Un modelo biomimético para el cáncer de hígado para estudiar las interacciones tumorales-estroma en un entorno 3D con propiedades biofísicos ajustables

Resumen

Este protocolo presenta un modelo biomimético 3D con compartimento estromal fibromático que lo acompaña. Preparado con hidrogeles fisiológicamente relevantes en proporciones que imitan las propiedades biofísicas de la matriz extracelular estromal, un mediador activo de interacciones celulares, crecimiento tumoral y metástasis.

Resumen

El carcinoma hepatocelular (HCC) es un tumor hepático primario que se desarrolla a raíz de la enfermedad hepática crónica. La enfermedad hepática crónica y la inflamación conducen a un ambiente fibroso que apoya y conduce activamente la hepatocarcinogénesis. La comprensión de la hepatocarcinogénesis en términos de la interacción entre el microambiente del estroma tumoral y las células tumorales es, por lo tanto, de considerable importancia. Los modelos tridimensionales (3D) de cultivo celular se proponen como el eslabón que falta entre los modelos actuales de cultivo celular 2D in vitro y los modelos animales in vivo. Nuestro objetivo era diseñar un nuevo modelo HCC biomimético 3D con compartimento estromal fibromático y vasculatura. Se incorporaron hidrogeles fisiológicamente relevantes como el colágeno y el fibrinógeno para imitar las propiedades biofísicas del ECM tumoral. En este modelo, las células LX2 y HepG2 incrustadas en una matriz de hidrogel se sembraron en la plaquita transmembrana invertida. Las células HUVEC fueron entonces sembradas en el lado opuesto de la membrana. Se prepararon tres formulaciones consistentes en ECM-hidrogeles incrustados con células y las propiedades biofísicas fueron determinadas por la reología. La viabilidad celular fue determinada por un ensayo de viabilidad celular durante 21 días. El efecto de la droga quimioterapéutica doxorubicina fue evaluado tanto en co-cultivo 2D y nuestro modelo 3D durante un período de 72h. Los resultados de la reología muestran que las propiedades biofísicas de un hígado fibroso, cirrhotic y HCC se pueden imitar con éxito. En general, los resultados indican que este modelo 3D es más representativo de la situación in vivo en comparación con las culturas 2D tradicionales. Nuestro modelo tumoral 3D mostró una disminución de la respuesta a la quimioterapéutica, imitando la resistencia a los fármacos que normalmente se observa en los pacientes con HCC.

Introducción

El carcinoma hepatocelular (HCC) comprende el 90% de todos los cánceres de hígado primarios^1,2. Con 810.000 muertes y 854.000 nuevos casos notificados anualmente, actualmente se sitúa como el quinto cáncer más común a nivel mundial con una de las mayores incidencias de mortalidad^1. El desarrollo del HCC se atribuye principalmente a la inflamación asociada con enfermedades hepáticas crónicas a saber, hepatitis viral, ingesta excesiva crónica de alcohol, síndrome metabólico, obesidad y diabetes^1,3,4.  La inflamación asociada con estas condiciones patológicas resulta en lesión de hepatocito y secreción de varias citoquinas que activan y reclutan células estelares hepáticas y células inflamatorias para iniciar fibrosis^5. Las células estelares hepáticas son conocidas por su papel clave en la iniciación, progresión y regresión de la fibrosis hepática. Tras la activación se diferencian en miofibroblasto como células con propiedades contractiles, proinflamatorias y pro-fibrinogénicas^6,7,8. La fibrosis resultante, a su vez, provoca la desregulación de la actividad enzimática de remodelación de matriz extracelular, creando un entorno caracterizado por un aumento general de la rigidez acompañado de la secreción de factores de crecimiento, lo que contribuye además a la patogénesis HCC^9,10. Es este bucle de retroalimentación patógena continua entre los hepatocitos y el entorno estromal, que alimenta la iniciación del cáncer, transiciones epiteliales a mesenquimales (EMT), angiogénesis, potencial metastásico, y respuesta alterada del fármaco^11,12,13.  La visión de la hepatocarcinogénesis en términos de la interacción entre el tumor y el microambiente tumoral es, por lo tanto, de considerable importancia no sólo desde una perspectiva mecanicista sino también desde una perspectiva de tratamiento.

Los modelos de cultivo celular in vitro bidimensional (2D) son utilizados predominantemente por el 80% de los biólogos de células cancerosas^14. Sin embargo, estos modelos no son representativos del verdadero microambiente tumoral, que afecta a las respuestas quimioterapéuticas^14,15,16. Actualmente el 96% de los fármacos quimioterapéuticos fallan durante los ensayos clínicos^14.  Esta alta incidencia en las tasas de desgaste de fármacos puede atribuirse al hecho de que los modelos de pre-cribado in vitro disponibles no representan plenamente nuestra visión y comprensión actuales de la complejidad del HCC y el microambiente^16. Por el contrario, los modelos animales in vivo presentan sistemas inmunológicos comprometidos y discrepancias en las interacciones entre el tumor y el microambiente en comparación con los seres humanos^16,17. En promedio, sólo el 8% de los resultados obtenidos de estudios en animales se pueden traducir de forma fiable desde lo preclínicos al entorno clínico^16,17. Por lo tanto, está claro que la evaluación del HCC requiere el desarrollo de una plataforma in vitro que recapitula eficazmente la complejidad no sólo del tumor, sino también del microambiente. Las plataformas complementarían los modelos de cribado preclínico in vitro actualmente disponibles y reducirían la cantidad de estudios en animales en los próximos^7,14.

