Aislamiento de células CD8 + T residentes en el riñón delratón para el análisis de citometría de flujo

Resumen

Después de la infección viral, el riñón alberga un número relativamente grande de células CD8⁺ T y ofrece la oportunidad de estudiar las células T_RM no mucosas. Aquí, describimos un protocolo para aislar linfocitos renales de ratón para el análisis de citometría de flujo.

Resumen

La célula T de memoria residente en el tejido (T_RM)es un campo de investigación inmunológica en rápida expansión. Aislar las células T de varios tejidos no linfoides es uno de los pasos clave para investigar T_RM. Hay ligeras variaciones en los protocolos de aislamiento de linfocitos para diferentes órganos. El riñón es un órgano no linfoide esencial con numerosas infiltraciones de células inmunitarias, especialmente después de la exposición al patógeno o la activación autoinmune. En los últimos años, múltiples laboratorios incluyendo el nuestro han comenzado a caracterizar células CD8⁺ T residentes en riñón en varios entornos fisiológicos y patológicos tanto en ratones como en humanos. Debido a la abundancia de linfocitos T, el riñón representa un órgano modelo atractivo para estudiar T_RMen tejidos no-mucosas o no barreras. Aquí, describiremos un protocolo comúnmente utilizado en laboratorios centrados en T_RMpara aislar células CD8⁺ T de los riñones del ratón después de una infección viral sistémica. Brevemente, utilizando un modelo de infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica aguda (LCMV) en ratones C57BL/6, demostramos el etiquetado intravascular de células CD8⁺ T, la digestión enzimática y la centrifugación de gradiente de densidad para aislar y enriquecer linfocitos de los riñones de ratón para hacer muestras listas para el análisis posterior de citometría de flujo.

Introducción

Los células T de memoria residente en tejidos (T_RM)representan una de las poblaciones de células T más abundantes en ratones humanos e infectados adultos. Las células T_RM proporcionan la primera línea de defensa inmune y están implicadas críticamente en diversos procesos fisiológicos y patológicos^1,2,3,4,5. En comparación con las células T circulantes, las células T_RM llevan marcadores de superficie distintos con programas de transcripción únicos^6,7,8. Ampliar nuestro conocimiento de la biología T_RM es la clave para entender las respuestas de los células T, que es esencial para el desarrollo futuro de vacunas basadas en células T e inmunoterapias.

Además de los marcadores moleculares comúnmente compartidos de T_RMen todos los tejidos no linfoides, la acumulación de evidencia sugiere que las características específicas del tejido son un componente central de la biología T_RM ⁹. El riñón alberga muchas células inmunitarias, incluidas las células T_RM después de la infección, y ofrece una gran oportunidad para estudiar la biología de las células T_RM en un tejido no mucoso. La infección por LCMV aguda (virus de la coriomeningitis linfocítica) a través de la vía intraperitoneal es un modelo de infección sistémica bien establecido para estudiar las respuestas de células T específicas del antígeno en ratones. La infección generalmente se resuelve en 7-10 días en ratones de tipo salvaje y dejar un gran número de células T de memoria específicas de LCMV en una variedad de tejidos, incluyendo el riñón¹⁰. Los ratones transgénicos P14 TCR (receptor de células T) llevan células CD8⁺ T que reconocen uno de los epítopos inmuno-dominantes de LCMV presentado por MHC-I (complejo de histocompatibilidad mayor clase I) molécula H2-D^b en ratones C57BL/6. Se realiza un seguimiento de la combinación de la transferencia adoptiva de células T P14 marcadas congenicalmente e infección por LCMV en ratones, efector CD8⁺ y células T de memoria, incluyendo la diferenciación T_RM y homeostasis.

En algunos tejidos de barrera, como los linfocitos intraepiteliales intestinales (IEL) compartimento y las glándulas salivales, el procedimiento de aislamiento de linfocitos establecido produce un alto porcentaje de células T_RM con contaminación mínima de los linfocitos T de carga sanguínea en el lcMV de ratón modelo¹¹. Sin embargo, en los tejidos no barrera, como el riñón, la red vascular densa contiene un gran número de células CD8⁺ T circulantes. Se ha documentado bien que incluso la perfusión exitosa no puede eliminar eficientemente todas las células CD8⁺ T circulantes. Para superar este obstáculo técnico, la tinción de anticuerpos intravasculares se ha establecido como una de las técnicas más utilizadas en los laboratorios T_RM ¹². En resumen, 3-5 minutos antes de la eutanasia, 3 g/ratón anticuerpo anti-CD8 (para etiquetar CD8⁺ células T) se administra por vía intravenosa. La pared intacta de los vasos sanguíneos evita la rápida difusión del anticuerpo en este corto período de tiempo (es decir, 3-5 minutos) y solo se etiquetan las células intravasculares. Siguiendo el protocolo de aislamiento de linfocitos estándar, las células intravasculares versus extravasculares se pueden distinguir fácilmente mediante citometría de flujo.

