema de microdisección láser con láser UV pulsado.

1. Criosección

1. Exponer 1,2 μm LMD PPS-membrana (poli(sulfuro de fenileno) se desliza a la luz UV (en una campana de flujo laminar de cultivo de tejido) durante 30 minutos, inmediatamente antes de la criosección. Guarde las diapositivas a temperatura ambiente para una adherencia óptima del tejido.
2. Enfríe el criostato a -20 °C. Limpie las superficies de trabajo e instale una nueva hoja de corte.
3. Coloque una pequeña caja deslizante (limpiada con solución de descontaminación superficial RNase) dentro de la cámara criostato para almacenar diapositivas con tejido recién cortado.
4. Adhiera la muestra en OCT a un soporte de tejido y deje que se equilible durante unos minutos para alcanzar la temperatura de la cámara y fortalecer la adherencia entre el bloque OCT y el soporte. Ayudar al proceso mediante el uso de un extractor de calor.
5. Corte la muestra a un espesor de 12 μm y colótela en la diapositiva LMD especializada, utilizando el adaptador de diapositivas. Cada diapositiva contiene una sección de nefrectomía por diapositiva o hasta dos secciones de biopsia renal por diapositiva. Guarde las diapositivas a -80 °C con un cartucho desecante y dentro de una bolsa de plástico bien cerrada para evitar que el exceso de humedad se acumule dentro de la caja deslizante.
6. Etiquete cada diapositiva con un ID de muestra, fecha y número de diapositiva.
7. Utilice las diapositivas con muestras dentro de los 10 días a partir de la fecha inicial de criosección.

2. Microdisección láser

1. Inmediatamente antes de la tinción, prepare la Mezcla de Anticuerpos (Ab-Mix) en 10% BSA en RNase-free PBS añadiendo lo siguiente: 4 μL de FITC-Phalloidin, 1,5 μL de DAPI, 2 μL de anticuerpo tamm-horsfall protein (THP) conjugado directamente a Alexa Fluor 546, 3,3 μL de inhibidor de la anasa y 89,2 μL del 10% de BSA en PBS (para alcanzar un volumen de 100 μL).
   NOTA: Se pueden utilizar anticuerpos alternativos en lugar del anticuerpo THP. Por ejemplo, 2 μL de anticuerpo megalíndrico/LRP2, directamente conjugado a Alexa Fluor 568, se pueden utilizar para etiquetar el tubérculo proximal. El Ab-Mix contiene anticuerpo LRP2 o THP (para visualizar tubulos proximales o extremidades ascendentes gruesas, respectivamente). Otros anticuerpos pueden ser validados de acuerdo con las necesidades del usuario.
2. Lave el tobogán en frío helado (-20 °C) 100% acetona durante 1 min y muévalo a la cámara de humedad.
3. Lave la parte superior de la diapositiva con RNase-free PBS durante 30 s. Repita.
4. Lave la parte superior de la diapositiva con un 10% de BSA en RNase-free PBS durante 30 s. Repita.
5. Aplique ab-mix durante 5 minutos.
6. Lave la parte superior de la diapositiva con un 10% de BSA en RNase-free PBS durante 30 s. Repita.
7. Seque al aire el tobogán durante 5 minutos y cárguelo en la plataforma de corte por microdisección láser.
8. Instale los tubos de recogida (tubos de microcentrífuga autoclavados de 0,5 ml) adecuados para el trabajo de PCR, que contienen 50 μL de tampón de extracción del kit de aislamiento de ARN.
9. Proceda con LMD. Complete cada sesión LMD en un plazo máximo de 2 horas.
   1. Recoger imágenes de inmunofluorescencia pre y post-LMD, utilizando la cámara del microscopio para validar la disección para la variabilidad entre operadores, así como fines de archivo, formación y evaluación de calidad del protocolo realizado. Para obtener 0,5 – 1 ng de ARN, se requiere un mínimo de 500.000 μm² de área. Esto a menudo requiere el uso de hasta 8 secciones de hasta 8 x12 μm de espesor para obtener una cantidad suficiente de material para todos los subsegmentos de interés.
   2. Identifique las regiones de interés manchando, morfología y ubicación e incidarlas utilizando potencia láser superior a 40.
      NOTA: Estos son los criterios de disección. El tubérculo proximal se define mediante el etiquetado FITC-Phalloidin y LRP2. La extremidad ascendente gruesa se define mediante el etiquetado THP. El conducto de recogida se define por morfología nuclear (DAPI) y ausencia de otras manchas. El glomérculo se define por FITC-Phalloidin y morfología. El intersticio se define como el área entre tubulos manchados.
10. Obtenga una firma de expresión transversal masiva colocando dos secciones de 12 μm en una diapositiva LMD y diseccionando todas las secciones en el búfer de extracción.
11. Una vez finalizado el proceso LMD, cierre los tubos de microcentrífuga de recogida y deslícelo vigorosamente para asegurarse de que el contenido se moviera de la tapa a la parte inferior del tubo
12. Centrífuga los tubos a 3.000 x g durante 30 s.
13. Incubar los tubos en un baño de agua a 42 °C durante 30 min.
14. Centrífuga los tubos a 3.000 x g durante 2 minutos.
15. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 0,5 ml y guárdelo en -80 °C.

