Super-Resolución De Imágenes De Células Vivas De Estructuras Subcelulares

Resumen

Se presenta aquí un protocolo para la proyección de imagen de la vivir-célula de la super-resolución en tejido intacto. Hemos estandarizado las condiciones para la obtención de imágenes de una población de células madre adultas altamente sensibles en su entorno de tejido nativo. Esta técnica consiste en equilibrar la resolución temporal y espacial para permitir la observación directa de fenómenos biológicos en tejidos vivos.

Resumen

Durante mucho tiempo ha habido un equilibrio crucial entre la resolución espacial y temporal en las imágenes. Las imágenes más allá del límite de difracción de la luz se han restringido tradicionalmente para ser utilizadas solo en muestras fijas o células vivas fuera del tejido etiquetado con señal fluorescente fuerte. Las técnicas actuales de imagen de células vivas de súper resolución requieren el uso de sondas especiales de fluorescencia, alta iluminación, múltiples adquisiciones de imágenes con procesamiento posterior a la adquisición o, a menudo, una combinación de estos procesos. Estos requisitos previos limitan significativamente las muestras biológicas y los contextos a los que se puede aplicar esta técnica.

Aquí describimos un método para realizar super-resolución (~ 140 nm XY-resolución) tiempo de fluorescencia imágenes de células vivas in situ. Esta técnica también es compatible con baja intensidad fluorescente, por ejemplo, EGFP o mCherry endógenamente etiquetados en genes expresados humildemente. Como prueba de principio, hemos utilizado este método para visualizar múltiples estructuras subcelulares en el testículo de Drosophila. Durante la preparación del tejido, tanto la estructura celular como la morfología tisular se mantienen dentro del testículo diseccionado. Aquí, utilizamos esta técnica para obtener imágenes de la dinámica de los microtúbulos, las interacciones entre los microtúbulos y la membrana nuclear, así como la unión de los microtúbulos a los centrómeros.

Esta técnica requiere procedimientos especiales en la preparación de muestras, montaje de muestras e inmovilización de muestras. Además, los especímenes se deben mantener por varias horas después de la disección sin comprometer la función y la actividad celulares. Si bien hemos optimizado las condiciones para la obtención de imágenes de súper resolución en vivo específicamente en las células madre de la línea germinal masculina de Drosophila (GSCs) y las células germinales progenitoras en el tejido de testículo diseccionado, esta técnica es ampliamente aplicable a una variedad de diferentes tipos de células. La capacidad de observar las células bajo sus condiciones fisiológicas sin sacrificar la resolución espacial o temporal servirá como una herramienta invaluable para los investigadores que buscan abordar preguntas cruciales en biología celular.

Introducción

Visualizar las estructuras subcelulares y la dinámica de proteínas en células vivas con resolución más allá del límite de difracción de la luz es típicamente muy difícil^1-3. Mientras que se han desarrollado múltiples técnicas de súper resolución como microscopía estocástica-óptica-reconstrucción-microscopía (STORM), foto-activada-localización-microscopía (PALM) y estimulada-emisión-agotamiento (STED)^4,5,6 microscopía, las complicaciones en la preparación de muestras, así como la necesidad de mantener la viabilidad y la actividad ex vivo, limitan el uso de la microscopía convencional de súper resolución para obtener imágenes de muestras vivas. La microscopía confocal convencional no puede alcanzar una resolución espacial más allá de ~ 230 nm de resolución XY y a menudo es insuficiente para observar subestructuras celulares intrincadas^5,6. Sin embargo, un desarrollo reciente en microscopía confocal, airyscan super-resolución de imagen, es capaz de lograr aproximadamente 140 nm (resolución XY)^7,8 y tiene una preparación de muestra relativamente simple que es compatible con imágenes en vivo. Dado que este sistema de detección de imágenes requiere un largo tiempo de adquisición, su alta resolución espacial viene a costa de la resolución temporal⁹. Por lo tanto, se necesita un método para garantizar que las imágenes de células vivas se amplíen con alta resolución espacial.

