Habilitación de la compensación en tiempo real en oxidaciones fotoquímicas rápidas de proteínas para la determinación de los cambios en la topografía proteica

Resumen

La oxidación fotoquímica rápida de proteínas es una técnica emergente para la caracterización estructural de proteínas. Diferentes aditivos solventes y ligandos tienen variadas propiedades de barrido hidroxilo radical. Para comparar la estructura proteica en diferentes condiciones, se requiere una compensación en tiempo real de los radicales hidroxilo generados en la reacción para normalizar las condiciones de reacción.

Resumen

La oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) es una técnica de biología estructural basada en espectrometría de masas que sondea la superficie accesible al solvente de las proteínas. Esta técnica se basa en la reacción de las cadenas laterales de aminoácidos con radicales hidroxilo que se difunden libremente en solución. FPOP genera estos radicales in situ por fotólisis láser de peróxido de hidrógeno, creando una ráfaga de radicales hidroxilo que se agota en el orden de un microsegundo. Cuando estos radicales hidroxilo reaccionan con una cadena lateral de aminoácidos accesibles al disolvente, los productos de reacción presentan un cambio de masa que se puede medir y cuantificar mediante espectrometría de masas. Dado que la tasa de reacción de un aminoácido depende en parte de la superficie accesible del disolvente promedio de ese aminoácido, los cambios medidos en la cantidad de oxidación de una región determinada de una proteína pueden correlacionarse directamente con los cambios en la accesibilidad del disolvente de esa región entre diferentes conformaciones (por ejemplo, ligando-unido versus ligando-libre, monómero vs. agregado, etc.) FPOP se ha aplicado en una serie de problemas en la biología, incluyendo interacciones proteína-proteína, cambios en la conformación de proteínas, y unión proteína-ligand. Dado que la concentración disponible de radicales hidroxilo varía en función de muchas condiciones experimentales en el experimento FPOP, es importante controlar la dosis radical efectiva a la que está expuesto el analito proteico. Este monitoreo se logra eficientemente mediante la incorporación de un dosímetro en línea para medir la señal de la reacción FPOP, con fluencia láser ajustada en tiempo real para lograr la cantidad deseada de oxidación. Con esta compensación, los cambios en la topografía proteica que reflejan cambios en la conformación, superficies de unión de ligandos y/o interfaces de interacción proteína-proteína se pueden determinar en muestras heterogéneas utilizando cantidades de muestra relativamente bajas.

Introducción

La oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) es una técnica emergente para la determinación de cambios topográficos proteicos mediante la modificación covalente ultrarrápida de la superficie expuesta al disolvente de proteínas seguida de la detección por LC-MS¹. FPOP genera una alta concentración de radicales hidroxilo in situ por fotolisis flash láser UV de peróxido de hidrógeno. Estos radicales hidroxilo son muy reactivos y de corta duración, consumidos en aproximadamente una escala de tiempo de microsegundos bajo condiciones FPOP². Estos radicales hidroxilo se difunden a través del agua y oxidan varios componentes⁶ orgánicos en solución a tasas cinéticas que generalmente van desde rápido (10 M^-1 s^-1) a³controlado por difusión. Cuando el radical hidroxilo se encuentra con una superficie de proteína, el radical oxidará las cadenas laterales de aminoácidos en la superficie de la proteína, lo que resulta en un cambio de masa de ese aminoácido (más comúnmente la adición neta de un átomo de oxígeno)⁴. La velocidad de la reacción de oxidación en cualquier aminoácido depende de dos factores: la reactividad inherente de ese aminoácido (que depende de la cadena lateral y del contexto de secuencia)^4,5 y la accesibilidad de esa cadena lateral al radical hidroxilo difusor, que se correlaciona estrechamente con la superficie accesible del disolvente medio^6,7. Todos los aminoácidos estándar excepto la glicina se han observado como etiquetado por estos radicales hidroxilo altamente reactivos en experimentos FPOP, aunque con rendimientos muy diferentes; en la práctica, Ser, Thr, Asn y Ala rara vez se consideran oxidados en la mayoría de las muestras, excepto bajo dosis de radicales altos e identificados por la cuidadosa y sensible fragmentación específica de ETD^8,,9. Después de la oxidación, las muestras se apagan para eliminar el peróxido de hidrógeno y los oxidantes secundarios (superóxido, oxígeno singlete, hidroperóxidos de peptidil, etc.) Las muestras insaciadas se digieren proteolíticamente para generar mezclas de péptidos oxidados, donde la información estructural se congela como una "instantánea" química en los patrones de los productos de oxidación de los diversos péptidos (Figura 1). La cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS) se utiliza para medir la cantidad de oxidación de aminoácidos en un péptido proteolítico determinado basado en las intensidades relativas de las versiones oxidadas y no oxidadas de ese péptido. Al comparar esta huella oxidativa de la misma proteína obtenida en diferentes condiciones de conformacional (por ejemplo, ligando frente frente frente a ligando libre), las diferencias en la cantidad de oxidación de una región determinada de la proteína pueden correlacionarse directamente con las diferencias en la superficie accesible al disolvente de esa región^6,,7. La capacidad de proporcionar información topográfica de proteínas hace de FPOP una tecnología atractiva para la determinación de la estructura de orden superior de las proteínas, incluso en el descubrimiento terapéutico proteico y el desarrollo^10,,11.

