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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El propósito de este protocolo es investigar la evolución y expresión de genes candidatos utilizando datos de secuenciación de ARN.

Resumen

Destilar y reportar grandes conjuntos de datos, como datos de genoma completo o transcriptoma, es a menudo una tarea desalentadora. Una forma de desglosar los resultados es centrarse en una o más familias de genes que son importantes para el organismo y el estudio. En este protocolo, se describen los pasos bioinformáticos para generar una filogenia y cuantificar la expresión de genes de interés. Los árboles filogenéticos pueden dar una idea de cómo los genes están evolucionando dentro y entre las especies, así como revelar la ortología. Estos resultados se pueden mejorar utilizando datos de ARN-seq para comparar la expresión de estos genes en diferentes individuos o tejidos. Los estudios de evolución molecular y expresión pueden revelar modos de evolución y conservación de la función génica entre especies. La caracterización de una familia de genes puede servir como trampolín para futuros estudios y puede destacar una familia de genes importante en un nuevo genoma o transcriptoma.

Introducción

Los avances en las tecnologías de secuenciación han facilitado la secuenciación de genomas y transcriptomas de organismos no modelo. Además de la mayor viabilidad de secuenciar adn y ARN de muchos organismos, una gran cantidad de datos está disponible públicamente para estudiar genes de interés. El propósito de este protocolo es proporcionar pasos bioinformáticos para investigar la evolución molecular y la expresión de genes que pueden desempeñar un papel importante en el organismo de interés.

Investigar la evolución de un gen o familia de genes puede proporcionar información sobre la evolución de los sistemas biológicos. Los miembros de una familia de genes se determinan típicamente mediante la identificación de motivos conservados o secuencias de genes homólogos. La evolución de la familia génica se investigó previamente utilizando genomas de organismos modelo distantemente relacionados1. Una limitación a este enfoque es que no está claro cómo evolucionan estas familias de genes en especies estrechamente relacionadas y el papel de las diferentes presiones selectivas ambientales. En este protocolo, incluimos una búsqueda de homólogos en especies estrechamente relacionadas. Al generar una filogenia a nivel de filo, podemos observar tendencias en la evolución de la familia de genes como la de genes conservados o duplicaciones específicas de linaje. En este nivel, también podemos investigar si los genes son ortólogos o parálogos. Si bien es probable que muchos homólogos funcionen de manera similar entre sí, ese no es necesariamente el caso2. La incorporación de árboles filogenéticos en estos estudios es importante para determinar si estos genes homólogos son ortólogos o no. En los eucariotas, muchos ortólogos conservan funciones similares dentro de la célula, como lo demuestra la capacidad de las proteínas de mamíferos para restaurar la función de los ortólogos de levadura3. Sin embargo, hay casos en los que un gen no ortólogo realiza una función caracterizada4.

Los árboles filogenéticos comienzan a delinear las relaciones entre los genes y las especies, sin embargo, la función no se puede asignar únicamente en función de las relaciones genéticas. Los estudios de expresión génica combinados con anotaciones funcionales y análisis de enriquecimiento proporcionan un fuerte apoyo para la función génica. Los casos en los que la expresión génica se puede cuantificar y comparar entre individuos o tipos de tejidos pueden ser más reveladores de la función potencial. El siguiente protocolo sigue los métodos utilizados en la investigación de los genes de opsina en Hydra vulgaris7,pero se pueden aplicar a cualquier especie y cualquier familia de genes. Los resultados de tales estudios proporcionan una base para la investigación adicional en la función del gen y las redes del gene en organismos no-modelo. A modo de ejemplo, la investigación de la filogenia de las opsinas, que son proteínas que inician la cascada de fototransducción, da contexto a la evolución de los ojos y la detección de la luz8,9,10,11. En este caso, los organismos no modelo, especialmente las especies animales basales como los cnidarios o los ctenophores, pueden dilucidar la conservación o los cambios en la cascada de fototransducción y la visión a través de los clados12,13,14. Del mismo modo, la determinación de la filogenia, expresión y redes de otras familias de genes nos informará sobre los mecanismos moleculares subyacentes a las adaptaciones.