Aquí, describiremos un protocolo estándar comúnmente utilizado en los laboratorios T_RM para realizar el etiquetado intravascular, el aislamiento de linfocitos y el análisis de citometría de flujo de células renales CD8⁺ T utilizando un ratón C57BL/6 que ha recibido células CD45.1⁺ P14 T e infección de LCMV 30 días antes^{de 13}. El mismo protocolo se puede utilizar para estudiar las células T de efector y memoria en el riñón.

Protocolo

Todos los experimentos con animales realizados siguiendo este protocolo deben ser aprobados por el respectivo Comité institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC). Todos los procedimientos descritos aquí han sido aprobados por IACUC UT Health San Antonio.

1. Transferencia adoptiva de células T P14 a receptores C57BL/6 e infección por LCMV

1. Utilice ratones P14 a las 6-12 semanas de edad. Asegúrese de que el sexo del ratón transgénico TCR P14 de donante debe coincidir con el sexo de los ratones receptores C57BL/6. De lo contrario, las células como las células T masculinas que se transfieren a ratones hembra darán lugar a un rechazo inmune mediado de las células T del donante circulante en alrededor de 12 días¹⁴.
2. Purify ingenua cd8⁺ T células del bazo y los ganglios linfáticos de un ratón transgénico P14 TCR utilizando el kit de purificación de células CD8⁺ T de ratón siguiendo el protocolo del fabricante.
   1. Brevemente, disecciona el bazo y los ganglios linfáticos, machaque las muestras para generar la suspensión de una sola célula.
   2. Para enriquecer las células T ingenuas, añada el anticuerpo biotina-anti-CD44 durante el primer paso^{13 de}incubación de anticuerpos.
      NOTA: El kit comercial de selección negativa utilizado en este paso contiene dos componentes principales para dos etapas de incubación (es decir, incubación de mezcla de biotina-anticuerpos e incubación de perlas estreptavidina-magnéticas).
3. Utilice un hemocitociómetro para contar las células e inyectar de 1.000 a 10.000 células T purificadas de P14 en 200 l de PBS en cada receptor C57BL/6 coincidente con el sexo a través de la vena de cola.
   NOTA: El protocolo detallado de inyección de venas de cola se describe en el paso 2.
4. Al día siguiente, todos los receptores C57BL/6 reciben 2 x 10⁵ pfu LCMV Armstrong diluidos en 200 l de PBS a través de una ruta intraperitoneal.

2. Etiquetado intravascular de células CD8⁺ T

NOTA: Dependiendo de los intereses de investigación, diferentes puntos de tiempo se pueden elegir después de la infección. Se muestra un ejemplo del día 30 después de la infección (día 30 después del paso 1.4), que a menudo se considera como un punto de tiempo de memoria temprana para la respuesta de células T CD8.

1. Diluir el anticuerpo anti-CD8 de biotina a 15 g/ml en PBS. Asegúrese de que cada ratón reciba 200 l de PBS que contengan un anticuerpo de 3 g.
   NOTA: El anticuerpo anti-CD8 de biotina se utiliza aquí para que sea más flexible diseñar el panel de tinción FACS final. El anticuerpo con etiqueta de colorante fluorescente se puede utilizar directamente. Sin embargo, es importante utilizar diferentes clones de anticuerpos monoclonales para el etiquetado intravenoso frente a la tinción FACS.
2. Caliente correctamente la vena de la cola de los ratones con una lámpara de calor aérea durante 5-10 minutos para dilatar las venas.
   NOTA: Se debe tener especial cuidado para evitar el sobrecalentamiento de los animales. Reduzca el calor o retire la lámpara de calor si los ratones se detuvieron para moverse.
3. Dibuje 200 l de mezcla de anticuerpos anti-CD8 prediluz en una jeringa de insulina de 100 U (28G) y elimine cualquier burbuja de aire moviendo el pistón hacia arriba y hacia abajo. Doblar la aguja para crear un ángulo de 150o entre la aguja y la jeringa, biselado, para que la aguja sea paralela a la vena.
4. Restringir el ratón con un limitador de roedores de tamaño adecuado y rociar la cola con 70% de etanol para hacer la vena claramente visible.
   NOTA: La duración de la restricción debe mantenerse al mínimo.
5. Sostenga la cola en el extremo distal con el pulgar y los dedos medios de la mano no dominante. Coloque el dedo índice debajo del sitio donde se insertará la aguja.
6. Sujete la jeringa con la mano dominante e inserte la aguja en la vena en paralelo hacia la dirección del corazón.
   NOTA: Cuando se coloca correctamente, la aguja debe moverse suavemente en la vena.
7. Inyecte lentamente 200 ml de anticuerpo anti-CD8 a través de la vena de la cola.
   NOTA: Si hay una resistencia o se ve un área blanca por encima de la aguja en la cola, la aguja no está dentro de la vena. Inicie la inyección inicial cerca de la punta de la cola. Cuando sea necesario, avance hacia la parte inferior de la cola para las inyecciones posteriores.
8. Retire la aguja y aplique suavemente la compresión hasta que se detenga el sangrado.
9. Devuelva el ratón a la jaula y eutanasia el ratón después de 3-5 min.
   NOTA: Los ratones deben ser eutanasiados a través de la cámara de isoflurano seguida de luxación cervical. Otros métodos, como la inhalación de_CO2, tardarán hasta 5 minutos y pueden introducir variaciones innecesarias del tiempo de etiquetado de anticuerpos intravenosos.
10. Diseccione el riñón con tijeras, transfiera todo el riñón a 1,5 ml de tubos de microcentrífuga y deje las muestras sobre hielo hasta su posterior procesamiento.
    NOTA: El riñón entero intacto se puede almacenar de forma segura en hielo durante unas horas antes del procesamiento y la digestión posteriores.