Una de estas plataformas son los modelos avanzados de cultivo celular tridimensional (3D). Una multitud de estos modelos 3D avanzados para estudiar HCC han surgido en la última década y se han publicado varias revisiones. Los modelos 3D disponibles para estudiar HCC incluyen esferoides multicelulares, organoides, modelos a base de andamios, hidrogeles, microfluídicos y bioimpresión. De ellos, los esferoides multicelulares son uno de los modelos más conocidos utilizados en el estudio del desarrollo tumoral. Los esferoides son un modelo barato con baja dificultad técnica y al mismo tiempo imitan eficazmente la arquitectura tumoral in vivo^18,19,20. Los esferoides multicelulares han contribuido a una gran cantidad de información sobre HCC^17,21,22. Sin embargo, falta tiempo de cultivo estandarizado, ya que los esferoides multicelulares se mantienen en la cultura entre 7 y 48 días. El aumento del tiempo de cultivo es de considerable importancia. Eilenberger encontró que las diferencias en la edad esferoide influyen profundamente en Sorafenib (un inhibidor de la quinasa utilizado para el tratamiento de los cánceres de hígado) difusividad y toxicidad²³. Mientras wrzesinski y Fey encontraron que los esferoides hepatocitos 3D requieren 18 días para restablecer las funciones hepáticas fisiológicas clave después de la trippsinización y continúa exhibiendo la funcionalidad estable hasta 24 días después de esta recuperación^24,25.

Algunos de los modelos de HCC 3D más avanzados incluyen el uso de andamios hepáticos descelularizados humanos y andamios bioimpresos. Mazza y sus colegas crearon un andamio 3D natural para el modelado HCC utilizando hígados humanos descelularizados no aptos para trasplante^26. Estos andamios naturales podrían repoblarse con éxito durante 21 días con un co-cultivo de células de stellato hepático y hepatoblastoma, manteniendo la expresión de componentes clave de matriz extracelular como colágeno tipo I, III, IV y fibronectina. Además del modelado de enfermedades, este modelo también ofrece la ventaja del trasplante funcional de órganos y el fármaco preclínico y la detección de toxicidad^26. Con los avances en la bioimpresión 3D, los andamios de matriz extracelular 3D ahora también se pueden bioimprimer.  Ma y sus colegas, andamios de matriz extracelular bioimpresos con propiedades mecánicas variables y microarquitectura biomimética utilizando hidrogeles ingeniero de matriz extracelularizada descelularizada^27. Sin duda, todos estos son excelentes modelos 3D HCC. Sin embargo, la falta de disponibilidad de hígados humanos y el costo involucrado en la adquisición de los equipos y materiales necesarios coloca estos modelos en desventaja. Además, todos estos métodos son técnicamente avanzados que requieren una formación extensa que puede no estar disponible para todos los investigadores.

Basándonos en la complejidad del HCC y los modelos 3D disponibles actualmente, nos esforzamos por desarrollar un modelo HCC 3D que abarca todo. Buscamos un modelo capaz de recapitular tanto el microambiente premalignante como el tumor incorporando valores ajustables de rigidez del hidrogel.  Además, también incluimos líneas celulares asociadas a hepatocelulares y estroma, que desempeñan un papel clave en la patogénesis del HCC. Estos incluyen células endoteliales, células estelares hepáticas y hepatocitos malignos, cultivados en un microambiente compuesto de hidrogeles fisiológicamente relevantes. Con los hidrogeles elegidos, colágeno tipo I y fibrinógeno, incorporados en proporciones comparables a los cambios biofísicos observados en la rigidez hepática durante el inicio y progresión del HCC.  Además, buscamos un modelo que pudiera mantenerse en la cultura durante un período de tiempo prolongado. Imaginamos un modelo modular y rentable que se puede configurar con equipos básicos, un entrenamiento y experiencia mínimos y materiales fácilmente disponibles.

Protocolo

Figura 1: Representaciones gráficas de la creación del modelo HCC biomimético 3D Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: El flujo de trabajo general de este protocolo se establece en las ilustraciones de la Figura 1