Protocolo

Este protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de UC Irvine.

1. Preparación de la biblioteca de ARN-seq

  1. Aísle el ARN usando los métodos siguientes.
    1. Recoger muestras. Si el ARN se va a extraer en un momento posterior, congele la muestra o colótese en la solución de almacenamiento de ARN15 (Tabla de Materiales).
    2. Eutanasiar y diseccionar el organismo para separar tejidos de interés.
    3. Extraer el ARN total utilizando un kit de extracción y purificar el ARN utilizando un kit de purificación de ARN(Tabla de materiales)
      NOTA: Existen protocolos y kits que pueden funcionar mejor para diferentes especies y tipos detejidos 16,17. Hemos extraído ARN de diferentes tejidos corporales de una mariposa18 y una Hidragelatinosa 19 (ver discusión).
    4. Medir la concentración y calidad del ARN de cada muestra (Tabla de Materiales). Utilice muestras con números de integridad de ARN (RIN) superiores a 8, idealmente más cerca de 920 para construir bibliotecas de ADNc.
  2. Construya la biblioteca y la secuencia de cDNA de la siguiente manera.
    1. Cree bibliotecas de cDNA de acuerdo con el manual de instrucciones de preparación de bibliotecas (consulte la discusión).
    2. Determinar la concentración y calidad del ADNc(Tabla de Materiales).
    3. Multiplexa las bibliotecas y secuenciarlas.

2. Acceder a un clúster de computadoras

NOTA: El análisis de ARN-seq requiere la manipulación de archivos grandes y se realiza mejor en un clúster de computadoras(Tabla de materiales).

  1. Inicie sesión en la cuenta de clúster de equipos utilizando el comando ssh username@clusterlocation en una ventana de la aplicación de terminal (Mac) o PuTTY (Windows).

3. Obtener lecturas de ARN-seq

  1. Obtener lecturas de ARN-seq de la instalación de secuenciación o, para los datos generados en una publicación, del repositorio de datos donde se depositaron (3.2 o 3.3).
  2. Para descargar datos de repositorios como ArrayExpress, haga lo siguiente:
    1. Busque en el sitio utilizando el número de acceso.
    2. Busque el vínculo para descargar los datos y, a continuación, haga clic con el botón izquierdo y seleccione Copiar vínculo.
    3. En la ventana de terminal, escriba wget y seleccione Pegar vínculo para copiar los datos en el directorio para su análisis.
  3. Para descargar los datos de NCBI Short Read Archive (SRA), siga estos pasos alternativos:
    1. En el terminal descargue SRA Toolkit v. 2.8.1 usando wget.
      Nota : descargar e instalar programas en el clúster de equipos puede requerir acceso de raíz, póngase en contacto con el administrador de clústeres de equipo si se produce un error en la instalación.
    2. Termine de instalar el programa escribiendo tar -xvf $TARGZFILE.
    3. Busque NCBI para el número de acceso SRA para las muestras que desea descargar, debe tener el formato SRRXXXXXX.
    4. Obtenga los datos de RNA-seq escribiendo [sratoolkit location]/bin/prefetch SRRXXXXXX en la ventana del terminal.
    5. Para archivos de extremo emparejado, escriba [sratoolkit location]/bin/fastq-dump --split-files SRRXXXXXX para obtener dos archivos fastq (SRRXXXXXX_1.FASTQ y SRRXXXXXX_2.FASTQ).
      NOTA: Para hacer un ensamblaje Trinity de novo utilice el comando [sratoolkit location]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files SRRXXXXXX