Figura 1: Visión general de FPOP. La superficie de la proteína es modificada covalentemente por radicales hidroxilo altamente reactivos. Los radicales hidroxilo reaccionarán con las cadenas laterales de aminoácidos de la proteína a una velocidad fuertemente influenciada por la accesibilidad del disolvente de la cadena lateral. Los cambios topográficos (por ejemplo, debido a la unión de un ligando como se muestra arriba) protegerán los aminoácidos en la región de interacción de reaccionar con radicales hidroxilo, lo que resulta en una disminución en la intensidad del péptido modificado en la señal LC-MS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diferentes componentes presentes en la solución FPOP (por ejemplo, ligandos, excipientes, tampones) tienen diferente actividad de barrido hacia los radicales hidroxilo generados sobre la fotólisis láser de peróxido de hidrógeno³. Del mismo modo, un pequeño cambio en la concentración de peróxido, la fluencia láser y la composición del tampón puede cambiar la dosis radical efectiva, haciendo que la reproducción de datos FPOP sea un reto entre las muestras y entre diferentes laboratorios. Por lo tanto, es importante poder comparar la dosis radical hidroxilo disponible para reaccionar con la proteína en cada muestra utilizando uno de los varios dosímetros radicales hidroxilo disponibles^{12,13,14,15,16}. Los dosímetros radicales hidroxilo actúan compitiendo con el analito (y con todos los carroñeros en solución) para la piscina de radicales hidroxilo; la dosis efectiva de los radicales hidroxilo se mide midiendo la cantidad de oxidación del dosímetro. Tenga en cuenta que "dosis radical hidroxilo eficaz" es una función tanto de la concentración inicial de hidroxilo radical generado y la vida media del radical. Estos dos parámetros dependen parcialmente entre sí, haciendo que el modelado cinético teórico sea algo complejo(Figura 2). Dos muestras podrían tener vida media radical inicial muy diferente mientras se mantiene la misma dosis radical efectiva cambiando la concentración inicial de hidroxilo radical formado; seguirán generando huellas idénticas¹⁷. Adenina¹³ y Tris¹² son convenientes dosímetros radicales hidroxilo porque su nivel de oxidación se puede medir por espectroscopia UV en tiempo real, lo que permite a los investigadores identificar rápidamente cuando hay un problema con la dosis efectiva de radical hidroxilo y para solucionar su problema. Para resolver este problema, es importante un dosímetro en línea ubicado en el sistema de flujo directamente después del sitio de irradiación que puede monitorear la señal de los cambios de absorbancia de la adenina en tiempo real. Esto ayuda a llevar a cabo experimentos FPOP en amortiguadores o cualquier otro excipiente con niveles ampliamente diferentes de capacidad de barrido radical hidroxilo¹⁷. Esta compensación de dosis radical se puede realizar en tiempo real, dando resultados estadísticamente indistinguibles para el mismo conformerlo mediante el ajuste de la dosis radical efectiva.