3. Digestión enzimática del riñón

1. Preparar 6 placas de pozo que contengan 3 ml de la solución de digestión (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Collagenase B) para cada ratón, conservar en hielo.
   NOTA: La solución de colagenasa B en stock a mayor concentración (p. ej., 20x) se puede preparar y almacenar a -20 oC o por debajo de ella. La solución de trabajo debe prepararse fresca. Consulte la Tabla 1 para conocer las recetas de todas las soluciones/buffers utilizadas en el protocolo actual.
2. Añadir 300 l de solución de digestión en los tubos de muestra de microcentrífuga de 1,5 ml y picar las muestras de riñón con una tijera de resorte recta.
   NOTA: El tejido renal debe picarse en trozos pares con tamaños no superiores a 1,5 mm de diámetro. No se requiere ningún paso de decapsulación.
3. Transfiera las muestras de riñón picadas a 6 placas de pozo que contengan la solución de digestión
   NOTA: 6 placas de pozo se utilizan para mayor comodidad sólo cuando hay varias muestras para ser procesados.
4. Incubar las muestras a 37oC con un suave balanceo (alrededor de 60 rpm) durante 45 min.
5. Después de la digestión, machaque el tejido con la brida del émbolo de una jeringa de 3 ml directamente dentro del plato, y transfiera a tubos cónicos de 15 ml.
   NOTA: Por lo general, la filtración a través de un colador celular no es necesaria en este paso porque la centrifugación de gradiente de densidad se realiza junto a purificar linfocitos vivos.
6. Gire hacia abajo las muestras a 500 x g durante 5 min a 4 oC.
7. Resuspender el pellet en 3 ml de RPMI/10% FCS.

4. Centrifugación de gradiente de densidad para enriquecer linfocitos del riñón digerido

1. Gire hacia abajo la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 oC.
2. Retire el sobrenadante y resuspendir el pellet celular con 5 ml de 44% mezcla de Percoll/RPMI (44% Percoll + 56% RPMI sin FBS).
3. Coloque la punta de una pipeta de 3 ml que contenga 3 ml de 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) directamente en la parte inferior de cada tubo, y libere lentamente la solución para que la solución pesada (67% Percoll/PBS) forme una capa distinta en la parte inferior y la solución ligera (44% Percoll/RPMI) se eliente. Juntos, se formarán capas de cóctel.
   NOTA: Para el medio de gradiente de densidad recién llegado del proveedor, agregue 1/10 volumen de PBS estéril 10x a la botella, mezcle bien y considere el medio de gradiente de densidad equilibrado PBS como solución 100%.
4. Gire las muestras a 900 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente con ajuste reducido del acelerador y del freno.
   NOTA: Para centrífugas con ajustes de acelerador y freno (en una escala 1-9 (1 significa mínimo y 9 significa máximo)), utilice 6 para el acelerador y 4 para el freno.
5. Retire con cuidado los tubos de la centrífuga sin alterar las capas;
   NOTA: Se identifica una capa clara de linfocitos entre la capa RPMI de color rosa y la capa DE PBS incolora.
6. Retire la capa superior con una pipeta de transferencia sin tocar la capa de linfocitos.
7. Transfiera la capa de linfocitos a un nuevo tubo de 15 ml, llene el tubo con PBS/5% FCS y mezcle invirtiendo el tubo 4-6 veces lentamente para asegurar una mezcla suficiente.
   NOTA: Este paso es importante para lavar cualquier Percoll residual.
8. Gire hacia abajo las muestras a 500 x g durante 5 min a 4 oC.
9. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 500 l de medio RPMI completo. Las células están listas para la tinción de citometría de flujo.