Aquí, hemos desarrollado un método para la observación de células vivas en tejido intacto en su resolución óptima para descifrar las estructuras subcelulares con información espacial detallada. Este método está diseñado como tal para que las muestras se puedan montar de forma estable durante un largo período de tiempo (~ 10 h) sin moverse ni degenerar. Los medios celulares vivos utilizados en esta técnica pueden apoyar la función celular y evitar el fotoblanqueo durante un hasta 10 horas bajo un microscopio de súper resolución. Finalmente, este protocolo minimiza la mayoría de las tensiones causadas por la iluminación constante de los láseres durante largos períodos de tiempo como la hipoxia, los cambios en la humedad y la temperatura, así como el agotamiento de nutrientes.

Utilizando este protocolo para obtener imágenes de células madre de línea germinal masculinas de Drosophila (GSCs), pudimos observar cómo la actividad asimétrica de los microtúbulos permite la interacción preferencial con cromátidas hermanas epigenéticamente distintas^10,11,12,13. Estos tipos de eventos celulares son altamente dinámicos y son muy difíciles de visualizar en células vivas utilizando otros métodos de imágenes de súper resolución como STORM, PALM o STED. Anticipamos que este método llegará a ser altamente útil para los biólogos celulares, ya que tienen como objetivo comprender las estructuras subcelulares dinámicas de las células vivas que residen en los tejidos. Hay muchas áreas en las que se puede aplicar este método, como el estudio de la dinámica de las proteínas; comprender el movimiento de las células; y procesos de trazado de linaje y diferenciación celular, entre otras posibles aplicaciones.

Protocolo

1. Preparación de cóctel de imágenes de células vivas (medios celulares vivos)

1. Complemente el medio Drosophila de Schneider con suero fetal bovino al 15% (FBS) y 0,6 veces penicilina/estreptomicina. Ajuste el pH a aproximadamente 7.0.
2. Justo antes de usar el medio, agregue insulina a una concentración final de 200 μg/mL.
   NOTA: Este medio es crítico para mantener la división celular normal y el desarrollo del testículo de Drosophila durante las imágenes de lapso de tiempo^10,14.

2. Preparación del plato de cultivo celular con fondo de vidrio

1. Utilice un plato de cultivo celular con fondo de vidrio recubierto de L-lisina de poli con un diámetro de 35 mm para el testículo de Drosophila. El pozo interior del plato tiene un fondo de vidrio con un diámetro de 23 mm y un lado con una elevación de 1 mm (Figura 1A-a).
   NOTA: Elija un plato con fondo de vidrio que permita una distancia de trabajo más corta, una apertura numérica más grande y un objetivo de aumento más alto; estas características son cruciales para obtener una imagen de súper resolución.
2. Utilice una membrana de diálisis (MWCO: 12–14kD) que permita el intercambio gaseoso. Corte la membrana en trozos pequeños.
   NOTA: Las piezas de membrana deben ser más pequeñas que el área de vidrio del plato, pero lo suficientemente grandes como para cubrir la muestra.
3. Remoje la membrana con 100 μL de medios celulares vivos durante ~ 5 min. No utilice una membrana seca en la muestra, ya que puede dañarla. La membrana ayuda a prevenir el estrés hipóxico.
4. Prepare de 2 a 3 piezas ligeras de vidrio o plástico para colocar en la membrana para que el tejido no flote. Para hacer esto, primero tome el anillo exterior del tubo de centrífuga de 50 mL y córtelo en trozos pequeños. Luego, esterilice las piezas con etanol al 70% antes de su uso.
   NOTA: Este paso garantiza que la muestra permanezca en la superficie durante la toma de imágenes y no flote, lo que es crucial para obtener resultados óptimos.
5. Prepare un anillo de ~ 25 mm de diámetro y colómelo en el lado elevado del plato. Póngase un cubrebocas en él para generar dos cámaras. La cámara inferior contendrá la muestra, mientras que la cámara superior servirá como una cámara de humedad para evitar que la muestra se seque.
   1. Para hacer este anillo, corte el anillo exterior de un tubo de centrífuga de 50 mL, lo que le permitirá encajar de forma segura en el lado elevado de la antena parabólica de 35 mm. Un anillo similar se puede hacer de otras maneras, por ejemplo, mediante el uso de una banda elástica o una corbata de torsión de plástico para caber en el lado elevado del plato para sostener correctamente el cubrebocas sin interferir con la muestra.
      NOTA: Este paso es crítico, especialmente para muestras sensibles a tensiones como las condiciones hipóxicas y los cambios en la temperatura y la humedad.

