Retraso en la administración intramiocardio de células madre después de la lesión por reperfusión de isquemia en un modelo murino

Resumen

Células madre se investigan continuamente como tratamientos potenciales para individuos con daño miocárdico, sin embargo, su disminución de la viabilidad y retención dentro del tejido lesionado puede afectar su eficacia a largo plazo. En este manuscrito describimos un método alternativo para la entrega de células madre en un modelo murino de lesión por reperfusión de isquemia.

Resumen

Existe un interés significativo en el uso de células madre (SCs) para la recuperación de la función cardíaca en individuos con lesiones miocárdicas. Más comúnmente, la terapia con células madre cardíacas se estudia mediante la administración de SCs simultáneamente con la inducción de la lesión miocárdica. Sin embargo, este enfoque presenta dos limitaciones significativas: el entorno isquémico proinflamatorio temprano puede afectar la supervivencia de las CC trasplantadas, y no representa el escenario de infarto subagudo donde es probable que se utilicen los CC. Aquí describimos una serie de procedimientos quirúrgicos de dos partes para la inducción de la lesión de isquemia-reperfusión y la administración de células madre mesenquimales (MSC). Este método de administración de células madre puede permitir la viabilidad más larga y la retención alrededor del tejido dañado al eludir la respuesta inmunitaria inicial. Un modelo de lesión por reperfusión de isquemia fue inducido en ratones acompañado de la administración de células madre mesenquimales (3,0 x 10⁵), expresando establemente el gen reportero de la luciérnqueasa luciferasa bajo el promotor de CMV expresado constitutivamente, intramiicciardialmente 7 días después. Los animales fueron objeto de imágenes por ultrasonido e imágenes bioluminiscentes para la confirmación de lesiones e inyección de células, respectivamente. Es importante destacar que no hubo una tasa de complicaciones adicional al realizar este enfoque de dos procedimientos para la entrega de SC. Este método de administración de células madre, colectivamente con la utilización de genes reporteros de última generación, puede permitir el estudio in vivo de viabilidad y retención de CC trasplantados en una situación de isquemia crónica comúnmente vista clínicamente, al tiempo que se elude la respuesta proinflamatoria inicial. En resumen, establecimos un protocolo para la entrega retardada de células madre en el miocardio, que puede ser utilizado como un nuevo enfoque potencial en la promoción de la regeneración del tejido dañado.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la causa más común de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Se ha encontrado que los eventos isquémicos cardíacos son perjudiciales para la función general del miocardio y las células circundantes^1. Sólo ̴0,45-1,0% de los cardiomiocitos se regenerarán cada año después de que se produzca daño miocárdico². A pesar de la creciente demanda y el enfoque inherente en el desarrollo de tratamientos, las terapias que ayudan en la regeneración del tejido lesionado han sido difíciles de establecer y todavía requieren una mayor optimización^3,,4,,5. Terapias de células madre se han introducido como un camino alternativo para rejuvenecer el tejido dañado después de un evento isquémico; sin embargo, el avance de estas terapias ha sido desafiado por la limitada supervivencia y retención de las células a una zona lesionada^6.

El microambiente del corazón después de un evento isquémico se puede caracterizar como hipoxico, pro-oxidante y proinflamatorio, presentando condiciones hostiles para que las células madre terapéuticas se adapten a la supervivencia^7,,8. Como respuesta inmunitaria se desencadena después de una lesión, linfocitos ingenuos, macrófagos, neutrófilos y células del mástil intentan reparar el daño mediante la eliminación de las células moribundas y la modulación del proceso de remodelación de tejidos^9,,10,,11. Dentro de los primeros 3 días post-isquemia, la inflamación está en su apogeo con la liberación de citoquinas proinflamatorias con un alto número de neutrófilos y monocitos en la zona^10,,12. Después de 7 días, gran parte de la inflamación ha disminuido y comienza la transición a células reparadoras, continuando hasta que se complete la cascada de remodelación, aproximadamente 14 días en ratones^13. Nuestro método quirúrgico es un enfoque alternativo potencial a la introducción de productos biológicos en el miocardio para evitar la respuesta inmune innata pico después de la lesión por reperfusión de isquemia. Al mismo tiempo, permitirá el estudio de cualquier tratamiento en una condición de isquemia subaguda/crónica donde puede haber diferentes variables a considerar en comparación con el infarto agudo de miocardio.