4. Adaptadores de recorte y lecturas de baja calidad (opcional)

  1. Instale o cargue Trimmomatic21 v. 0.35 en el clúster de computación.
  2. En el directorio donde se encuentran los archivos de datos RNA-seq, escriba un comando que incluya la ubicación del archivo jar trimmomatic, los archivos FASTQ de entrada, los archivos FASTQ de salida y parámetros opcionales como la longitud y la calidad de lectura.
    Nota : el comando variará por la calidad sin procesar y deseada y la longitud de las lecturas. Para lecturas illumina 43 bp con cebadores Nextera, usamos: java -jar /data/apps/trimmomatic/0.35/trimmomatic-0.35.jar PE $READ 1. FASTQ $READ 2. FASTQ paired_READ1. fastq unpaired_READ1. fastq paired_READ2. FASTQ unpaired_READ2. FASTQ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:17 MINLEN:30.

5. Obtener el ensamblado de referencia

  1. Busque en Google, EnsemblGenomes y NCBI Genomes and Nucleotide TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) un genoma de referencia o transcriptoma ensamblado para la especie de interés (Figura 1).
    NOTA: Si un genoma de referencia o un transcriptoma no están disponibles o son de baja calidad, proceda al PASO 6 para generar un ensamblaje de novo.
  2. Si existe un genoma de referencia o un transcriptoma ensamblado, descárguela como un archivo fasta a donde se realizará el análisis siguiendo los pasos a continuación.
    1. Encuentre el enlace para descargar el genoma, haga clic con el botón izquierdo y copie el enlace.
    2. En la ventana del terminal, escriba wget y pegue la dirección del enlace. Si está disponible, copie también el archivo GTF y el archivo FASTA de proteínas para el genoma de referencia.

6. Generar un ensamblaje de novo (Alternativa al Paso 5)

  1. Combine los archivos RNA-seq READ1 y READ2 fastq para todas las muestras escribiendo cat *READ1. FASTQ > $all_READ1. FASTQ y gato *READ2. FASTQ > all_READ2. FASTQ en la ventana del terminal.
  2. Instale o cargue Trinity22 v.2.8.5 en el clúster informático.
  3. Generar y ensamblaje escribiendo en el terminal: Trinity --seqType fq --max_memory 20G --left $all_READ1. FASTQ --right $all_READ2. FASTQ.

7. Mapa de lecturas del genoma (7.1) o transcriptoma de novo (7.2)

  1. El mapa lee el genoma de referencia usando STAR23 v. 2.6.0c y RSEM24 v. 1.3.0.
    1. Instale o cargue STAR v. 2.6.0c. y RSEM v. 1.3.0 al clúster de computación.
    2. Indexe el genoma escribiendo rsem-prepare-reference --gtf $GENOME. GTF --estrella -p 16 $GENOME. FASTA $OUTPUT.
    3. Asigne y calcule la expresión para cada muestra escribiendo rsem-calculate-expression -p 16 --star --paired-end $READ 1. FASTQ $READ 2. $INDEX $OUTPUT FASTQ.
    4. Cambie el nombre del archivo de resultados a algo descriptivo utilizando mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
    5. Generar una matriz de todos los recuentos escribiendo rsem-generate-data-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT.
  2. Mapee RNA-seq al ensamblaje Trinity de novo usando RSEM y pajarita.
    1. Instale o cargue Trinity22 v.2.8.5, Bowtie25 v. 1.0.0 y RSEM v. 1.3.0.
    2. Asigne lecturas y calcule la expresión de cada muestra escribiendo [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --prep-reference --transcripts $TRINITY. FASTA --seqType fq --left $READ 1. FASTQ --derecha $READ 2. FASTQ --est_method RSEM --aln_method pajarita --trinity_mode --output_dir $OUTPUT.
    3. Cambie el nombre del archivo de resultados a algo descriptivo utilizando mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
    4. Generar una matriz de todos los recuentos escribiendo [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[genes/isoformas].resultados

8. Identificar genes de interés

NOTA: Los siguientes pasos se pueden hacer con archivos FASTA de nucleótidos o proteínas, pero funcionan mejor y son más sencillos con las secuencias de proteínas. Las búsquedas blast usando proteína a proteína es más probable que den resultados cuando se busca entre diferentes especies.