3. Disección de testículos de moscas macho y montaje

1. Tome ~ 10 moscas macho jóvenes (2-3 días de edad) y diseccionar los testículos en el medio celular vivo para obtener ~ 10 pares de testículos adultos Drosophila.
   1. Diseccione las moscas bajo un microscopio de disección en un plato de disección usando pórceps finos.
      NOTA: La cepa Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) lleva uas-α-tubulina-GFP transgén impulsado por un controlador de células germinales temprana nanos-Gal4.
   2. Genere las siguientes cepas knock-in de Drosophila melanogaster utilizando la tecnología CRISPR-Cas9: Lamin-mCherry (etiqueta C-terminal) y CENP-A-Dendra2-CENP-A [etiqueta en el sitio interno (entre el codón 118 - 119)].
      NOTA: Si bien solo se necesita un testículo de excelente calidad para cada experimento, el montaje de un número suficiente de tejidos (15-20) o células garantizará que haya al menos una muestra sana con excelentes señales de fluorescencia para obtener imágenes de lapso de tiempo.
2. Lave los testículos dos veces en medios celulares vivos en el plato de disección.
   1. Use una pipeta para agregar medios seguidos de la extracción de los medios celulares vivos como paso de lavado.
   2. Elimine el exceso de tejido con fórceps. Cualquier tejido adicional interferirá con las imágenes.
      NOTA: No utilice solución salina tamponada con fosfato (PBS) para el lavado, ya que puede afectar la dinámica de ciertos componentes celulares.
3. Añadir de 100 a 150 μL de medio celular vivo en el plato (preparado en el paso 2.1) y extenderlo sobre la superficie del vidrio con una punta de pipeta. La dispersión de los medios en la superficie permitirá que el tejido se adhiera correctamente al plato.
4. Transferir los testículos al plato usando fórceps finos y llevarlos al centro del plato (Figura 1A-b).
   NOTA: Evite la transferencia de escombros porque interferirá con las imágenes y podría reducir la calidad de la imagen.
5. Retire el exceso de medios celulares vivos (deje aproximadamente 10 μL de medios) para permitir que el tejido se aplane y se adhiera correctamente al plato. Realice este paso rápidamente para evitar secar la muestra.
6. Colocar la membrana pre-húmeda (preparada en los pasos 2.2 y 2.3) sobre los testículos (Figura 1A-c).
7. Ponga de 2 a 3 pesos de plástico pequeños (preparados en el Paso 2.4) en la membrana para que la muestra no flote y agregue rápidamente 100–150 μL de medios celulares vivos (Figura 1A-d).
   NOTA: La adición de medios de forma rápida y suave garantiza que la muestra no se seque ni se desplace.
8. Colocar el anillo de plástico (preparado en el paso 2.5) en el lado elevado del plato (Figura 1B-a).
9. Coloque una tapa de 22 mm x 22 mm en la parte superior del anillo (Figura 1B-b). Esto genera dos cámaras.
10. Tome un pedazo de papel de seda, humedezca con agua, luego gire y colóle en el cubrebocas, para crear una cámara húmeda (Figura 1B-c). Cierre la tapa del plato(Figura 1B-d)y comience la toma de imágenes de células vivas.
    Nota : si el ejemplo es sensible a la luz, realice la sección 3 en la oscuridad.