1. Preparación de la solución de stock de fibrinógenos

1. Preparar una solución de 1 M de cloruro de calcio (CaCl_2),pesando 2,21 g de CaCl₂ y agregándola a 20 ml de agua destilada (dH₂O). La solución de stock se puede almacenar a temperatura ambiente (RT).
2. Preparar una solución de stock de aprotinin de 20 ml (1218,75 KIU/ml) pesando 5 mg de aprotinina y agregándola a 20 ml dH₂O. Aliquot solución de stock en 1 mL de alícuotas y almacenar a -20 °C.
3. Preparar una solución de 10 ml de 80 mg/ml de caldo de fibrinógeno.
   1. En un tubo de 50 ml añadir 7.849 mL fosfato solución salina tamponada (PBS), 2.051 mL aprotinin stock (1218.75 KIU/ml) para una concentración final de aprotinin de 250 KIU/mL y 100 μL CaCl₂ (1M) para una concentración final de CaCl₂ de 10 mM.
   2. Pesar 800 mg de fibrinógeno.
   3. Pesar 200 mg de cloruro sódico (NaCl) para que la solución de stock contenga 2% w/v NaCl.
   4. Añada el fibrinógeno y el NaCl en incrementos al tubo de 50 ml que contiene el PBS, la aprotinin y el CaCl_2. No revuelva ni agite vigorosamente, ya que esto dará lugar a gelificantes de fibrinógenos y bultos que se forman en la solución.
   5. Coloque horizontalmente el tubo de 50 ml de la solución de stock de fibrinógenos sobre una coctelera y agite a un ajuste bajo de 300 rpm.
4. Una vez disuelta la solución, filtrela utilizando un filtro de jeringa de 0,22 μm o un filtro superior de botella dependiendo del volumen. Es importante destacar, no autoclave la solución fibrinógeno ya que esto destruirá el fibrinógeno.
   NOTA: Esta parte del protocolo puede tomar entre 2 y 5 h dependiendo de la cantidad de solución de stock, esta vez debe tenerse en cuenta durante la configuración experimental.

2. Recubrimiento de plaquitas con colágeno antes de sembrar los hidrogeles en las plaquitas

1. En una campana de flujo laminar o una campana de cultivo tisular, utilizando pinzas esterilizadas, retire los insertos de la placa y colóquelos invertidos en la tapa de la placa.
2. Prepare una solución de 100 ml de 20 mM de ácido acético glacial añadiendo 115 μL de ácido acético glacial a 25 ml de dH₂O y ajuste a un volumen final de 100 ml con dH₂O. Filtre la solución utilizando un filtro de jeringa de 0,22 μm. La solución de stock se puede almacenar en RT.
3. Preparar 2 ml de una solución de colágeno de 100 μg/ml de una solución de colágeno de 5 mg/ml añadiendo 40 μL de la solución de colágeno de 5 mg/ml a 1.960 ml de la solución de 20 mM de ácido acético glacial preparada en 2,2.
4. Cubra las plaquitas con la solución de colágeno de 100 μg/ml preparada en 2,3 pipeteando 100 μL de la solución en cada plaquita. Deje que las plaquitas se sequen al aire dentro de la campana de flujo laminar o la campana de cultivo tisular durante 2 a 3 h.
5. Una vez que las plaquitas hayan secado, lave cada plaquita 3 veces con PBS. Añadir 1 ml de PBS a cada pozo de una placa de 12 pozos, colocar las plaquitas con revestimiento de colágeno hacia abajo en los pozos, eliminar PBS del pozo y repetir el procedimiento. Deje que las plaquitas se sequen al aire dentro de la campana de flujo laminar de 1 a 2 h.
   PRECAUCIÓN: El ácido acético es tóxico para las células y las plaquitas deben lavarse a fondo con PBS.
6. Añadir un espaciador impreso 3D personalizado sobre las plaquitas, esto será necesario una vez que los geles cuelgan de la plaquita para evitar que toquen el pozo inferior de la placa (Figura 2).

Figura 2: Espaciador impreso 3D personalizado Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Cubra las plaquitas invertidas con la parte inferior de la placa y colóquelos en la incubadora hasta que las células estén incrustadas en los hidrogeles y listas para ser sembradas.

3. Células de siembra incrustadas en hidrogeles en plaquitas

NOTA: El Cuadro 1 proporciona una descripción de 3 formulaciones con diferentes concentraciones de fibrinógeno que se prepararán. La formulación uno corresponde al hígado durante la aparición de fibrosis, dos cirrosis y tres HCC, los valores de rigidez para cada una de estas formulaciones se determinaron con reología durante la optimización del protocolo.

Formulación	Concentración final de fibrinógenos (mg/ml)	Concentración final de colágeno (mg/ml)	Células (LX2 + HepG2 Co-cultivo 1:1)	Etapa del hígado	Valores de rigidez hepática de la literatura (kPa)	Valor de rigidez del modelo de Rheology (kPa)	Formulación	Fibrinógeno para añadir (mL)	Colágeno para añadir (mL)	10 % DMEM (mL)	Trombo (μL)	Referencias
1	10	2	2 x 106 células/ml	Fibrosis	≥2	3	1	1	0.8	0.2	4	28; 29; 30
2	30	2	2 x 106 células/ml	Cirrosis		6	2	0.75	0.8	0.45	3
3	40	2	2 x 106 células/ml	Hcc	≥10	10	3	0.25	0.8	0.95	1	28; 11y 32

Tabla 1: Descripción de formulaciones para células de siembra incrustadas en hidrogeles en plaquitas