3. Aislamiento de ARN

NOTA: Para este protocolo de aislamiento de ARN, hemos adaptado un protocolo de un kit comercial de aislamiento de ARN. El protocolo del fabricante se ha modificado para cumplir con los requisitos de control de calidad establecidos para el proyecto.

1. Añadir 250 μL de amortiguador condicionado (CB) a cada columna de purificación de ARN (PC) e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2. Centrífuga todos los PC durante 1 min a 16.000 x g.
3. Agregue 50 μL de etanol al 70% (proporcionado en el Kit) en los tubos con muestras de tejido. Mezcle bien las muestras pipeteando hacia arriba y hacia abajo. No vórtice. No centrífugas.
4. Transferir la mezcla a PC acondicionados y centrífuga durante 2 minutos a 100 x g (para unir ARN), siga rápidamente con centrifugación durante 30 s a 16.000 x g (para eliminar el flujo a través). Repita este paso si hay más de 1 tubo con muestras de tejido disponibles para cualquier subsegmento dado.
5. Añadir 100 μL de wash buffer 1 (WB1) en los PC y centrífuga durante 1 minuto a 8.000 x g.
6. Preparar 40 μL de DNase por cada muestra (Añadir 5 μL de DNase a 35 μL de búfer RDD). A continuación, añadir 40 μL de la mezcla directamente en la membrana del PC e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
7. Añadir 40 μL de WB1 en la membrana de PC, y centrífuga para 15 s a 8.000 x g.
8. Añadir 100 μL de wash buffer 2 (WB2) en la membrana de PC, y centrífuga durante 1 min a 8.000 x g.
9. Añadir 100 μL de WB2 en la membrana de PC, centrífuga durante 2 min a 16.000 x g,seguido inmediatamente por centrifugación durante 1 min a 16.000 x g.
10. Transfiera el PC a un nuevo tubo de 0,5 ml.
11. Añadir 12 μL de Elution Buffer (EB) en la membrana e incubar durante 7 min a temperatura ambiente. Por lo tanto, el volumen final de todas las muestras de tejido diseccionado agrupadas es de 12 μL por subsegmento.
12. Centrífuga las muestras durante 1 min a 1.000 x g y luego durante 2 min a 16.000 x g.
13. Transfiera 2 μL a un tubo fresco para el análisis de Bioanalyzer (para prevenir eventos de congelación y descongelación).
14. Almacene todos los tubos a -80 °C hasta que estén listos para su posterior procesamiento.