Protocolo

Los experimentos se realizaron en ratones hembra C57BL/6, edad 10-12 semanas y 20-25 g de peso corporal. Todos los procedimientos con animales cumplieron con las normas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto de Recursos Animales de Laboratorio, Academia Nacional de Ciencias, Bethesda, MD, EE. UU.) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales Institucionales (IACUC) de mayo Clinic College of Medicine.

1. Preparación e intubación

1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía. Si se van a realizar varias cirugías en una sesión, limpie los instrumentos después de cada animal y vuelva a esterilizar con un esterilizador de perlas calientes.
2. Anestesar a los ratones con 3.5-4% de isoflurano a 1 L/min O₂ en una cámara de inducción.
3. Administrar Buprenorfina SR 1 mg/kg (analgésico) por vía subcutánea, pesar el animal e introducir el peso en el respirador.
4. Afeitar el lado izquierdo del pecho desde el esternón hasta el nivel del hombro y aplicar crema depilatoria para eliminar el exceso de piel.
5. Para el procedimiento de reperfusión de isquemia mantener la presión final positiva (PEEP) en el respirador a 2 cmH₂O. Para la inyección retardada de células procedimiento cambiar la PEEP a 3 cmH₂O para evitar el colapso pulmonar.
6. Intubar al animal utilizando un tubo endotraqueal de 20 G, transferir a una almohadilla de calentamiento controlada para mantener una temperatura corporal de 35-37 oC.
7. Coloque el ratón sobre un respirador en recumbencia lateral con extremo craneal a la izquierda y extremo caudal a la derecha.
8. Mantener la anestesia en 2-2.5% isoflurano a 1 L/min O₂ durante el resto del procedimiento.
9. Frote el área quirúrgica alternando entre povidona-yodo y hisopos de alcohol tres veces y aplique pomada oftálmica en ambos ojos.

2. Lesión por reperfusión de isquemia

1. Usando un bisturí de hoja #10 hacer una incisión vertical de 2,5 mm a la derecha del pezón más a la izquierda en el campo de visión.
2. Usando tijeras cortadas a través de las capas musculares superficiales hasta que los músculos intercostales y las costillas son visibles.
3. Mientras levanta las costillas y el tejido circundante, corte el espacio intercostal entre las costillas 4a y 5a, luego inserte el retractor del párpado en el espacio abierto.
4. Retirar el pericardio usando fórceps curvos, moviendo el pulmón hacia arriba y fuera de la vista.
5. Visualice la arteria LAD y, usando una sutura de nylon 9-0, pase a través del miocardio debajo de la arteria 2.5 mm distal a la aurícula izquierda y ate un nudo cuadrado suelto.
6. Corte 1 cm de tubo de polietileno y colóquelo dentro del nudo suelto.
7. Asegure la sutura alrededor del tubo, confirme la isquemia y luego suéltela después de 35 minutos.
   NOTA: Confirme la isquemia por palidez y arritmia ventricular.
8. Después de liberar la ligadura y retirar el tubo, espere 5 minutos para confirmar la reperfusión del miocardio.
9. Coloque un tubo de catéter I.V. de 24 G en la cavidad torácica un espacio intercostal a la derecha de la abertura.
10. Cierre la incisión intercostal con una sutura absorbible 6-0 en un patrón interrumpido simple.
11. Cierre la capa muscular con una sutura absorbible 6-0 en un patrón de sutura continua.
12. Después de cerrar la capa muscular superficial, retire el tubo torácico mientras retira el aire de la cavidad torácica con una jeringa de tuberculina de 1 ml.
13. Cierre la incisión de la piel con una sutura absorbible 6-0 en un patrón de colchón horizontal continuo
    NOTA: Las suturas de nylon y un patrón de sutura discontinua también se pueden utilizar para la capa de la piel.
14. Administrar 1,5 ml de solución salina caliente por vía subcutánea y aplicar un pomada de triple antibiótico en el lugar de la incisión para prevenir la infección.
15. Apague el isoflurano y deje que el animal respire a través del respirador al 100% O₂ hasta que pueda respirar continuamente sin ayuda.
16. Transfiera el ratón a una jaula sin ropa de cama o a una jaula con ropa de cama cubierta (toalla de papel o cortina) en una almohadilla caliente con una temperatura de 35-37 oC hasta que esté completamente recuperado.