4. Imágenes de células vivas de células madre de la línea germinal masculina de Drosophila (GSC) in situ

1. Coloque el plato bajo el microscopio de súper resolución y apriete con las abrazaderas del escenario.
   1. Abra el software de imágenes, encienda la luz transmitida y use el objetivo 63x para enfocar el tejido del testículo con la perilla de enfoque.
      NOTA: Si hay una dificultad en la localización de una muestra con el objetivo 63x, a continuación, utilice primero el objetivo 40x o 20x antes de cambiar al 63x.
   2. Encienda los láseres, haga clic en En vivoy busque el GSC con la posición y el estado óptimos. Evite los testículos que tienen una señal de fluorescencia baja o tienen el cubo (nicho) lejos de la superficie.
      NOTA: En los testículos de Drosophila, los GSC están unidos al concentrador.
2. Ajuste el enfoque para los GSC e identifique los ajustes correctos para la muestra, incluida la potencia del láser, la ganancia de multiplicación de electrones (EM), el promedio y el zoom para el modo Airyscan. Utilice los siguientes ajustes como ejemplo para los testículos de Drosophila que expresan EGFP etiquetado α-tubulina en células germinales en etapa temprana.
   1. Establezca el tamaño de fotograma entre 512 x 512 píxeles y 1024 x 1024 píxeles haciendo clic en Tamaño de fotograma.
   2. Establezca el promedio de fotogramas en 1 o 2 haciendo clic en Promediación.
      NOTA: Aumentar el tamaño del fotograma (>1024 x 1024 píxeles) y realizar un promedio más (es decir, más de 2) podría dar lugar a fotoblanqueo o fototoxicidad.
   3. Establezca la potencia del láser en 1%-2% haciendo clic en Láseres.
      NOTA: Aumentar la potencia del láser también puede conducir a la fotoblanqueo o fototoxicidad.
   4. Establezca la ganancia EM por debajo del nivel recomendado (< 800) haciendo clic en Ganancia maestra.
      Nota : una ganancia em mayor puede generar artefactos.
   5. Acerque la región o celda de interés para reducir el tiempo de adquisición de la imagen y reducir el fotoblanqueo. Esto también permite que el espécimen sobreviva por más tiempo.
3. Inicie la captura de imagen de lapso de tiempo utilizando el modo Airyscan haciendo clic en Iniciar experimento.
   1. Antes de hacer clic en Iniciar experimento, asegúrese de que la adquisición está configurada de forma óptima.
   2. Si muestra una advertencia con el aviso "La adquisición de Airyscan no está configurada de forma óptima", haga clic en Óptimo en la sección de tamaño de fotograma, haga clic en Óptimo en la sección z-stack y haga clic en Óptimo para la sección de área de escaneo (se requiere un zoom mínimo de 1,3 para obtener imágenes de súper resolución).
4. Optimice el intervalo de tiempo, el número de z-slices y la duración de la imagen de lapso de tiempo de acuerdo con el diseño experimental y el tipo de muestra, para que la calidad de la imagen no se vea comprometida y las células no se detendrán en etapas particulares del ciclo celular.
   1. Como ejemplo, los parámetros para la proyección de imagen del lapso de tiempo de los testículos de Drosophila que expresan egfp-marcado α-tubulina en germline temprano se muestran en los pasos siguientes.
   2. Para más de 5 h de imágenes de lapso de tiempo, la imagen en un intervalo de 10 minutos con 1% de potencia láser y tomar hasta 30 z-slices en cada punto de tiempo.
   3. Para procesos celulares altamente dinámicos, como la dinámica de microtúbulos, establezca un intervalo de 2 minutos entre los puntos de tiempo, realice imágenes de lapso de tiempo de 1 a 2 h al 1% de potencia del láser y tome hasta 30 cortes z en cada punto de tiempo.
   4. Para eventos celulares raros, como la dinámica de la cromatina de anafase a la telofasa temprana (eventos de 2-3 min), establezca imágenes de células vivas con un intervalo de 1 minuto entre los puntos de tiempo, realice imágenes de lapso de tiempo de 30 minutos al 1% de potencia del láser y tome hasta 30 z-slices en cada punto de tiempo.
      NOTA: Estos parámetros pueden variar para diferentes muestras, por lo que la alteración será necesaria para un uso óptimo para la muestra específica.
5. Realice la proyección de imagen del lapso de tiempo o la proyección de imagen viva de la instantánea, dependiendo de la sensibilidad de la muestra y del diseño experimental.
   NOTA: Una película corta es de 15-30 minutos, y una película larga es más de 5 h.
6. Si la muestra es muy sensible y no puede ser estudiada por imágenes de lapso de tiempo con un microscopio de súper resolución, como suele ser el caso con drosophila macho GSCs, realizar una instantánea en vivo de super-resolución (SRLS) de la muestra en diferentes etapas del ciclo celular (como se muestra en la Figura 2, Figura 3, Figura 4).
   1. Si se está capturando un evento biológico celular raro o la proteína de interés tiene un bajo nivel de expresión, realice SRLS.
   2. Para SRLS, encuentre una célula en la etapa específica del ciclo celular en la que está interesado. Por ejemplo, si se centra en la unión de microtúbulos-kinetochore, a continuación, utilizar una célula en prometaphase o metafase.
      NOTA: Esto ayudará a garantizar que obtenga una imagen de alta calidad de la célula de interés en el momento adecuado sin arriesgar la fototoxicidad de la muestra o el blanqueo de los fluoróforos, que puede ocurrir durante una película más larga.
   3. Si utiliza SRLS, irrajure diferentes etapas del ciclo celular de interés en varias celdas y organice estas imágenes en orden cronológico.
      NOTA: Esto se puede utilizar para construir un orden temporal de eventos mientras se maximiza la salud de la señal y el tejido, para obtener una excelente resolución temporal del evento para muestras particularmente sensibles o muestras con señal baja.