En este protocolo, tenemos procedimientos detallados para realizar un experimento típico de FPOP con compensación de dosificación radical utilizando adenina como un dosímetro radical óptico interno. Este método permite a los investigadores comparar huellas entre condiciones FPOP que tienen diferente capacidad de barrido mediante la realización de compensación en tiempo real.

Figura 2: Simulación cinética de la compensación basada en la dosimetría. La respuesta del dosímetro de adenina de 1 mM se mide en un analito de cilima de 5 mM con una concentración inicial de 1 mM de «1 mM" en un sensor radical hidroxilo inicial (▪OH t_1/2a53 ns) y se establece como respuesta del dosímetro objetivo (negro). Tras la adición de 1 mM de la histidina excipiente carroñera, la respuesta del dosímetro (azul) disminuye junto con la cantidad de oxidación de proteínas de manera proporcional (cian). La vida media del radical hidroxilo también disminuye (▪OH t_1/2a39 ns). Cuando la cantidad de radical hidroxilo generado se incrementa para dar un rendimiento equivalente de dosímetro oxidado en la muestra con 1 mM histidina carroñero como se logra con 1 mM de radical hidroxilo en ausencia de carroñero (rojo), la cantidad de oxidación de proteína que se produce de forma similar se convierte en idéntica (magenta), mientras que la vida media radical hidroxilo disminuye aún más (▪OH t_1/2=ns). Adaptado con permiso de Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

1. Prepare el banco óptico y el capilar para FPOP

ADVERTENCIA: Los láseres de excimer KrF son peligros oculares extremos, y la luz directa o reflejada puede causar daños oculares permanentes. Use siempre la protección adecuada para los ojos, evite la presencia de objetos reflectantes cerca de la trayectoria del haz cuando sea posible y utilice controles de ingeniería para evitar el acceso no autorizado a un láser activo y para restringir cualquier reflejo perdido.

1. Prepare el banco óptico FPOP.
   1. Encienda el láser para calentar. Ajuste el láser a Disparador externo, Energía constante, Sin reemplazo de gas. Ajuste la energía láser por pulso (normalmente entre 80-120 mJ/pulso).
   2. Configure el banco óptico con la lente plano-convexa (30 mm de diámetro x 120 mm FL sin recubrimiento) directamente en la trayectoria del rayo láser y un backstop no reflectante para absorber la luz como se muestra en la Figura 3A.