3. Entrega de células madre mesenquimales de ratón

NOTA: La cepa de ratones utilizada para el procedimiento es una línea endogáctica y se considera genéticamente idéntica. Las células madre mesenquimales se obtuvieron de animales de la misma cepa y, mediante el diseño protocoltivo, no se indujo inmunosupresión¹.

1. Complete los pasos de preparación e intubación como se hizo anteriormente para el primer procedimiento.
2. Retire la sutura de la capa de la piel con tijeras y fórceps.
3. Con un #10 bisturí, haga una incisión en el mismo lugar que la cirugía anterior.
4. Continúe usando el bisturí para cortar el tejido cicatricial hasta que la sutura de la capa muscular sea visible
5. Usando las tijeras y fórceps quitar la sutura y cortar la capa muscular abierta.
6. Visualizar y quitar las suturas que sostienen las costillas juntas y continuar cortando a través del músculo intercostal de la incisión anterior.
   NOTA: Los pulmones pueden haberse adherido a la pared torácica, si esto ocurre, utilice fórceps contundentes o curvos para separarlos cuidadosamente y liberarlos.
7. Coloque el retractor del párpado en el espacio intercostal y localice el área de la ligadura anterior.
8. Cargar las células madre mesenquimales (3,0 x 10⁵), suspendidas en 20 l de PBS, en una jeringa de insulina de 30 G, doblar la aguja ligeramente según sea necesario para que el ángulo adecuado se inyecte.
   NOTA: Las células madre mesenquimales (MSC) se aislaron del tejido adiposo de ratones C56BL/6 de 4-6 semanas de edad. Las células de paso temprano (p3) fueron transducidas con un vector que expresaba el gen de la luciosa de la luciérnnea bajo el promotor del CMV para permitir el monitoreo de la viabilidad de las células in vivo. El ratón derivado de adipose MSC se caracterizó por la citometría de flujo y las células fueron positivas para CD44, CD29, CD90 y CD105, pero negativas para el marcador hematopoyético CD45¹⁴. Antes de la inyección, los MSC se cultivaron durante al menos un pasaje para evitar la pérdida de células del proceso de descongelación.
9. En la dirección desde el ápice hacia la base del corazón inserte la jeringa en la región del peri-infarto hasta que la abertura de la aguja esté completamente dentro del miocardio.
10. Una vez dentro, inyecte lentamente las células en el miocardio, espere 3 s y, a continuación, retire la aguja.
11. Observe el corazón de cerca durante 3 minutos para asegurarse de que no hay reacciones anormales a las células como la fibrilación ventricular.
12. Coloque un tubo de catéter de 24 G IV en la cavidad torácica un espacio intercostal a la derecha de la abertura.
13. Cierre las capas intercostal, muscular y de la piel y retire el tubo torácico en el mismo método que el primer procedimiento.
14. Administrar 1,5 ml de solución salina caliente por vía subcutánea y aplicar un pomada de triple antibiótico en el lugar de la incisión para prevenir la infección.
15. Apague el isoflurano y deje que el animal respire a través del respirador al 100% O₂ hasta que pueda respirar continuamente sin ayuda.
16. Transfiera el ratón a una jaula sin ropa de cama o a una jaula con ropa de cama cubierta (toalla de papel o cortina) en una almohadilla caliente con una temperatura de 35-37 oC hasta que esté completamente recuperado.