  1. Para un genoma de referencia, utilice el archivo FASTA de proteínas del PASO 5.2.2 o consulte Materiales suplementarios para generar una característica genética personalizada GTF.
  2. Para un transcriptoma de novo, generar una proteína FASTA utilizando TransDecoder.
    1. Instale o cargue TransDecoder v. 5.5.0 en el cluser del equipo.
    2. Encuentre el marco de lectura abierto más largo y la secuencia de péptidos predicha escribiendo [Transdecoder location]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY. FASTA.
  3. Busque homólogos en especies estrechamente relacionadas en NCBI Genbank.
    1. Abra una ventana del navegador de Internet y vaya a https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.
    2. En la barra de búsqueda escriba el nombre del gen de interés y el nombre de las especies estrechamente relacionadas que han sido secuenciadas o género o filo. A la izquierda de la barra de búsqueda, seleccione proteína y luego haga clic en buscar.
    3. Extraiga las secuencias haciendo clic en Enviar a y, a continuación, seleccione Archivo. En Formato, seleccione FASTA y, a continuación, haga clic en Crear archivo.
    4. Mueva el archivo FASTA de homólogos al clúster de equipos escribiendo scp $FASTA username@clusterlocation:/$DIR en una ventana de terminal local o utilice FileZilla para transferir archivos hacia y desde el equipo y el clúster.
  4. Búsqueda de genes candidatos utilizando BLAST+26.
    1. Instale o cargue BLAST+ v. 2.8.1 en el clúster de equipos.
    2. En el clúster de computadoras, haga una base de datos BLAST a partir de la proteína traducida por el genoma o el transcriptoma FASTA escribiendo [BLAST+ location]/makeblastdb -in $PEP. FASTA -dbtype prot -out $OUTPUT
    3. BLAST las secuencias de genes homólogos de NCBI a la base de datos de la especie de interés escribiendo [BLAST+ location]/blastp -db $DATABASE -query $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUT.
    4. Vea el archivo de salida utilizando el comando more. Copie los identificadores de genes únicos de las especies de interés en un nuevo archivo de texto.
    5. Extraiga las secuencias de genes candidatos escribiendo perl -ne 'if(/^>(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?print:chomp;$i{$_}=1 if @ARGV' $gene_id.txt $PEP. FASTA > $OUTPUT.
  5. Confirme la anotación de genes utilizando BLAST recíproco.
    1. En el navegador de Internet vaya a https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
    2. Seleccione tblastny, a continuación, pegue las secuencias candidatas, seleccione la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes y haga clic en BLAST.
  6. Identifique genes adicionales anotando todos los genes en el genoma o transcriptoma con términos de ontología génica (GO) (ver discusión).
    1. Transfiera la proteína FASTA a la computadora local.
    2. Descargue e instale Blast2GO27,28,29 v. 5.2 en el equipo local.
    3. Abra Blast2GO, haga clic en Archivo, vaya a Cargar, vaya a Cargar secuencias, haga clic en Cargar archivo Fasta (fasta). Seleccione el archivo FASTA y haga clic en Cargar.
    4. Haga clic en Blast, elija NCBI Blasty haga clic en Next. Edite parámetros o haga clic en Siguiente, editar parámetros y haga clic en Ejecutar para encontrar la descripción genética más similar.
    5. Haga clic en mapeo y luego haga clic en Ejecutar para buscar anotaciones de ontología génica para proteínas similares.
    6. A continuación, haga clic en interpro, seleccione EMBL-EBI InterProy haga clic en Siguiente. Edite los parámetros o haga clic en Siguientey haga clic en Ejecutar para buscar firmas de dominios y familias de genes conocidos.
    7. Exporte las anotaciones haciendo clic en Archivo, seleccione Exportar, haga clic en Exportar tabla. Haga clic en Examinar, asigne un nombre al archivo, haga clic en Guardar, haga clic en Exportar.
    8. Busque en la tabla de anotaciones los términos de interés de GO para identificar genes candidatos adicionales. Extraer las secuencias del fichero FASTA (STEP 8.4.5)