1. Preparar solución de 1 M de material de hidróxido de sodio añadiendo 3,99 g de NaOH a 100 ml de dH₂O.  A continuación, la solución se puede filtrar mediante un filtro de jeringa de 0,22 μm. Almacene la solución de stock en RT.
2. Coloque el colágeno de 5 mg/ml y 10 ml de 1 M NaOH sobre hielo.
3. Precalentar 50 mL PBS, 15 mL trypsin, 70 mL 10% DMEM, y solución de stock de fibrinógenos, preparado en la sección 1, a 37 °C durante 20 minutos en un baño de agua.
4. Prepare las suspensiones celulares.
   1. Lave las células estelares hepáticas (LX2) y las células de carcinoma hepático (HepG2) en matraces de cultivo T175 dos veces con 10 ml de PBS.
   2. Pruebe células con 6 mL de trippsina durante 4 minutos a 37 °C.
   3. Inactivar trypsin con 6 ml de 10% DMEM.
   4. Recoger la suspensión celular en tubo de 15 ml y centrífuga durante 3 min a 300 x g.
   5. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspend cada línea celular en 5 ml de 10% DMEM.
   6. Cuente las celdas utilizando un contador de celdas automatizado: Agregue 10 μL de cada suspensión celular a la diapositiva de la cámara de recuento e inserte la diapositiva en el contador de celdas. El recuento de celdas se muestra como celdas/ml.
   7. Diluya las células de cada línea celular a 1 x 10⁶ células por ml utilizando el recuento de células en el paso 3.4.6 en tubos claramente marcados de 15 ml. Centrífuga las diluciones durante 3 min a 300 x g.
5. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y añadir 10% DMEM a cada tubo de 15 ml de acuerdo con la Tabla 1,los valores proporcionados en la Tabla es para 2 ml de cada formulación.
6. Neutralizar la cantidad de colágeno con 10 μL/mL NaOH (1 M), y añadir el colágeno neutralizado a la suspensión celular, el 10% DMEM presente se volverá amarillo, una vez que la suspensión se mezcle a fondo por pipeteo con una punta de corte se convertirá en un rosa brillante.
7. Agregue fibrinógeno a la suspensión celular de colágeno de acuerdo con la Tabla 1, usando una punta de pipeta cortada, mezcle la suspensión a fondo.
8. Finalmente añadir trombonas a la suspensión celular colágeno-fibrinógeno, 0.1 PALU trombina por cada 10 mg de fibrinógeno.
9. Retire las plaquitas invertidas precubiertas preparadas en la sección 2 de la incubadora y utilizando una punta de pipeta de 200 μL cortada, pipeta 200 μL de la suspensión preparada en las plaquitas designadas. Deje que los geles se reenvíen durante 15 minutos dentro de la campana de flujo laminar.
10. Después de 15 min, coloque suavemente la sección inferior de la placa sobre los geles y muévalos a la incubadora para permitir que los geles se reenvíen a 37 °C durante 45 min.
11. Una vez que los geles se hayan cruzado, invierta las plaquitas de nuevo y agregue 2 ml de 10% DMEM a cada uno de los pozos inferiores de la placa.

4. Siembra de células endoteliales

1. Precalentar 25 ml hanks solución de sal equilibrada (HBSS), 10 mL trypsina, 10 mL inhibidor de la trippsina y 50 mL medio de crecimiento endotelial, a 37°C durante 20 min en un baño de agua.
2. Prepare la suspensión celular endotelial (HUVEC).
   1. Lave las células HUVEC en frascos de cultivo T175 dos veces con HBSS de 10 ml.
   2. Pruebe células con 6 mL de trippsina durante 4 minutos a 37 °C. Inactivar la trippsina con un inhibidor de la trippsina de 6 ml. Recoger la suspensión celular en 15 ml de tubo y centrífuga durante 3 min a 200 x g.
   3. Después de la centrifugación aspirar el sobrenadante y suspender las células en 5 mL medio de crecimiento endotelial.
   4. Cuente las celdas como se describió anteriormente en 3.4.6 mediante un contador de celdas automatizado.
   5. Usando el recuento de células desde el contador de células, prepare la densidad de siembra de 1.0 x 10⁴ células/ml en medio de crecimiento endotelial.
3. Semilla 500 μL de la suspensión de la célula HUVEC en cada pozo de la parte superior de la plaquita para tener un volumen final de 5,0 x 10³ celdas por plaquita.

5. Mantenimiento

1. Reemplace el medio de crecimiento cada segundo día, aspirar el medio de crecimiento gastado tanto del pozo como de la plaquita. Añadir 2 mL 10% DMEM a los pozos que contienen el gel y 0,5 mL medio de crecimiento endotelial a las plaquitas que contienen las células HUVEC.
2. Mantenga el modelo durante 21 días antes de la experimentación.

6. Reología

1. Mida el moduli de almacenamiento de formulaciones de gel para indicar los valores de rigidez utilizando un reómetro, realizando barridos de frecuencia de 0,1 a 20 Hz a 0,267% y 37°C, con una fuerza axial constante de 0,1N utilizando una geometría de acero inoxidable de placa paralela de 8 mm de diámetro.