4. Atención postoperatoria siguiendo ambos procedimientos

1. Observar al animal continuamente hasta que se establezca respiración espontánea, recumbencia esternal y movimiento normal.
2. Continuar la observación cada 15-30 min durante al menos 3 h el día de la cirugía.
3. Revise a los ratones en busca de dehiscencia de la herida o dolor anormal una vez al día durante 5 días, luego 2-3 veces por semana.
4. Si el animal muestra signos de dolor (es decir, espalda arqueada, movimiento mínimo, muecas o pelaje desaliñado) después de 72 h después de 72 h después de la postoperatoria, proporcione una dosis adicional del analgésico Buprenorfina SR.

Resultados

La lesión por reperfusión de isquemia se indujo en ratones el día 0, seguida de un ecocardiograma postoperatorio y un electrocardiograma el día anterior a la implantación de células madre. El análisis de ultrasonido y electrocardiograma confirmó el infarto y disminuyó la función contráctil ventricular(Figura 1A-D). Un examen adicional de los datos mostró que la fracción de eyección y el acortamiento fraccionado disminuyeron en ratones que recibieron lesiones is...

Discusión

Más de 85 millones de personas en todo el mundo están afectadas por enfermedades cardiovasculares³. La alta prevalencia de estos eventos isquémicos garantiza un mayor desarrollo y expansión de terapias alternativas para promover la regeneración del tejido dañado. Los métodos tradicionales utilizan el procedimiento de reperfusión de isquemia en un entorno agudo con posterior administración de las terapias^1. Las reacciones inflamatorias están en su apogeo entre 3-4 ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl Irrigation, USP	Baxter	0338-0048-04
11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable	SAI Infusion Technologies	PSS-SD
24G 3/4" IV catheter tube	Jelco	4053
28G x 1/2" 1mL allergy syringe	BD	305500	Injection of analgesic
30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe	Ulticare	08222.0933.56	Injection of stem cells
6-0 S-29, 12" Vicryl suture	Ethicon	J556G	Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure
9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture	Ethicon	2829G	Ligation of the LAD artery
Absorbent underpad	Thermo Fischer Scientific	14-206-64	For underneath the animal
Alcohol prep pads, 2 ply, medium	Coviden	6818
Anti-fog face mask	Halyard	49235
Bonn Strabismus scissors, curved, blunt	Fine Science Tools	14085-09
Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity).
Castroviejo needle holders, curved	Fine Science Tools	12061-01
Curity sterile gauze sponges	Coviden	397310
Delicate suture tying forceps, 45 angle bent	Fine Science Tools	11063-07
Electric Razor	Wahl		Fur removal
Isoflurane 100 ml	Cardinal Health	PI23238	Anesthetic
Lab coat
Monoject 1 mL hypodermic syringe	Coviden	8881501400
Moria iris forceps, curved, serrated (x2)	Fine Science Tools	11370-31
Moria speculum retractor	Fine Science Tools	17370-53
Mouse endotracheal intubation kit	Kent Scientific
Nair depilatory cream	Johnson & Johnson		Fur removal
Optixcare eye lube plus	Aventix		Sterile ocular lubricant
Physiosuite ventilator	Kent Scientific
PolyE Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	72-0191	Temporary compression of LAD artery
Povidone-iodine swabs	PDI	S41125
Scalpel, 10-blade	Bard-Parker	371610
Sterile 3" cotton tipped applicators	Cardinal Health	C15055-003
Sterile 6" tapered cotton tip applicators	Puritan	25-826-5WC
Sterile gloves	Cardinal Health	N8830
Sterilization pouches	Medline	MPP100525GS
Surgery cap
Surgical Microscope	Leica	M125
Suture tying forceps, straight (x2)	Fine Science Tools	10825-10
Transpore surgical tape	3M	1527-1
Triple antibiotic ointment	G&W Laboratories	11-2683ILNC2	Topical application to prevent infection
Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved	Fine Science Tools	15004-08
Vetflo vaporizer	Kent Scientific