Generación Libre De Gm De Células Neuronales Derivadas De La Sangre

Resumen

Presentamos un método genético modificado-libre (GM-libre) para obtener las células con un fenotipo neuronal de glóbulos periféricos reprogramados. La activación de una vía de señalización vinculada a la nueva proteína humana ligada a GPI revela un método eficiente libre de GM para la obtención de células madre pluripotentes humanas.

Resumen

Muchos trastornos neurológicos humanos son causados por la degeneración de las neuronas y las células gliales en el cerebro. Debido a las limitaciones en las estrategias farmacológicas y otras estrategias terapéuticas, actualmente no hay cura disponible para el cerebro lesionado o enfermo. El reemplazo celular aparece como una estrategia terapéutica prometedora para las condiciones neurodegenerativas. Hasta el día de hoy, las células madre neurales (NSC) se han generado con éxito a partir de tejidos fetales, células embrionarias humanas (CE) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Un proceso de desdiferenciación se inició por la activación de la nueva glicoproteína humana ligada a GPI, que conduce a la generación de células madre pluripotentes. Estas células madres pluripotentes sangre-derivadas (BD-PSCs) diferencian in vitro en las células con un fenotipo de los nervios según lo mostrado por microscopia del brightfield y de la inmunofluorescencia. El análisis ultraestructural de estas células por medio de microscopía electrónica confirma su estructura primitiva así como neuronal-como morfología y características subcelulares.

Introducción

El desarrollo de métodos básicos y preclínicos de investigación con células madre fomenta la aplicación clínica de terapias basadas en células madre para enfermedades neurológicas. Tal terapia potencial depende críticamente del método para la generación de células neuronales humanas que conducen a la recuperación funcional¹.

Las células madre neurales (NSCs) se auto-renuevan y se diferencian en nuevas neuronas a lo largo de la vida en un proceso llamado neurogénesis adulta. Sólo las áreas cerebrales muy restringidas albergan NSCs competentes para generar neuronas recién nacidas en la edad adulta. Tales NSCs pueden dar lugar a las neuronas maduras, que están implicadas en el aprendizaje y la memoria, substituyendo así las neuronas perdidas o dañadas. Desafortunadamente, estos NSCs están presentes en cantidades restringidas y esta neurogénesis limitada disminuye rápidamente durante el desarrollo juvenil². Por lo tanto, otras fuentes de células neurales deben considerarse en un objetivo de terapia celular.

Las enfermedades neurológicas degenerativas son difíciles de curar usando acercamientos farmacológicos estándar. Las nuevas estrategias terapéuticas para abrazar muchos desordenes neurológicos inmédicos se basan en terapias del reemplazo de la célula del tejido enfermo y dañado. El trasplante de NSC podría reemplazar las células dañadas y proporcionar efectos beneficiosos. Otras fuentes para el reemplazo de células neuronales incluyen las células madre embrionarias humanas (ESC), que se derivan de la masa celular interna de los blastocistos de mamíferos^3,así como los iPSCs^4,que tienen una amplia capacidad de autorre renovación como los CES y son capaces de diferenciarse en varios linajes celulares. Los NSC también pueden generarse mediante reprogramación directa de fibroblastos humanos evitando el estado pluripotente^5.

La terapia de reemplazo celular sigue siendo un problema desafiante. Aunque esc, fetal, o iPS puede ser una fuente para la generación de células neuronales para el tratamiento de muchas enfermedades neurológicas incurables, el reemplazo de células de SCs adultos autólogos de tejidos dañados es una mejor alternativa que elude las preocupaciones inmunológicas, éticas y de seguridad.

La activación de la proteína humana ligada al GPI mediante reticulación de anticuerpos a través de la fosforilación de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN inicia una desdiferenciación de las células progenitoras sanguíneas y la generación de células madre pluripotentes derivadas de la sangre (BD-PSCs)⁶. Estas células se diferencian in vitro hacia las células neuronales según lo confirmado por medio de brightfield, inmunofluorescencia y análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM).

En este trabajo se describe la generación libre de GM de BD-PSCs y su exitosa re-diferenciación en células con fenotipo neuronal.

Protocolo

Se obtuvieron aprobaciones éticas al realizar los experimentos.