7. Viabilidad y respuesta a las drogas

1. Determinar la respuesta y viabilidad del fármaco en co-cultivos 2D y modelo 3D.
   1. Células HepG2 de semillas (5,0 x^{10 3} celdas/ml) y LX2 (5,0 x^{10 3} celdas/ml) en una relación de 1:1 para el co-cultivo 2D en una parte inferior clara negra de 96 pozos a una densidad de siembra de 1,0 x 10⁴ células/ml.  Permita que las células se conecten durante la noche.
   2. Configure el modelo 3D para que corresponda a un entorno cirrhotic con un valor de rigidez de 6 kPa.  Mantenga el modelo durante 21 días antes del tratamiento con doxorubicina.
2. Dos horas antes del tratamiento con doxorubicina, aspirar el medio cultural tanto del modelo 2D como del 3D. Lave ambos modelos dos veces con PBS. Añadir el medio de inanición (DMEM complementado con 1% v/v solución antimicótica) al co-cultivo 2D (200 μL por pozo) y al modelo 3D (2 ml a los pozos que contienen el hidrogel y 500 μL a la plaquita).
3. Administre doxorubicina al modelo 2D y 3D.  Las dosis son las siguientes: 0,5, 1 y 1,5 mM correspondientes a los valores IC25, 50 y 75, respectivamente.  Trate ambos modelos durante 72 h.
   NOTA: La doxorubicina, un inhibidor de la topoisomerasa II, es uno de los primeros fármacos quimioterapéuticos utilizados para el HCC y también es uno de los agentes quimioterapéuticos más activos en el tratamiento de HCC^33,34.
4. Después de las 72 h, el medio cultural aspirado tanto del modelo 2D como del 3D. Asegúrese de que cualquier medio de cultivo restante se elimina lavando ambos modelos dos veces con PBS.
5. Prepare AlamarBlue de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y agregue a los pozos del modelo 2D y 3D. Añadir 150 μL por pozo para el cultivo 2D y 2 ml por pozo y 500 μL por plaquita para cultivo 3D.  Incubado durante la noche a 37°C.
6. Después de la transferencia de incubación 150 μL del AlamarBlue de cada pozo de la configuración 3D en una placa negra de 96 pozos. AlamarBlue se puede leer directamente desde la placa para el modelo 2D.
7. Lea la fluorescencia con un lector de microplacas a longitud de onda de excitación y longitud de onda de emisión de 485 y 550 nm, respectivamente.
8. Calcule la viabilidad de las celdas porcentuales en ambos modelos utilizando la siguiente fórmula:
   

Resultados

Rangos de concentración y volumen de siembra
La optimización del protocolo para obtener el protocolo de funcionamiento final se produjo según el diagrama esquemático presentado en la figura 3. Dos hidrogeles fisiológicamente relevantes, collagen tipo I y Fibrinogen, fueron identificados mediante una búsqueda literaria^35,36.  Comenzando con colágeno de cola de rata tipo I, una gama de concentraciones (4, 3, 2 y 1 mg/ml) fue sembrada en inserciones invertidas para determinar su capacidad para adherirse con éxito a la plaquita una vez invertido de nuevo. Todas las concentraciones dentro de este rango fueron capaces de formar geles, sin embargo los geles de colágeno parecían aplanados y tenían varias burbujas de aire atrapadas dentro de ellos debido a la manipulación y pipeteo, ver Figura 4 y Figura 5. Para determinar el volumen óptimo de siembra para mejorar la calidad del gel de colágeno, se clasificó una gama de volúmenes de siembra (100, 150 y 200 μL) en plaquitas invertidas, véase la Figura 5.  El volumen de siembra no influyó en la apariencia del gel ni en la presencia de burbujas dentro del gel. En consecuencia, se decidió que 200 μL era el volumen de siembra óptimo que producía los geles más completos. Fibrinógeno también fue evaluado por su capacidad para producir un gel que podría adherirse a una plaquita durante un período de tiempo prolongado.  Se preparó un rango de concentración (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/ml) y se plantó a un volumen de 200 μL en la tapa de una placa de 12 pozos, véase la Figura 6. A menos de 20 minutos después de sembrar todas las concentraciones fueron capaces de formar con éxito un gel. Sin embargo, las concentraciones de 5 y 1 mg/ml fueron excluidas ya que los geles formados tenían un líquido similar a la consistencia y habían comenzado a desprenderse de la tapa después de permanecer durante la noche a 37 °C.