4. Secuenciación de ARN

1. Evaluar cada muestra, destinada a la secuenciación, para la calidad utilizando un Bioanalyzer comercial y un chip dedicado a medir pequeñas cantidades de ARN.
2. Se requieren siguientes parámetros de control de calidad (QC) antes de la preparación y secuenciación de la biblioteca: Cantidad de ARN superior a 4 ng para granel y superior a 0,5 – 1 ng para cada subsegmento; El porcentaje de transcripciones superiores a 200 nucleótidos (DV200) debe ser superior al 25% para las muestras lmd (óptimo > 75%).
3. Lleve a cabo la preparación de la biblioteca con un kit comercial de preparación de la biblioteca cDNA destinado a pequeñas cantidades de ARN degradado. Para el kit comercial enumerado en el suplemento, sugerimos el uso de la opción 2, que requiere un DV200 mínimo del 25% y ninguna fragmentación. Algunas tecnologías de secuenciación pueden requerir umbrales mínimos de DV200 más altos, como 30%⁷.
4. Agregue adaptadores e índices cDNA.
5. Purifique las bibliotecas RNAseq utilizando tecnología de cuentas magnéticas.
6. Agote el cDNA ribosomal utilizando un kit comercial de eliminación de ARN antes del paso de amplificación de la biblioteca RNAseq.
7. Purifique la biblioteca RNAseq final utilizando tecnología de cuentas magnéticas a una concentración de biblioteca cDNA de 2 ng/μL.
8. Lleve a cabo la secuenciación de ARN de 75 bp de extremo emparejado en un sistema de secuenciación comercial con 30 millones de lecturas/muestra para granel y 100 millones de lecturas/muestra para secciones subsegcionales.
9. Utilice un ARN de referencia (25 μg) con cada ejecución de secuenciación para permitir el control del efecto de lote. La concentración inicial de nuestro ARN de referencia es de 1 μg/μL, mientras que la concentración final utilizada en la secuenciación es de 25 ng/μL.
10. Realizar análisis de datos utilizando la aplicación FastQC para evaluar la calidad de las lecturas secuenciatorias, intergénicas y mitocondriales y para determinar las lecturas atribuidas a un gen.
11. Utilice el Visor de genómica integrativa (IGV) para la alineación y edgeR/rbamtools para las medidas de expresión de transcripción.
12. Retire muestras con menos de 100.000 lecturas. Quantile normaliza las lecturas sin procesar en el conjunto de datos después de filtrar genes expresados humildemente en un umbral definido por el usuario.
13. Cuantifique la expresión como una relación del subsegmento de interés con respecto al promedio de todos los demás subsegmentos y log2-transform. La expresión relativa del mismo gen puede compararse entre subsegmentos y muestras; sin embargo, no es ideal comparar la expresión relativa entre dos genes diferentes debido a posibles diferencias en la degradación entre los genes y las especies de ARN.
14. Realice un análisis de enriquecimiento para comparar la expresión génica de un conjunto de fabricantes específicos de cada subsegmento de nefrón, mientras que las muestras de ARN de referencia se comparan entre lotes. Un efecto de lote dentro de 1 desviación estándar de expresión media con valor R > 0.9 se considera aceptable. Se requiere una normalización adicional para una puntuación de efecto por lotes más alta. Cualquier ejecución que se desvíe del efecto de lote aceptado se puede marcar. El Q30 debe ser mayor que >90% para cada ejecución de secuenciación.

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Resultados

Muestras

Presentamos datos de nueve nefrectomías de referencia (3 muestras obtenidas en la Universidad de Indiana y 6 muestras obtenidas a través de Kidney Precision Medicine Project), utilizando el protocolo de tinción rápida de fluorescencia para aislar segmentos de nefrones renales y áreas intersticiales. Las secciones utilizadas en este proceso se obtuvieron de donantes renales fallecidos o nefrectomías tumorales no afectadas. Estas muestras no tenían evidencia pato...

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Discusión

La transcriptómica basada en LMD es una tecnología útil que ancla la expresión génica a áreas específicas dentro del tejido. La base de esta tecnología y su aplicación potencial en el riñón se ha descrito anteriormente⁸. Sin embargo, la optimización, modernización y racionalización de la disección basada en la fluorescencia específicamente dirigida a la disección de alta precisión para la secuenciación de ARN aguas abajo es menos omnipresente. Debido a que esta metodología est?...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
AMPure Beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
Desiccant Cartridge	Bel-Art	F42046-0000
DNAse	Qiagen	79254	RDD buffer is included in the pakage
Laser Microdissection Microscope	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 Antibody	Abcam	ab76969	Directly conjugated to Alexa Fluor 568
Microcentrifuge tubes	ThermoFisher	AB-0350
Microscope camera	Leica	DFC700T
PBS (RNAse Free)	VWR	K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT0204
PPS-membrane slides	Leica	11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µg	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNAse Inhibitor	ThermoFisher	AM2696
Sequencer (HiSeq or NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech	634411
Tamm-Horsfall Protein Antibody	R&D Systems	AF5144	Directly conjugated to Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583