Figura 3: Banco óptico para el experimento FPOP. (A) La muestra se mezcla con H₂O₂, dosímetro radical de adenina, y el carroñero de glutamina y se carga en la jeringa. La muestra se empuja a través del capilar de sílice fusionada a través de la trayectoria de haz enfocada de un láser UV excimer KrF. La luz UV fotoliza H₂O₂ en radicales hidroxilo, que oxida la proteína y el dosímetro de adenina. El flujo de la jeringa empuja la muestra iluminada fuera de la trayectoria del láser antes del siguiente pulso láser, con un volumen de exclusión no contaminado entre las regiones iluminadas. Inmediatamente después de la oxidación, la muestra se pasa a través de un espectrofotómetro UV en línea, que mide la absorción UV de la adenina a 265 nm. A continuación, la muestra se deposita en un tampón de enfriamiento para eliminar los oxidantes H₂O₂ y secundarios restantes. (B) El tamaño del punto se mide después de irradiar una nota adhesiva de color colocada detrás del capilar con el láser a 248 nm. La anchura del punto se utiliza para calcular el caudal de la muestra, y la silueta del capilar en el centro del punto se utiliza para alinear el banco óptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Cortar una longitud adecuada del capilar de sílice fusionada (diámetro exterior de 360 m y diámetro interior de 100 m) y con un manguito, conéctelo a la jeringa hermética al gas utilizando un conector de bajo volumen muerto.
3. Quemar suavemente el recubrimiento de poliimida del capilar con una antorcha de butano en el lugar donde el dosímetro en línea lee la señal de absorbancia a 265 nm después de la exposición láser de las muestras. Limpie suavemente los restos del capilar con metanol en una toallita sin pelusas. El recubrimiento de poliimida en el lugar de incidencia láser puede quemarse de manera similar con la antorcha de butano o quemarse con el láser excimer disparando a baja potencia.
   NOTA: Espere a que el capilar se enfríe, ya que es un peligro de incendio utilizar el metanol en el capilar caliente.
4. Coloque este capilar a través de la trayectoria del haz del láser y en el dosímetro en línea.
   1. Presione la palanca en la parte superior del dosímetro en línea para abrir la bisagra. Retire los soportes magnéticos. Coloque el capilar en la ranura mecanizada del dosímetro en línea, utilizando los soportes magnéticos para mantener el capilar en su lugar. Cierre la bisagra del dosímetro sobre el capilar, presionándola hasta que la palanca se bloquee en su lugar.
5. Con el software de dosimetría, haga clic en el botón Iniciar Flash para comenzar a disparar el láser excimer. Establezca la potencia láser preestablecida entre 50-100 mJ/pulso en el propio software de control láser y establezca la velocidad de repetición preestablecida entre 10-20 Hz en la pestaña Configuración del software de dosimetría.
   1. Enfoque el rayo láser utilizando una lente convexa plano montada en una etapa motorizada lineal. Mida la anchura y la altura del punto láser en la posición del capilar en una nota adhesiva utilizando con precisión una pinza para calcular la fluencia incidente (mJ/mm²) como se muestra en la Figura 3B.
6. Coloque una abertura opaca cerca del capilar para asegurar una anchura iluminada uniforme del capilar independientemente de los cambios en el tamaño del haz debido al movimiento de la lente o cambiando la energía por pulso del láser¹⁸.
   1. Con el disparo láser, mueva la etapa motorizada a través de su rango de movimiento. Asegúrese de que la viga se mantenga centrada en la abertura y que la silueta del capilar se pueda observar en todo momento. El diámetro de la abertura debe ser menor que la anchura de la viga focalizada en cada punto del rango de la etapa motorizada.
7. Pase agua a través del capilar a 20 ml/min durante al menos un minuto para lavar el capilar.
   1. Haga clic en el botón Iniciar datos + AutoZero en el software del dosímetro para poner a cero el dosímetro para regar y comenzar la recopilación de datos.
      NOTA: Si el sistema tampón para FPOP tiene una absorción UV significativa a 265 nm, el sistema FPOP debe ponerse a cero en el tampón, no en el agua.
8. Ajuste el caudal calculado en la bomba de la jeringa.
   1. El caudal de la muestra de proteína depende del volumen irradiado por inyección(V_Irr),del número de inyecciones láser por segundo(R) y de la fracción de volumen de exclusión sinradiada deseada (F_Ex) para corregir los efectos de flujo laminar y la difusión de muestras (0,15-0,30 recomendado)^2,19,20. Calcule el V_Irr (en L) en función del diámetro interior del capilar en mm (d) y la anchura del punto láser que afectan al capilar (es decir, la anchura de la abertura) en mm (w) utilizando la siguiente ecuación:
      V_Irr á π(d/2)²w
   2. Calcule el caudal deseado (en L/min) basándose en la siguiente ecuación:
      Flujo 60 R[V_Irr (1 + F_Ex)]