5. Procesamiento airyscan de las imágenes de células vivas

1. Después de la adquisición de imágenes con el software de creación de imágenes, seleccione Procesamiento, haga clic en Lotey, a continuación, seleccione Procesamiento de Airyscan.
   1. Seleccione las imágenes que se van a procesar y, a continuación, haga clic en Ejecutar/Procesar para obtener las imágenes de supersecha.
   2. Realice el procesamiento con la configuración predeterminada.
      NOTA: El procesamiento de Airyscan solo funcionará si la configuración de imágenes está establecida correctamente para las imágenes de Airyscan.

Resultados

La proyección de imagen viva de la célula más allá del límite de la difracción en tejido de Drosophila, especialmente para GSCs, proporciona una oportunidad de investigar la dinámica de eventos subcelulares en el contexto de la progresión del ciclo celular. Recientemente, un estudio que utiliza este protocolo ha mostrado que las actividades de los microtúbulos en el centrosoma de la madre contra el centrosoma de la hija son temporal asimétricas en GSCs^10. El centrosoma de la mad...

Discusión

Los métodos de microscopía de súper resolución proporcionan una resolución espacial tan alta como 10s de nanómetros^4,5,6. Los métodos de microscopía STORM y PALM permiten una resolución de hasta 20 a 50 nm (resolución XY), mientras que la microscopía STED ofrece una resolución de 20 a 100 nm (resolución XY). La resolución espacial de la microscopía SIM está limitada a 100 a 130 nm^15. Sin embargo, debid...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A