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMNCs)

1. Asegúrese de que todos los donantes firmaron el consentimiento informado antes de la extracción de sangre de conformidad con las directrices institucionales.
2. Tome 30 mL de sangre de donantes sanos por personal médico capacitado de acuerdo con el protocolo estándar.
3. Aísle los PBMNCs por medios de gradiente de densidad. Utilizar 10 mL de medio con 25 mL de sangre 1:1 diluida con solución salina tampón de fosfato (PBS), y centrífuga a 300 x g durante 30 min.
4. Aísle la capa de interfase entre el plasma y el medio de gradiente de densidad mediante pipeteo. Lavar las células aisladas con 5 mL de PBS estéril y centrífuga a 300 x g durante 10 min. Repetir dos veces.
5. Cuente el número de celdas por métodos estándar utilizando una cámara de conteo.

2. Activación de la glicoproteína GPI-anclada humana por el crosslinking del anticuerpo en la superficie de PBMNCs

1. Colocar las 6 x 10⁶ células mononucleares (MNCs) en tubos de 15 mL y realizar la reticulación de anticuerpos incubando las células con anticuerpos específicos de proteínas de membrana ligadas a GPI humanos (30 μg/mL) durante 30 min en PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% a 37 °C.
2. Reemplace el medio de incubación con el medio modificado de Dulbecco de Iscove complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS).
3. Cultivar las células en tubos de poliestireno de 15 mL, poner los tubos en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante 8-10 días (sin agitar). En D5, agregue 1-2 mL adicionales del medio de Iscove complementado con FBS al 10% a cada tubo de 15 mL.

3. Clasificación de celdas desdiferenciadas recién generadas

1. Cuente las células con un contador automatizado de la célula (suspensión de la célula de 18 μL + tinte de la fluorescencia del 2μL) o en un compartimiento de la cuenta.
2. Centrífuga cultivada suspensión celular (5-7 x 10⁶) a 300 x g durante 10 min y aspirar el sobrenadante resultante con una pipeta Pasteur estéril.
3. Vuelva a suspender el pellet celular en 90 μL de PBS preenfriado pH 7,2, BSA al 0,5% y EDTA de 2 mM.
4. Añadir cd45 positivo nano-tamaño magnético perlas (80 μL) a la suspensión de la célula e incubar en el hielo durante 15 min.
5. Lave las células agregando 2 mL de tampón de PBS y centrífuga a 300 x g durante 10 min.
6. Vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón PBS.
7. Lave la columna con 500 μL de tampón PBS preenfriado y colócalo en el campo magnético.
8. Coloque la suspensión celular en la columna y lávela con 500 μL de tampón PBS (dos veces) y el flujo de centrífuga que contiene células CD45 negativas. Recogerlos en el medio de Iscove complementado con 1% BSA.
9. Cuente las celdas de la cámara de recuento.

4. Preparación de platos de cultivo celular para la diferenciación neuronal de células madre recién generadas

1. Recubre los vasos de cultivo con poli-L-ornitina y laminina para el crecimiento de las células neuronales.
2. Coloque las tapas de vidrio en placas de 4 pocillos y recuérdelo con 1:5 diluida poli-L-ornitina (0,1 mg/mL en ddH₂O) en ddH₂O. Coloque los cubrebocas en una incubadora de 37 °C durante 1 h. Luego lavar con ddH₂O.
3. Descongelar lentamente laminina (0.5-2.0 mg /mL) y añadir a la parte superior de las cubiertas. Incubarlo a 37 °C durante 2 h.
4. Preparar el medio de inducción neuronal N2 consistente en 49 mL de D-MEM/F12, 500 μL de suplemento de N2, 400 μL de aminoácidos no esenciales (NEAA), solución básica de FGF a 20 ng/mL de concentración final (preparada a partir de 100 μg/mL de solución madre) y heparina a 2 ng/mL de concentración final.
5. Eliminar el exceso de laminina por pipeteo y añadir el medio neuronal N2 a los platos de cultivo.