2. Preparación de la solución proteica para FPOP

1. Preparar la proteína en las dos o más condiciones diferentes a comparar (por ejemplo, ligando y libre de ligandos; agregado y monómero; solo y con un socio de unión a proteínas; etc.) para detectar los cambios de conformación.
2. Establezca el volumen total utilizado para FPOP para que se ajuste a las necesidades del experimento. El límite mínimo generalmente depende del volumen del capilar de irradiación y del material necesario para la detección robusta y la cuantificación relativa, y variará dependiendo en gran medida del sistema LC-MS/MS utilizado y del método de procesamiento de muestras posteriores al etiquetado. El volumen total de las soluciones FPOP que se utilizan comúnmente en nuestro grupo es de 20 l después de la adición de peróxido de hidrógeno. La concentración final de la proteína es comúnmente de 1-10 m, con 17 mM de glutamina (para limitar la vida útil del radical hidroxilo), 1 mM de adenina (para actuar como un dosímetro radical)^13,17 y 10 mM tampón de fosfato (un tampón que es un pobre carroñero de radicales hidroxilo). Las muestras generalmente se preparan con múltiples réplicas para permitir el modelado estadístico de los resultados.
   1. Para la mayoría de los propósitos generales, preparar muestras en triplicado en ambos estados, además de al menos una muestra para utilizar como control sin láser para medir la oxidación de fondo. Prepare 18 l de esta mezcla de solución FPOP.
      NOTA: Muchos tampones y aditivos comúnmente utilizados en la bioquímica son carroñeros radicales hidroxilo. Estos aditivos y tampones se pueden utilizar; sin embargo, pueden producirse reducciones en la oxidación debido al barrido radical hidroxilo del tampón. En general, mantenga todos los aditivos al mínimo requerido por el sistema biológico para maximizar el rendimiento de oxidación de proteínas. Se debe evitar el sulfóxido de dimetil debido a la propensión a generar radicales secundarios; dimetilformamida ha sido una alternativa útil en nuestras manos. Cuando se utilizan tampones que son fuertes carroñeros radicales hidroxilo, la glutamina a menudo se puede excluir de la mezcla de solución FPOP.
3. Preparar 1 M de peróxido de hidrógeno inmediatamente antes del experimento FPOP.
   NOTA: 30% de peróxido de hidrógeno como comúnmente vendido por los vendedores incluye un estabilizador, que aumenta la vida útil. Una vez diluido, peróxido de hidrógeno debe utilizarse rápidamente, definitivamente dentro del mismo día. El peróxido de hidrógeno también debe ser probado regularmente para la descomposición por FPOP utilizando un dosímetro radical hidroxilo.
4. Preparar tubos de microcentrífuga que contengan 25 ml de solución de enfriamiento de 0,5 g/l de metionina amida y 0,5 g/l de catalasa. Si se utiliza un volumen de muestra superior a 20 oL para FPOP, aumente proporcionalmente el volumen de la solución de enfriamiento.

3. Realizar el experimento FPOP

1. Añadir 2 l de peróxido de hidrógeno en los 18 l de la mezcla de solución FPOP. Mezclar el contenido suavemente con una pipeta y girar rápidamente hacia abajo la solución a la parte inferior de los tubos de microcentrífuga. Recoja inmediatamente con una jeringa hermética y cargue en la bomba de la jeringa.
2. Inicie el flujo en la bomba de la jeringa con el caudal determinado en el paso 1.8.1 (normalmente entre 8-16 l/min) haciendo clic en el botón Iniciar bomba del software del dosificador.
3. Supervise la lectura de adenina en tiempo real utilizando el dosímetro en línea (ver Tabla de materiales)y recoja la muestra en residuos. Espere a que la señal Abs₂₆₅ se estabilice.
4. Haga clic en el botón Start Flash en el software dosímetro para comenzar a disparar el láser a la velocidad de repetición y la energía preestablecidas.
5. Supervisar la lectura de adenina en tiempo real utilizando un dosímetro en línea (ver Tabla de materiales); la diferencia en Abs₂₆₅ con el láser apagado y el láser encendido es la lectura de_{los 265.}
   NOTA: La aparición de abs₂₆₅ lecturas altamente inestables al disparar el láser en presencia de peróxido de hidrógeno se debe a la generación de burbujas en solución. Reducir la fluidez del láser y/o la concentración de peróxido de hidrógeno para eliminar las burbujas.

4. Realizar la compensación

NOTA: Diferentes ligandos, tampones, etc. pueden tener diferente capacidad de barrido hacia los radicales hidroxilo. Es importante asegurarse de que se disponga de dosis efectivas comparables de radicales hidroxilo para reaccionar con proteínas a través de diferentes muestras. Esto se logra asegurando la misma respuesta del dosímetro radical hidroxilo entre las muestras. Usando dosimetría de adenina, el cambio en la absorbancia UV a 265 nm (Abs₂₆₅) refleja la dosis efectiva de hidroxilo radical; cuanto mayor sea la_265,mayor será la dosis efectiva de radical hidroxilo.