9. Árboles filogenéticos

  1. Descargue e instale MEGA30 v. 7.0.26 en su computadora local.
  2. Abra MEGA, haga clic en Alinear, haga clic en Editar / Construir alineación, seleccione Crear una nueva alineación, haga clic en Aceptar, seleccione Proteína.
  3. Cuando se abra la ventana de alineación, haga clic en Editar, haga clic en Insertar secuencias desde archivo y seleccione el FASTA con secuencias de proteínas de genes candidatos y homólogos probables.
  4. Seleccione todas las secuencias. Encuentra el símbolo del brazo y pasa el cursor sobre él. Debería decir Alinear secuencias usando el algoritmo MUSCLE31. Haga clic en el símbolo del brazo y, a continuación, haga clic en Alinear proteína para alinear las secuencias. Edite los parámetros o haga clic en Aceptar para alinearlos con los parámetros predeterminados.
  5. Inspeccione visualmente y realice los cambios manuales y, a continuación, guarde y cierre la ventana de alineación.
  6. En la ventana principal de MEGA, haga clic en Modelos, haga clic en Buscar los mejores modelos de ADN / proteína (ML), seleccione el archivo de alineación y seleccione los parámetros correspondientes, tales como: Análisis: Selección de modelo (ML), Árbol a utilizar: Automático (árbol de unión de vecinos), Método estadístico: Máxima verosimilitud, Tipo de sustitución: Aminoácido, Espacio / tratamiento de datos faltantes: Usar todos los sitios, Filtro de sitio de sucursal: Ninguno.
  7. Una vez que se determina el mejor modelo para los datos, vaya a la ventana principal de MEGA. Haga clic en Filogenia y haga clic en Árbol de máxima verosimilitud de construcción/prueba y, a continuación, seleccione la alineación, si es necesario. Seleccione los parámetros apropiados para el árbol: Método estadístico: Máxima verosimilitud, Prueba de filogenia: Método Bootstrap con 100 réplicas, tipo de sustitución: aminoácido, modelo: LG con Freqs. (+F), tasas entre sitios: gamma distribuida (G) con 5 categorías gamma discretas, tratamiento de datos gap/missing: use all sites, método heurístico ML: Nearest-Neighbor-Interchange (NNI).

10. Visualizar la expresión génica usando TPM

  1. Para Trinity, en el clúster de computadoras, vaya al directorio donde se ejecutó abundance_estimates_to_matrix.pl y una de las salidas debe ser matrix. TPM.not_cross_norm. Transfiera este archivo al equipo local.
    Nota: Consulte materiales suplementarios para la normalización de muestras cruzadas.
  2. Para las MEDIDAS DE PROTECCIÓN de un análisis del genoma, siga los pasos a continuación.
    1. En el clúster de equipos, vaya a la ubicación de instalación de RSEM. Copie rsem-generate-data-matrix escribiendo scp rsem-generate-data-matrix rsem-generate-TPM-matrix. Use nano para editar el nuevo archivo y cambie "mi $offsite = 4" de 4 a 5 para TPM, ahora debe leer "mi $offsite = 5".
  3. Vaya al directorio donde están los archivos de salida RSEM .genes.results y ahora use rsem-generate-TPM-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT para generar una matriz TPM. Transferir los resultados a un equipo local.
  4. Visualice los resultados en ggplot2.
    1. Descargue R v. 4.0.0 y RStudio v. 1.2.1335 en un equipo local.
    2. Abra RStudio a la derecha de la pantalla, vaya a la pestaña Paquetes y haga clic en Instalar. Escriba ggplot2 y haga clic en instalar.
    3. En la ventana de script de R, lea en la tabla tpm escribiendo data<-read.table("$tpm.txt",header = T)
    4. Para gráficos de barras similares a la Figura 4, escriba algo similar a: p<- ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tissue), data=data, stat="identity")
      fill<-c("#d7191c","#fdae61", "#ffffbf", "#abd9e9", "#2c7bb6")
      p<-p+scale_fill_manual(values=fill)
      p + theme(axis.text.x = element_text(angle = 90))

