Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

Resumen

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Resumen

La fracción estromal-vascular (FSV) del tejido adiposo blanco (WAT) es notablemente heterogénea y consta de numerosos tipos de células que contribuyen funcionalmente a la expansión y remodelación de la WAT en la edad adulta. Un obstáculo tremendo para el estudio de las implicaciones de esta heterogeneidad celular es la incapacidad de aislar fácilmente subpoblaciones celulares funcionalmente distintas de WAT SVF para análisis in vitro e in vivo. La tecnología de secuenciación de células individuales ha identificado recientemente subpoblaciones de células perivasculares PDGFRβ+ fibroinflamatorias y adipogénicas funcionalmente distintas en depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos. Los progenitores fibroinflamatorios (denominados "FIP") son células productoras de colágeno no adipogénicas que pueden ejercer un fenotipo proinflamatorio. Las células precursoras de adipocitos (APC) PDGFRβ+ son altamente adipogénicas tanto in vitro como in vivo tras el trasplante de células. Aquí, describimos múltiples métodos para el aislamiento de estas subpoblaciones de células estromales de depósitos de WAT intraabdominales murinos. Las FIP y las APC pueden aislarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o aprovechando la tecnología de perlas inmunomagnéticas basadas en anticuerpos biotinilados. Las células aisladas se pueden utilizar para el análisis molecular y funcional. El estudio de las propiedades funcionales de la subpoblación de células estromales de forma aislada ampliará nuestro conocimiento actual de la remodelación del tejido adiposo en condiciones fisiológicas o patológicas a nivel celular.

Introducción

El tejido adiposo blanco (WAT) representa el principal sitio para el almacenamiento de energía en los mamíferos. Dentro de este tejido, los adipocitos, o "células grasas", almacenan el exceso de calorías en forma de triglicéridos, empaquetados en grandes gotas lipídicas uniloculares. Además, los adipocitos segregan multitud de factores que regulan diversos aspectos de la homeostasis energética ^1,2,3. Los adipocitos constituyen la mayor parte del volumen de WAT; sin embargo, los adipocitos solo representan menos del 50% del total de células encontradas en WAT^....

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Protocolo

Todos los protocolos y procedimientos para animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas.

1. Aislamiento de la fracción vascular estromal (FSV) a partir de tejido adiposo blanco gonadal

1. Diseccione el tejido adiposo blanco gonadal de ratones de 6 a 8 semanas de edad y coloque almohadillas de grasa en 1 solución de PBS.
2. Combine hasta 4 depósitos de grasa (se recomiendan 2-4 depósitos de 1-2 ratones) y pique el tejido en un vaso de precipitados de 10 ml que contenga 200 μl de tampón de digestión (1x HBSS, 1,5% BSA y 1 mg/mL de c....

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Resultados

Este protocolo describe dos estrategias que permiten el aislamiento de distintas poblaciones de células estromales de depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos. Las APC y FIP pueden aislarse mediante FACS (Figura 1) o separación inmunomagnética de perlas con anticuerpos biotinilados (Figura 2). Ambos enfoques utilizan reactivos y anticuerpos que están disponibles comercialmente. La separación inmunomagnética de perlas conduce a la separación d.......

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Discusión

La cepa de ratones C57BL/6 es la cepa de ratón más utilizada en los estudios de obesidad inducida por la dieta. Los ratones C57BL/6 aumentan rápidamente de peso cuando se les administra una dieta alta en grasas (HFD) y desarrollan algunas de las características prominentes del síndrome metabólico asociado con la obesidad (por ejemplo, resistencia a la insulina e hiperlipidemia). En particular, la expansión de WAT que ocurre en asociación con la alimentación con dieta alta en grasas (HFD) ocurre de manera especí.......

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation
40 and 100 µm cell strainers	Fisher Scientific	352340/352360
1X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	21040CV
5ml polypropylene tubes	Fisher Scientific	352053
Digestion Buffer (for 10mL)
10 ml HBSS	Sigma	H8264
10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)	Roche	11088882001
0.15 g BSA (1.5 % final cc.)	Fisher Scientific	BP1605-100
Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer)	BioLegend	480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)	BioLegend	480019
100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads	BioLegend	480015
Purity Check and FACS
10X Red Blood Cell Lysis Buffer	eBioscience	00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32)	eBioscience	553141
Antibodies
Biotin CD45	BioLegend	103103	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: 30-F11
Biotin CD31	BioLegend	102503	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MEC13.3
Biotin CD9	BioLegend	124803	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MZ3
Biotin LY6C	BioLegend	128003	Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5	BioLegend	102419	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5	BioLegend	103131	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PE	BioLegend	136006	Concentration: Dilution 1:50 Species: Mouse Clone: APB5
LY6C-APC	BioLegend	128016	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: HK1.4
CD9-FITC	BioLegend	124808	Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: MZ3
Cell Culture and Differentiation
Gonadal APC Culture media (for 500mL)
288 mL DMEM with 1 g/L glucose	Corning	10-014-CV
192 mL MCDB201	Sigma	M6770
10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024	Sigma	12303C
5 mL 100% ITS premix	BD Bioscience	354352
5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate	Sigma	A8960-5G
50 µL 100 g/ml FGF-basic	R&D systems	3139-FB-025/CF
5 mL Pen/Strep	Corning	30-001-CI
500 µL Gentamycin	Gibco	15750-060
**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.