1. Compare la lectura del abs₂₆₅ obtenida con el dosímetro en línea con la lectura deseada de la obtención_{de 265} obtenida mediante experimentos o controles previos. Una lectura de_{abs 265} inferior a la lectura deseada indica una dosis efectiva insuficiente de radicales hidroxilo; una lectura de Abs₂₆₅ indica una dosis radical efectiva que es demasiado alta. Si la lectura de la fuente₂₆₅ está en el nivel deseado, recoja la muestra inmediatamente después de la irradiación láser en el búfer de enfriamiento¹⁷.
2. Compensar la dosis radical efectiva para igualar el sAbs₂₆₅. Esta compensación se puede realizar de tres maneras: cambiar la concentración de peróxido de hidrógeno, aumentar la fluidez del láser cambiando la energía del láser por pulso, o aumentar la fluencia láser cambiando el plano focal de la lente de enfoque.
   1. Para realizar un cambio importante (>10 mAU) en la lectura de la página_265, vuelva a hacer el rehacer la muestra con más o menos peróxido de hidrógeno y vuelva a ejecutar la muestra según la Sección 3.
   2. Para realizar un pequeño cambio en la lectura de los anchos₂₆₅ en tiempo real, ajuste el plano focal del haz incidente ajustando la posición de la lente de enfoque utilizando el escenario motorizado de 50 mm. Acercar el plano focal a la posición del capilar aumentará la lectura del_{Abs 265;} llevar el plano focal más lejos de la posición del capilar disminuirá la lectura de_{los 265 años.}
3. Vigilar la adenina -Abs₂₆₅ para medir la cantidad efectiva de radical hidroxilo presente en la muestra después de la irradiación láser¹³. La monitorización en tiempo real con un detector capilar UV en línea permite una compensación en tiempo real como se describe en 4.2.2; ajuste la posición de la lente utilizando la etapa motorizada hasta que la lectura de la barra₂₆₅ sea igual a la lectura deseada. Las mediciones de absorbancia post-experimental con un espectrofotómetro UV también son precisas, pero requieren nuevas muestras para ser utilizadas para cada dosis efectiva de radical.

5. Digerir las muestras de proteínas

NOTA: La tripina se utiliza más comúnmente para digerir muestras de proteínas para FPOP, y es la proteasa utilizada en este protocolo. Es una proteasa fiable que genera péptidos con sitios básicos tanto en el término N como en C, promoviendo multiplicar los iones peptídicos cargados en em. Por otra parte, se corta después de lisina y arginina, dos aminoácidos que son sólo moderadamente reactivos a los radicales hidroxilo; por lo tanto, los cambios en el patrón de digestión debido a la oxidación de analitos son raros. Otras proteasas se han utilizado con éxito con FPOP^21,pero se debe tener cuidado para garantizar que los patrones de digestión sean comparables entre las muestras no oxidadas y oxidadas.

1. Mida el volumen final de la muestra de FPOP apretada. Añadir 500 mM Tris, pH 8.0 con 10 mM CaCl₂ que contiene 50 mM de ditiothreitol (TDT) a la solución proteica después de apagar a una concentración final de 50 mM Tris, 1 mM CaCl₂ y 5 mM DTT.
2. Calentar la muestra de proteína a 95 oC durante 15 minutos.
3. Enfríe inmediatamente la muestra sobre hielo durante 2 minutos.
4. Agregue la relación peso de 1:20 de trippsina/proteína a las muestras.
5. Digerir la proteína durante la noche a 37oC con la mezcla.
6. Detener la reacción de digestión mediante la adición de 0,1% de ácido fórmico y/o calentar la muestra a 95oC durante 10 min.
7. Añadir 2 mM de TDT a las muestras y calentar a 60oC durante 15 min inmediatamente antes de LC-MS/MS.
   NOTA: Mientras que otros grupos han reportado alquilación de tioles en experimentos FPOP, en nuestras manos hemos observado productos secundarios sobre la alquilación de proteínas oxidadas (posiblemente debido a la reacción con carbonilos nucleófilos formados como un producto de oxidación menor). Por lo tanto, elegimos evitar la alquilación de tiols cuando sea posible.