Figura 3: Diagrama esquemático de optimización de protocolos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Geles de colágeno 4 mg/ml que contienen 1,0 x 10⁵ células/ml de semillas en plaquitas que muestran burbujas presentes en el gel. Inserte a la izquierda se desgascó en hielo durante 15 minutos, mientras que el inserto a la derecha no se ha desgasificación. La desgasificación no tuvo ningún efecto en las burbujas presentes en los geles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Geles de colágeno 4 mg/ml que contienen 1,0 x 10⁵ células/ml de semillas en plaquitas en diferentes volúmenes. (A) Insertar a la izquierda 100 μL, medio 150 μL y derecha 200 μL, directamente después de la siembra. Las burbujas en los geles seguían presentes. (B) Insertar a la izquierda 200 μL, medio 150 μL y derecha 100 μL, después de 60 min de enlace cruzado. Todos los geles, independientemente del volumen, siguen apareciendo planos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Fibrinógeno (200 μL) en un rango de concentración de 70 a 1 mg/ml de semilla en la tapa de una placa de 12 pozos. (A) Geles directamente después de la siembra. (B) Geles 20 min después de la siembra. (C) Geles guardados durante la noche. Todos los geles parecen bien redondeados, los geles de 5 mg/ml y 1 mg/ml fueron excluidos, ya que parecían tener una consistencia más fluida 20 minutos después de la siembra y habían comenzado a desprenderse de la tapa después de ser mantenidos durante la noche. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Combinación de colágeno y fibrinógeno
Basándose en los resultados de los rangos de concentración de colágeno y fibrinógenos se evaluó el efecto de combinar el colágeno y el fibrinógeno. Se configuraron tres plaquitas con lo siguiente, colágeno de 4 mg/ml, fibrinógeno de 20 mg/ml y una ración de 1:1 de colágeno (4 mg/ml) y fibrinógeno (20 mg/ml), véase la Figura 7. Directamente después de sembrar los hidrogeles, observamos que la plaquita con colágeno solo todavía tenía un aspecto plano combinado con la aparición de burbujas dentro del gel. Las plaquitas con fibrinógeno produjeron un gel completo y redondeado, al igual que el inserto con la combinación de colágeno y fibrinógeno. Después de la unión cruzada a 37 °C durante 60 min, todos los geles se habían unido a la plaquita y permanecieron unidos después de la incubación nocturna a 37 °C.

Figura 7: Efecto de la combinación de colágeno y fibrinógeno. (A) Colágeno 4 mg/ml de semilla sobre inserción a la izquierda, fibrinógeno 20 mg/ml de semilla en insertar en el medio y colágeno 4 mg/ml, fibrinógeno 20 mg/ml (1:1 ración) sembrado en insertar a la derecha. Todos los geles sembrados a un volumen de 200 μL que contiene 1,0 x 10⁵ células/ml, todos los geles fueron reticulados durante 60 minutos a 37 °C. (B) Colágeno 4 mg/ml 60 min después de cruzar, gel apareció plano y tenía burbujas. (C) Insertar en el fibrinógeno izquierdo 20 mg/ml, el gel aparece redondeado, no hay burbujas presentes, insertar en el colágeno derecho 4 mg/ml, fibrinógeno 20 mg/mL gel, gel está bien redondeado sin burbujas. (D) Colágeno 4 mg/mL gel después de permanecer durante la noche a 37 °C, gel todavía contenía una gran cantidad de burbujas, se ha producido alguna hinchazón del gel. (E) Fibrinógeno 20 mg/ml mantenido durante la noche a 37 °C. (F) Colágeno 4 mg/ml, fibrinógeno 20 mg/mL gel mantenido durante la noche a 37 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Determinación de la densidad de siembra celular
Sobre la base de la experiencia previa de trabajar con hidrogeles se configuró un experimento para determinar la densidad óptima de siembra celular (datos no mostrados)³⁷. Las células se incrustaron en una combinación de colágeno y fibrinógeno en el siguiente rango de concentración (7,5 x 10^5,8,5 x 10^5,9,5 x 10^5,1,0 x 10⁶, 1.5 x 10⁶ y 2.0 x 10⁶ células / ml), 2.0 x 10⁶ células / ml se encontró que es la densidad óptima de siembra.

Reología
Se evaluaron diez formulaciones de las combinaciones de fibrinógeno e hidrogel de colágeno mediante reología, véase la Tabla 2. El objetivo era determinar cuál de estas formulaciones podía imitar la rigidez hepática observada durante el desarrollo del HCC. La literatura proporcionó valores conocidos de rigidez hepática para ratas, ratones y humanos durante la fibrosis, cirrosis y HCC y el objetivo era acercarse lo más posible a estos valores^{28,29,30,31,32.} Las diez formulaciones establecidas en el Cuadro 2 se prepararon en triplicado y el módulo de almacenamiento de cada una se determinó mediante un reómetro, resultados que se muestran en la Figura 8.

Formulación	Fibrinógeno (mg/ml)	Colágeno (mg/ml)
1	60	2
2	50	2
3	40	2
4	30	2
5	20	2
6	10	2
7	20	5
8	20	4
9	20	3
10	20	1

Tabla 2: Combinaciones de colágeno y fibrinógeno en varias concentraciones evaluadas con Reología para determinar los valores de rigidez

Figura 8: Valores de rigidez del hidrogel para combinaciones de colágeno y fibrinógeno en varias concentraciones evaluadas con reología. El módulo de almacenamiento y el módulo de pérdida se determinaron a 37 °C y 1Hz mediante un reómetro híbrido Discovery HR-2 (n = 3, barras de error = SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

De estas diez fórmulas se eligieron tres para proceder. Estos incluían 2 mg/ml de colágeno tipo I y 10 mg/ml de fibrinógeno correspondientes a los valores de rigidez hepática al inicio de la fibrosis, 2 mg/ml de colágeno tipo I y 30 mg/ml de fibrinógeno correspondientes a cirrosis y 2 mg/ml de colágeno tipo I y 40 mg/mL fibrinógeno correspondientes al HCC, ver Figura 9.