5. Cultivo de células sanguíneas desdiferenciadas neuronales

1. Cultivo de células CD45 derivadas de BD en cubiertas de vidrio recubiertas de laminina /ornitina durante 2 días en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ en medio N2 para iniciar una diferenciación neuronal de las células recién generadas por BD.
2. Cultivar células más a fondo en medio de diferenciación neuronal consistente en 48 mL de medio neurobasal, 500 μL de L-glutamina, 1 mL de Suplemento B27, 500 μL de ANEAA, 50 μL de factor neurotrófico derivado de glial humano recombinante (GDNF) a 5 μg/250 μL en PBS/0,1% BSA, y 50 μL de factor neurotrófico derivado del cerebro humano recombinante (BDNF) a 5 μg/200 μL en PBS/0,1% BSA y 50 μL de solución de ácido ascórbico 2,9 g/50 mL en PBS. Colocar las placas en una incubadora a 37 °C y al 5% de_CO2.

6. Análisis de microscopía de inmunofluorescencia de células neurales derivadas de la sangre

1. Cultíe las células como se describió anteriormente durante 16 días y retire los medios.
   1. Incubar con fijador precalentado consistente en 75 mL de agua estéril, 4 g de paraformacionaldehído. Agregue 10 N NaOH según sea necesario y revuelva hasta que la solución se aclare. A continuación, añadir 10 mL de 10x PBS, 0,5 mL de MgCl_2, 2 mL de 0,5 M EGTA, y 4 g de sacarosa. Valorar a pH 7,4 con 6 N HCl, y llevar a 100 mL de agua estéril durante 15 min, según Marchenko et al.^7.
   2. Deseche el fijador y lave las células 3 veces durante 5 min cada vez. Inmediatamente añadir una solución X de Tritón recién hecha al 0,3% y permeabilizar las células durante 5 min. Lavar 3 veces con PBS y añadir una solución de bloqueo hecha por PBS y 5% BSA.
   3. Bloquee las celdas a temperatura ambiente en una placa basora durante 1 hora.
   4. Preparar la dilución adecuada de anticuerpos en BSA/PBS al 1% e incubar las células con diluciones de anticuerpos en placa basculante durante 1,5 h a temperatura ambiente. Lave las células 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una, incube las células con DAPI y monte las cubiertas con medios de montaje para su visualización en un microscopio.
      NOTA: Los anticuerpos etiquetados directamente utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla de materiales.

7. Análisis de microscopía electrónica de transmisión de células recién generadas

1. Sembra las células para TEM en portaobjetos de cámara de 8 pozos.
2. Fijar las células en glutaraldehído al 3,5% durante 1 h a 37 °C, post-fijar en 2% OsO₄ durante una hora adicional a temperatura ambiente y manchar en acetato de uranilo al 2% en la oscuridad a 4 °C durante 2 h 30 min.
3. Finalmente, enjuague las células en agua destilada, deshidrate en etanol e incruste en resina epoxi durante la noche. Al día siguiente transferir las muestras a un horno de 70 °C durante 72 h para el endurecimiento de la resina.
4. Suelte los cultivos celulares incrustados de la diapositiva de la cámara y pegue a los bloques de aralditar.
5. Corte las secciones semidelgadas en serie (1,5 μm) con una máquina, monte en portaobjetos de vidrio y filtre ligeramente con azul toluidina al 1%.
6. Pegue las secciones semidelgadas seleccionadas a bloques de aralditar y desprenda del portaobjetos de vidrio mediante la congelación repetida (en nitrógeno líquido) y la descongelación.
7. Preparar secciones ultratinas (0.06-0.08 μm) con una máquina y contrastar aún más con citrato de plomo.
8. Obtenga micrografías utilizando microscopio de barrido electrónico con cámara digital.

Resultados

Los resultados proporcionan evidencia de que este nuevo método libre de GM es capaz de revertir las células progenitoras sanguíneas a su estado más primitivo sin actuar directamente sobre el genoma humano.

Hemos demostrado previamente que la reticulación de anticuerpos específicos de proteínas ligadas a GPI se inicia a través de PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN regulación al alza de genes altamente conservados y relevantes para el desarrollo como WNT, NOTCH y C-Kit, iniciando así un...

Discusión

El método no-GM de reprogramación de células humanas descritas en este trabajo se basa en la activación de membrana a núcleo de la maquinaria de señalización detrás de la glicoproteína de membrana humana ligada a GPI que inicia el proceso de desdiferenciación que conduce a la generación ex vivo y la expansión de pscs autorrenuevas obtenidos de sangre periférica humana no manipulada. Estas células cuando se cultivan en medios apropiados son capaces de re-diferenciación en células pertenecientes a ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400