6. Realizar espectrometría de masas tándem de cromatografía líquida (LC-MS/MS)

1. Preparar la fase móvil A que consiste en agua que contiene 0,1% de ácido fórmico y fase B móvil que consiste en acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico.
2. Cargue la muestra primero en una columna de trampa C18 (300 m I.D. x 5 mm de tamaño de poro de 100o, tamaño de partícula de 5 m) y lave con un 2% de disolvente B durante 3 minutos a un caudal de 5,0 l/min para eliminar sales y moléculas pequeñas hidrófilas.
3. A continuación, separe los péptidos en nanocolumna C18 (0,75 mm x 150 mm, tamaño de partícula de 2 m, tamaño de poro de 100o) a un caudal de 300 nL/min. El gradiente consiste en un aumento lineal de 2 a 35% de disolvente B durante 22 min, rampaado al 95% de disolvente B durante 5 min y mantenido durante 3 minutos para lavar la columna, y luego regresó al 2% B durante 3 min y se mantuvo durante 9 minutos para reequilibrar la columna.
   NOTA: Este gradiente es suficiente para LC-MS/MS de la mayoría de las mezclas de FPOP de una y dos proteínas que buscan hacer la cuantificación a nivel de péptido. El porcentaje de disolvente B puede necesitar ser alterado para aumentar la resolución de péptidos en casos raros donde los péptidos interfieren entre sí debido a tiempos de retención similares y valores m/z. Los diseños experimentales A escala proteome FPOP²² o experimentales que buscan separar los isómeros de productos de oxidación de péptidos^1,,23,,24,25 pueden requerir gradientes LC más largos y están fuera del alcance de este informe.
4. Eluda los péptidos directamente en la fuente de nanospray de un espectrómetro de masas de alta resolución utilizando un emisor de nanospray conductor.
5. Adquiera los datos en modo iónico positivo. Ajuste la tensión de pulverización a 2400 V, y la temperatura del tubo de transferencia de iones a 300 oC.
6. Adquiera las exploraciones de MS completas de m/z 250 a 2000 a una resolución nominal a m/z 200 de 60.000 seguidas de ocho exploraciones posteriores de trampa de iones lineales dependientes de datos MS/MS en los ocho iones de péptidos más abundantes que utilizan una disociación inducida por colisión a una energía normalizada del 35% para identificar los péptidos. Fragmente los péptidos hasta cinco veces dentro de 30 s y luego transfiera a una lista de exclusión durante 60 s.

7. Procesamiento de datos y cálculo de la oxidación media de péptidos

1. Determinar la cobertura de secuencia de los valores de proteína, m/z y los tiempos de retención de los péptidos no oxidados utilizando el motor de búsqueda proteómica MS/MS.
2. Establezca la tolerancia de masa precursora en 10 ppm y permita hasta dos sitios de escote perdidos para las muestras digeridas de la trippsina, utilizando la especificidad estándar de la escisión de la trippsina.
3. Establezca la tolerancia de masa del fragmento de masa del péptido en 0,4 Daltons.
4. Sobre la base de la relación m/z de los péptidos no modificados detectados y los cambios de masa conocidos de los principales productos de oxidación, calcular la m/z de los diversos productos teóricos de oxidación de cada péptido^{4,26,27,28,29}.
5. Identifique el cromatograma iónico extraído de estos valores m/z utilizando software para ver la ejecución espectrométrica de masas (Figura 4). Identificar los productos de oxidación de péptidos en función de su m/z,su estado de carga y la similitud en el tiempo de elución con el péptido no modificado. En nuestras manos, los productos de oxidación de péptidos se eluen entre 240 segundos antes y 180 segundos después del péptido no modificado utilizando el gradiente LC anterior. Como la oxidación a menudo dará lugar a múltiples productos de oxidación isomérica, es común observar múltiples picos parcialmente resueltos en los cromatogramas iónicos extraídos de productos de oxidación de péptidos, como se muestra en la Figura 4. Los productos de oxidación de péptidos se cuantifican en función del área de los picos en los cromatogramas iónicos extraídos.