5. Tinción y análisis de citometría de flujo

NOTA: Siga el protocolo de tinción de citometría de flujo estándar para linfocitos T.

1. Tome alrededor de 1 x 10⁶ celdas por cada tinción FACS.
   NOTA: Utilice una placa de 96 pozos U-bottom para la tinción FACS. Sin embargo, si sólo hay un número limitado de muestras involucradas, también se pueden utilizar tubos FACS de 5 ml.
2. Gire hacia abajo las células a 500 x g durante 5 min a 4 oC. Deseche el sobrenadante.
3. Resuspender cada muestra en 50 ml de tampón FACS que contenga 10 g/ml de bloqueador FcR 2.4G2 (un anticuerpo monoclonal anti-CD16/32 para bloquear la interacción entre el anticuerpo FACS añadido con FcR). Incubar sobre hielo durante 15 min.
4. Sin más centrifugación, añada 50 ml de mezcla de anticuerpos de tinción superficial para cada muestra de modo que el volumen final de tinción sea de 100 l/cada muestra. Incubar sobre hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
   NOTA: Incluya estreptavidina con etiqueta fluorescente (2 g/ml o siga la recomendación del fabricante) en la mezcla de anticuerpos para etiquetar las células CD8⁺ INtravasculares CD8⁺ T y utilizar anticuerpos anti-CD8 de etiqueta fluorescente para etiquetar todas las células T CD8. La mezcla de anticuerpos se hace añadiendo las cantidades deseadas de anticuerpos interesados en el tampón FACS.
5. Lave las muestras con PBS dos veces. Para cada lavado, llene los pozos de 96 pozos con PBS frío, gire a 500 x g durante 5 min a 4 oC y deseche el sobrenadante.
6. Resuspender las células en 100 l/pozo de colorante vivo/muerte diluido. Incubar sobre hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
   NOTA: Incluso con el giro medio de gradiente de densidad, el paso de digestión enzimática a menudo induce una muerte celular significativa en células T residentes en el tejido debido a la señalización ARTC2.2/P2RX7¹⁵. La tinción de colorante vivo/muerte es muy recomendable antes de la fijación. El nanocuerpo anti-ARTC2 se puede administrar en los ratones antes de la eutanasia para prevenir la muerte celular inducida por aislamiento celular.
7. Lave las muestras con el tampón FACS dos veces. Para cada lavado, llene los pozos de la placa de 96 pozos con tampón FACS frío, gire a 500 x g durante 5 min a 4 oC y deseche el sobrenadante.
8. Resuspender las celdas en el búfer de fijación de 100 l/pozo. Incubar a 37oC durante 10 min.
   NOTA: El tampón de fijación se hace recién diluyendo el formaldehído con PBS a una concentración final de 2% de formaldehído.
9. Lave las muestras con el tampón FACS dos veces. Para cada lavado, llene los pozos de la placa de 96 pozos con tampón FACS frío, gire a 500 x g durante 5 min a 4 oC y deseche el sobrenadante.
10. Resuspender las células en el búfer FACS de 250 l/pozo. Selle la placa, guárdela a 4oC y protéjala de la luz hasta el análisis FACS.
    NOTA: Antes del análisis de FACS, filtre las muestras a través de una malla de nylon de 70 m para eliminar posibles clústeres celulares que puedan obstruir la máquina FACS.

Resultados

El protocolo descrito aquí se resume en un diagrama de flujo(Figura 1A). En el día 30 después de la infección de LCMV, realizamos el etiquetado intravascular de células CD8⁺ T. 5 minutos más tarde, ambos riñones del animal fueron diseccionados, picados y sometidos a la digestión de la colagenasa. Los linfocitos se purificaron aún más a partir de las muestras digeridas a través de la centrifugación de Percoll y se analizaron mediante citometría de flujo. Como se muestr...

Discusión

Como la inmunidad específica del tejido es un área de investigación en rápida expansión, la acumulación de evidencia sugiere que las células inmunitarias, especialmente la población de linfocitos, se pueden identificar en casi todos los órganos en ratones humanos adultos o infectados o inmunizados. LcMV modelo de infección de ratón es un modelo bien establecido para estudiar la respuesta de células T específicas del antígeno, efector y la diferenciación de células T de memoria incluyendo la biología T

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-130
15 ml Conical Tubes	Corning	431470
3 ml syringe	BD	309657
37C incubator	VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)	Tonbo Biosciences	30-0081-U025
Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073.03
Collegenase B	Millipore Sigma	11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM
Insulin Syringe	BD	329424
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical	RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit	Biolegend	480043
overhead heat lamp	Amazon	B00333PZZG
PBS
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17089101
rocker	VWR
RPMI	GE Healthcare Life Sciences	SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer	Braintree Scientific, Inc	SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator	Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate	Corning	3516