Resultados

Los métodos anteriores se resumen en la Figura 1 y se aplicaron a un conjunto de datos de tejidos de Hydra vulgaris. H. vulgaris es un invertebrado de agua dulce que pertenece al filo Cnidaria que también incluye corales, medusas y anémonas de mar. H. vulgaris puede reproducirse asexualmente por gemación y pueden regenerar su cabeza y pie cuando están divididos en dos. En este estudio, el objetivo fue investigar la evolución y expresión de los genes...

Discusión

El propósito de este protocolo es proporcionar un contorno de los pasos para caracterizar a una familia del gene usando datos del ARN-seq. Se ha demostrado que estos métodos funcionan para una variedad de especies y conjuntos de datos4,34,35. La tubería establecida aquí se ha simplificado y debería ser lo suficientemente fácil como para ser seguida por un novato en bioinformática. La importancia del protocolo es que descr...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad y Aline G. Rangel por su asesoramiento y orientación para incorporar algunos de estos pasos en nuestro flujo de trabajo. También estamos agradecidos a Katherine Williams, Elisabeth Rebboah y Natasha Picciani por los comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de investigación médica de la Fundación George E. Hewitt para A.M.M.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioanalyzer-DNA kitAgilent5067-4626wet lab materials
Bioanalyzer-RNA kitAgilent5067-1513wet lab materials
BLAST+ v. 2.8.1On computer cluster*
https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
Blast2GO (on your PC)On local computer
https://www.blast2go.com/b2g-register-basic
boost v. 1.57.0On computer cluster
Bowtie v. 1.0.0On computer cluster
https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/
Computing cluster (highly recommended)NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.
Cufflinks v. 2.2.1On computer cluster
edgeR v. 3.26.8 (in R)In Rstudio
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
gcc v. 6.4.0On computer cluster
Java v. 11.0.2On computer cluster
MEGA7 (on your PC)On local computer
https://www.megasoftware.net
MEGAX v. 0.1On local computer
https://www.megasoftware.net
NucleoSpin RNA II kitMacherey-Nagel740955.5wet lab materials
perl 5.30.3On computer cluster
pythonOn computer cluster
Qubit 2.0 FluorometerThermoFisherQ32866wet lab materials
R v.4.0.0On computer cluster
https://cran.r-project.org/src/base/R-4/
RNAlaterThermoFisherAM7021wet lab materials
RNeasy kitQiagen74104wet lab materials
RSEM v. 1.3.0Computer software
https://deweylab.github.io/RSEM/
RStudio v. 1.2.1335On local computer
https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download
Samtools v. 1.3Computer software
SRA Toolkit v. 2.8.1On computer cluster
https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
STAR v. 2.6.0cOn computer cluster
https://github.com/alexdobin/STAR
StringTie v. 1.3.4dOn computer cluster
https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/
Transdecoder v. 5.5.0On computer cluster
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases
Trimmomatic v. 0.35On computer cluster
http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Trinity v.2.8.5On computer cluster
https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases
TRIzolThermoFisher15596018wet lab materials
TruSeq RNA Library Prep Kit v2IlluminaRS-122-2001wet lab materials
TURBO DNA-free KitThermoFisherAM1907wet lab materials
*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.

Referencias

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