Figura 9: Valores de rigidez del hidrogel para varias formulaciones de hidrogel fibrinógeno/colágeno elegidos para continuar.  Módulo de almacenamiento y módulo de pérdida se determinaron a 37 °C y 1 Hz (n = 3, Barras de error = SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Viabilidad, respuesta a fármacos y potencial metastásico
Los resultados del ensayo AlamarBlue mostraron una viabilidad celular reducida general dentro de la co-referencia cultural 2D, inferior a lo esperado en función de los valores ic 25, 50 y 75 notificados conocidos, en comparación con el control no tratado, consulte la figura 10. Esto puede atribuirse a las células LX2 en nuestro co-cultivo que son más sensibles al tratamiento con Doxorubicina. Sin embargo, en nuestro modelo 3D nos dimos cuenta y aumentamos en la resistencia a la doxorubicina, confirmando la disminución del potencial quimioterapéutico a menudo visto en los sistemas de modelos 3D. La importancia estadística en comparación con los controles se evaluó utilizando la prueba de T del estudiante (de dos colas), con P<0.05 considerado significativo.

Figura 10: Porcentaje de viabilidad celular de un modelo de co-cultivo 2D en comparación con el modelo 3D después del tratamiento con Doxorubicina en varias concentraciones durante un período de 72h. Resultados normalizados en relación con el control no tratado (n=3, barras de error = SD) (* = p<0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las construcciones de gel fueron inspeccionadas visualmente diariamente utilizando un microscopio de luz para seguir el crecimiento celular dentro de diferentes concentraciones de los hidrogeles. Las células llenaron los hidrogeles de una manera homogénea y compacta, a partir del día 7 los esferoides comenzaron a ensamblarse dentro de la matriz.

Discusión

Este protocolo describe el desarrollo de un método para crear un modelo biomimético para HCC. Se ha establecido un flujo de trabajo claro y se han identificado los pasos críticos implicados. Estos pasos críticos incluyen, la preparación de la solución de caldo de fibrinógeno, el recubrimiento de las plaquitas con colágeno y la siembra de las células incrustadas en el hidrogel. Durante la preparación de la solución de stock de fibrinógeno es importante añadir el fibrinógeno en incrementos más pequeños a concentraciones más altas. Esto no sólo reducirá el tiempo que tarda el fibrinógeno en disolverse, sino que también evitará que el fibrinógeno gelifica de forma inconsistente y prematura como se ve en la Figura 11. La preparación del gel fibrinógeno toma una cantidad considerable de tiempo y esto puede influir en el éxito experimental general. Los resultados indican que una vez que el gel fibrinógeno comienza a gel inconsistentemente es mejor descartarlo. Las plaquitas deben ser recubiertas con colágeno, lavadas con PBS y secas dentro de la campana de flujo laminar antes de sembrar las células incrustadas en hidrogeles. Si no se asegura de que las plaquitas estén secas, los hidrogeles se derramarán sobre los bordes de la plaquita, lo que dará lugar a un gel desigual. La irregularidad del gel influirá en última instancia en los resultados donde la difusión es un factor.

Figura 11: Preparación de gel fibrinógeno para formulaciones de fibrinógeno/hidrogel de colágeno. (A) Solución de gel Fibrinogen que ha formado grumos y comenzó a gelificar prematuramente con fibrinógenos no resueltos adheridos al tubo. (B) Solución de gel Fibrinogen que se ha disuelto por completo, solución es clara y ligeramente más viscosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se recomienda trabajar lo más rápido posible mientras se siembra la suspensión de la célula de hidrogel en las plaquitas, ya que el componente fibrinógeno comenzará a reenlazar con la adición de trombina.  Prepare volúmenes de trabajo más pequeños en un momento en que trabaje con suspensiones de gel a concentraciones más altas para evitar que el gel se relacione durante la siembra. Este último tendrá un efecto en la distribución y la cantidad de semilla de gel en cada pozo. El orden de agregar los componentes es fundamental, en este protocolo proporcionamos un flujo de trabajo simplificado para evitar que los geles se reenvíen prematuramente.  Debido a la viscosidad de la suspensión del gel de hidrogel que trabaja con una punta de pipeta cortada se recomienda durante la mezcla y medición.  Al mezclar la suspensión asegúrese de que esto se hace rápida y uniformemente para crear una suspensión homogénea. La mezcla desigual dará como resultado un gel heterogéneo que afectará negativamente a los resultados, ver Figura 12.

Figura 12: Geles de colágeno/fibrinógenos sembrados en 12 placas de pozo. Todos los geles sembrados a un volumen de 200 μL que contienen colágeno de 2mg/ml y fibrinógeno de 20 mg/ml con 2,0 x 10⁶ células/ml. (A) Gel de hidrogel con consistencia heterogénea, distribución irregular visible de los hidrogeles. (B) Hidrogeles mezclados homogéneamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tras la optimización del protocolo, se evaluó el modelo para determinar las propiedades biofís físicas de los modelos. Los datos de reología mostraron que nuestro modelo, compuesto por componentes de matriz extracelular fisiológicamente relevantes a^saber,colágeno tipo I y fibrinógeno, fue capaz de imitar las propiedades biofísicas de un hígado fibroso, cirrhotic y HCC^{28,29,30,31,32}. Recapitular la rigidez hepática en modelos 3D para HCC es de considerable importancia y a menudo se pasa por alto durante el desarrollo del modelo. Aumento de la rigidez hepática está relacionado con resistencia quimioterapéutica, proliferación, migración, y la latencia dentro de en HCC^38. Mientras que la activación de las células estelares hepáticas en HCC se asocia con el aumento de la rigidez de la matriz extracelular, con varias vías de señalización asociadas con estas células estelares hepáticas que muestran mecanosensibilidad³⁹.

La inclusión de células asociadas al estroma como las células estelares hepáticas y la célula endotelial en el desarrollo de modelos 3D para HCC se ha vuelto cada vez más relevante. Los estudios demuestran que los esferoides multicelulares compuestos de stellato hepático y células HCC resultaron en una mayor resistencia quimioterapéutica y migración invasiva, al tiempo que imitaron la apariencia del tumor HCC in vivo, en comparación con un modelo de ratones PXT y muestras de tejido HCC humano^17. Un estudio similar de Jung et al., 2017 encontró esferoide multicelular que consiste en carcinoma hepatocelular (Huh-7) y células endoteliales (HUVEC) promovieron la vascularización y la agresividad^22. Estos esferoides mostraron viabilidad a concentraciones significativamente más altas de doxorubicina y sorafenib en comparación con los esferoides monocultivos Huh-7^22. La evaluación de la viabilidad y respuesta de nuestro modelo a la doxorubicina, con valores de rigidez correspondientes a la del HCC y la inclusión de células asociadas al estroma (LX2 y HUVEC), mostró una disminución similar en respuesta a la quimioterapéutica en comparación con un modelo de co-cultivo 2D.  Por lo tanto, imitar eficazmente la resistencia a los medicamentos típicamente visto en pacientes y otros modelos de HCC 3D.

Como se trata de un sistema modular, el modelo puede ser fortificado por la adición de otros componentes de matriz extracelulares a saber, laminin y ácido hialurónico. Alternativamente, los hidrogeles actuales utilizados dentro de este modelo pueden ser reemplazados por hidrogeles sintéticos como alginato de sodio o quitosano. Otras modificaciones en el modelo actual pueden ser la sustitución de las líneas celulares con cultivos celulares primarios para producir un modelo aún más fisiológicamente relevante o el uso de combinaciones de otras líneas celulares tumorales y estromales.

Por lo tanto, hemos desarrollado con éxito un modelo 3D con propiedades biofís físicas ajustables para estudiar las interacciones tumorales-estroma en HCC.  Hemos encontrado que nuestro modelo es más representativo de la situación in vivo en comparación con las culturas 2D tradicionales en respuesta a la doxorubicina. Sin embargo, aún queda mucho por hacer, esperamos caracterizar ampliamente este modelo y explorar el modelo como una posible plataforma metastásica para responder a preguntas más complejas y apremiantes que permanecen en el HCC del estudio.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue (Resazurin sodium salt)	Sigma	211-500	Prepare according to manufacturesr recommendations
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized	Sigma	A5955-100ML
Aprotinin Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78432
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C1016-2.5KG	Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0%
CO2 Incubator	Kebo Biomed Sweden
Corning Black, clear flat bottom 96-well plate	Sigma	CLS3904-100EA
Corning HTS Transwell-24 well permeable supports	Sigma	CLS3396-2EA	HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs
Discovery Hybrid Rheometer 2	TA instruments, Sollentuna, Sweden
DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells)	Thermo Fisher Scientific	61965059	Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution
Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC)	Cell Applications, Inc	211-500
Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand	Thermo Fisher Scientific	A3160902
Fibrinogen type I-S from bovine plasma	Sigma	F8630-10G
FLUOstar Omega plate reader	BMG Labtech
Hanks' balanced salt solution	Sigma	H9394-500ML	Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate
Labogene scanspeed 416 centrifuge	Labogene, Sweden
Laminar flow hood	Kebo Biomed Sweden
Mettler Toledo AG245 Analytical Balance	Mettler Toledo
Nikon TMS Light microscope	Nikon, Japan
Phosphate buffered saline tablet	Sigma	P4417-100TAB	Prepare according to manufacturers recommendation
Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL	Ibidi	50201
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-1KG
Sodium Hydroxide (NaOH)	Merck	B619298
TC20 Automated cell counter	BioRad
TC20 cell counter counting slides	BioRad
Thrombin from bovine plasma	Sigma	T9549	Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5)
Trypsin (2.5%) 10x	Thermo Fisher Scientific		Dilute to 1x in PBS
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma	T6414-100ML	Solution, sterile-filtered