Figura 4: Cromatograma iónico extraído de un péptido y sus productos de oxidación después de FPOP. La m/z de los productos de oxidación de péptidos se calcula sobre la base de la m/z del péptido no oxidado y los productos de oxidación conocidos; y se determinan las áreas de estos productos peptídicos. El área de los productos peptídicos se utiliza entonces para el cálculo de los eventos de oxidación promedio por péptido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Calcular la oxidación media de los péptidos utilizando la siguiente ecuación.

donde P denota el número promedio de eventos de oxidación por molécula de péptido, y yo representa el área pico del péptido nooxidado (Iunoxidized)y el péptido con n eventos de oxidación. Tenga en cuenta que yo(singly oxidaized) incluiría no sólo adiciones de un solo átomo de oxígeno, sino también otros eventos de oxidación individual menos comunes que el investigador puede elegir medir (por ejemplo, descarboxilación oxidativa, formación de carbonilo, etc.) ^{4,26,27,28,29}.

Resultados

La comparación de la huella de péptido de cadena pesada del adalimumab biosimilar en tampón de fosfato y cuando se calienta a 55 oC durante 1 h muestra resultados interesantes. La prueba t del estudiante se utiliza para la identificación de péptidos que se cambian significativamente en estas dos condiciones (p ≤ 0,05). Los péptidos 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 y 414-420 muestran una protección significativa contra el disolvente cuando la proteína se calienta para formar agregados (

Discusión

Las técnicas estructurales basadas en espectrometría de masas, incluyendo el intercambio de hidrógeno-deuterio, la reticulación química, el etiquetado covalente y la espectrometría de masas de pulverización nativa y la movilidad de iones han crecido rápidamente en popularidad debido a su flexibilidad, sensibilidad y capacidad para manejar mezclas complejas. FPOP cuenta con varias ventajas que han aumentado su popularidad en el área de técnicas estructurales basadas en espectrometría de masas. Al igual que la m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Acros Organics	147440250	Soluble in water upto 3.5 mM
Aperture	Edmund Optics	39-905	1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture
Aperture holder	Edmund Optics	53-287	25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount
Catalse	Sigma Aldrich	C-40	Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein
COMPex Pro laser	Coherent	1113836	COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl
Dithiotheitol (DTT)	Promega	V3151	DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)
Fraction collector	GenNext Technologies, Inc.	N/A	Automated fraction collector
Fused silica capillay	Molex	1068150023	Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375
Glutamine	Acros Organics	119951000	L(+)-Glutamine, 99%
Holder for lens	Edmund Optics	03-668	53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H325-100	Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical
LC-MS/MS system	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBCX	Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer
Mas spec grade Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-1	Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade formic acid	Fisher Scientific	A117-50	Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade water	Fisher Scientific	W6-4	Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES buffer	Sigma Aldrich	M0164	MES hemisodium salt
Methionine amide	Bachem	4000594.0005	H-met-NH2.HCl
Micro V clamp	Thor Labs	VK250	Micro V-clamp with stainless steel blades
Motorized stage	Edmund Optics	68-638	50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control
Nano C18 colum	Thermo Scientific	164534	Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Optical bench	Edmund Optics	56-935	18" x 18" breadboard
Pioneer FPOP Module System	GenNext Technologies, Inc.	N/A	Inline FPOP Radical Dosimetry System
Post holder	Edmund Optics	58-979	3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder
Sodium phosphate dibasic	Fisher Scientific	BP331-500	Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents
Sodium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP330-500	Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents
Syringe	Hamilton	81065	100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3
Syringe pump	KD Scientific	788101	Legato 101 syringe pump
Trap C18 column	Thermo Scientific	160454	Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Tris	Sigma Aldrich	252859	Tris(hydroxymethyl)aminomethane
Trypsin	Promega	V5111	Sequencing Grade Modified Trypsin
UV plano convex lens	Edmund Optics	84-285	30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens