Dosimetría para irradiación celular mediante instalaciones de rayos X de ortovoltaje (40-300 kV)

Resumen

Este documento describe un nuevo protocolo de dosimetría para las irradiaciones celulares utilizando equipos de rayos X de baja energía. Las mediciones se realizan en condiciones que simulan condiciones reales de irradiación celular tanto como sea posible.

Resumen

La importancia de los protocolos de dosimetría y las normas para los estudios radiobiológicos es evidente. Se han propuesto varios protocolos para la determinación de dosis utilizando instalaciones de rayos X de baja energía, pero dependiendo de las configuraciones de irradiación, muestras, materiales o calidad del haz, a veces es difícil saber qué protocolo es el más adecuado para emplear. Por lo tanto, proponemos un protocolo de dosimetría para las irradiaciones celulares utilizando instalaciones de rayos X de baja energía. El objetivo de este método es realizar la estimación de la dosis a nivel de la monocapa celular para que sea lo más cerca posible de las condiciones reales de irradiación celular. Los diferentes pasos del protocolo son los siguientes: determinación de los parámetros de irradiación (alta tensión, intensidad, contenedor celular, etc.), determinación del índice de calidad del haz (pareja de capa de medio valor de alto voltaje-medio), medición de la velocidad de dosis con cámara de ionización calibrada en condiciones de kerma de aire, cuantificación de la atenuación y dispersión del medio de cultivo celular con películas radiocromáticas EBT3, y determinación de la velocidad de dosis a nivel celular. Esta metodología debe realizarse para cada nueva configuración de irradiación celular, ya que la modificación de un solo parámetro puede afectar fuertemente la deposición de dosis real a nivel de la monocapa celular, particularmente con rayos X de baja energía.

Introducción

El objetivo de la radiobiología es establecer vínculos entre la dosis administrada y los efectos biológicos; la dosimetría es un aspecto crucial en el diseño de experimentos radiobiológicos. Durante más de 30 años, se ha destacado la importancia de las normas de dosimetría y la armonización de las prácticas^1,2,3,4,5. Para establecer una referencia de velocidad de dosis, existen varios protocolos^6,7,8,9,10; sin embargo, como lo demuestran Peixoto y Andreo^11, puede haber diferencias de hasta el 7% dependiendo de la cantidad dosimétrica utilizada para la determinación de la tasa de dosis. Además, incluso si existen protocolos, a veces es difícil saber qué protocolo es el más adecuado para una aplicación en particular, si existe, porque la tasa de dosis de las células depende de parámetros como el contenedor de células, la cantidad de medios de cultivo celular o la calidad del haz, por ejemplo. La dispersión y el backscattering para este tipo de irradiación es también un parámetro muy importante a tener en cuenta. De hecho, para los rayos X de baja y media energía, en el protocolo de referencia AAPM TG-61^10,la dosis absorbida en agua se mide en la superficie de un fantasma del agua. Teniendo en cuenta las condiciones de irradiación celular muy específicas, el pequeño volumen de medios de cultivo celular rodeados de aire está más cerca de las condiciones de kerma que los definidos para una dosis absorbida con un fantasma equivalente de agua grande como en el protocolo TG-61. Por lo tanto, hemos optado por utilizar el kerma en agua como una cantidad dosimétrica para referencia en lugar de la dosis absorbida en agua. Por lo tanto, proponemos un nuevo enfoque para proporcionar una mejor determinación de la dosis real administrada a las células.

Además, otro aspecto crucial para los estudios radiobiológicos es la presentación completa de los métodos y protocolos utilizados para la irradiación con el fin de poder reproducir, interpretar y comparar resultados experimentales. En 2016, Pedersen et al.¹² destacó la inadecuada notificación de dosimetría en estudios radiobiológicos preclínicos. Un estudio reciente más amplio de Draeger et al.¹³ destacó que aunque se notifican algunos parámetros de dosimetría como la dosis, la energía o el tipo de fuente, falta una gran parte de los parámetros de física y dosimetría que son esenciales para replicar correctamente las condiciones de irradiación. Esta revisión a gran escala, de más de 1.000 publicaciones que abarcan los últimos 20 años, muestra una falta significativa de informes de las condiciones de física y dosimetría en estudios radiobiológicos. Por lo tanto, una descripción completa del protocolo y el método utilizado en los estudios radiobiológicos es obligatorio con el fin de tener experimentos robustos y reproducibles.

Teniendo en cuenta estos diferentes aspectos, para los experimentos radiobiológicos llevados a cabo en el IRSN (Instituto de Protección radiológica y Seguridad Nuclear), se implementó un estricto protocolo para las irradiaciones celulares en una instalación de ortovoltaje. Este protocolo de dosimetría fue diseñado con el fin de simular las condiciones reales de irradiación celular tanto como sea posible y, por lo tanto, para determinar la dosis real administrada a las células. Para ello, se enumeran todos los parámetros de irradiación y se evaluó el índice de calidad del haz midiendo la capa de medio valor (HVL) para la que se han realizado algunas adaptaciones, ya que no se pueden seguir las recomendaciones estándar del protocolo AAPM^10. La medición absoluta de la tasa de dosis se realizó entonces con la cámara de ionización dentro del recipiente celular utilizado para las irradiaciones celulares, y la atenuación y la dispersión de los medios de cultivo celular también se cuantificó con películas radiocromáticas EBT3. Como la modificación de un solo parámetro del protocolo puede afectar significativamente a la estimación de la dosis, se realiza una dosimetría dedicada para cada configuración de irradiación celular. Además, el valor HVL debe calcularse para cada combinación de filtro de voltaje. En este trabajo actual, se utiliza una tensión de 220 kV, una intensidad de 3 mA, y una filtración inherente y adicional de 0,8 mm y 0,15 mm de berilio y cobre, respectivamente. La configuración de irradiación celular elegida se encuentra en un matraz T25, donde las células fueron irradiadas con 5 ml de medios de cultivo celular.

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Protocolo

1. Plataforma de irradiación y determinación de parámetros de irradiación

1. Utilice una plataforma de irradiación que ofrezca rayos X de baja a media energía. Determine los parámetros del experimento para garantizar la robustez y la reproducibilidad del experimento radiobiológico: Alta tensión, Intensidad, Filtración (inherente y adicional), Capa de medio valor (HVL), Energía efectiva, Detector utilizado para mediciones de dosimetría, Distancia de muestra de origen (SSD), Campo de irradiación (forma, tamaño, geometría), Cantidad de dosimetría, Método de dosimetría, Tasa de dosis, Contenedor de celda y Cantidad de medios de cultivo celular. Todos los parámetros utilizados en este protocolo se indican en la Tabla 1.

2. Índice de calidad del haz: determinación de la capa de medio valor

NOTA: El HVL se define como el espesor de un atenuador (generalmente cobre o aluminio) para reducir la intensidad de la viga en un factor de dos en comparación con el valor original.

1. Configure el equipo (soporte, colimador, diafragma, ionización) dentro de la carcasa de irradiación siguiendo las instrucciones de la Figura 1. No se utiliza ningún material atenuador en este paso.
2. Asegúrese de que todas las distancias notificadas en la Figura 1 sean correctas. Mida estos con una cinta métrica.
3. Coloque esa cámara de ionización en la posición horizontal. Para este trabajo, utilizamos una cámara de ionización cilíndrica 31002 (equivalente a 31010) calibrada en kerma de aire.
4. Pre-irradiar la cámara de ionización durante 5 min y medir el fondo (este paso se puede realizar sin un colimador).
5. Realice 10 mediciones de 1 min cada una en modo de recogida de carga correspondiente al valor_raw M (en coulombs).
6. Tome la temperatura y la presión con el equipo calibrado adecuado colocado dentro de la carcasa de irradiación en nuestro caso (si no es posible, colóquelo cerca del experimento). Corrija la lectura_{M raw} en el electrometro por el factor de corrección de temperatura y presión dado de la siguiente manera:
   
   donde: T (°C) y P (hPa) son la temperatura y la presión reales, respectivamente. T_ref y P_ref son la temperatura de referencia y la presión cuando la ionización fue calibrada por el laboratorio de estándares. La presión y la temperatura deben medirse con instrumentos calibrados. El valor obtenido en el modo de carga es el valor medio de referencia M (en coulombs).
   NOTA: Este paso no es estrictamente necesario para la medición HVL, pero se recomienda.
7. Coloque un atenuador de cierto grosor por encima del diafragma. El conjunto HVL se compone de láminas con diferentes espesores (0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5 y 10 mm de cobre) con una dimensión que permite cubrir aquí toda la viga (80 x 80 mm).
8. Tome una medida de 1 min (M_raw corregido por el K_T,P como se describió anteriormente).
   1. Si la tasa de dosis se divide por un factor de 2 con respecto al valor inicial, se encuentra el valor HVL. Tome 5 mediciones de 1 min para estimar la tasa media de dosis.
   2. Si la tasa de dosis no se divide por un factor de 2 con respecto al valor inicial, aumente o disminuya el grosor del atenuador y tome otra medida. Ajuste el grosor del atenuador según sea necesario.
9. Una vez que se encuentre el grosor del atenuador que disminuye la intensidad del haz por un factor dos, tome 5 mediciones de 1 min para confirmar el HVL.
   NOTA: En la mayoría de los casos, el grosor exacto del atenuador no se puede encontrar en las láminas disponibles. En este caso, proceda por bisección e interpole el HVL.

3. Evaluación del campo de irradiación (sin estimación de dosis)

1. Coloque una película EBT3 en el soporte utilizado para la irradiación.
2. Irradia esta película para obtener un campo de irradiación bien marcado (al menos 2 Gy).
3. Escanee la película EBT3 con un escáner dedicado.
4. Trace el perfil de dosis utilizando la imagen J utilizando la opción Analizar y, a continuación, Trazar perfil (Figura 2).
5. Determinar el tamaño del uso del campo de irradiación para la irradiación (área homogénea, excluyendo las regiones del penumbra, véase la Figura 2).
6. Realice marcas en el soporte utilizado para la irradiación para asegurarse de que el contenedor de celdas está en la posición correcta.
   NOTA: En este paso, se determina el tamaño del campo de irradiación y no se estima la dosis. El procedimiento completo para la lectura y el análisis de películas se indica en la sección 5. Además, tome los márgenes para evitar errores debido al posicionamiento del contenedor de la célula.

4. Medición de la tasa de dosis con cámara de ionización

1. Tome el recipiente de celda y rompa una pequeña parte en el lado o en la parte inferior (dependiendo del contenedor particular y la cámara de ionización utilizada) para poder colocar la cámara de ionización dentro(Figura 3,sección superior) o debajo(Figura 3,sección inferior) del contenedor. Los ejemplos se dan en la Figura 3 con diferentes cámaras de ionización (cilíndricas o planas paralelas) y contenedores de celdas. En este caso, se utilizó un matraz T25(Figura 3,caja roja).
   NOTA: un soldador o bisturí calentado es una buena alternativa para hacer agujeros en los utensilios de plástico
2. Coloque el recipiente dentro de la carcasa en el soporte utilizado para la irradiación (placa de carbono aquí).
3. Coloque la cámara de ionización en el recipiente(Figura 3,caja roja), en la posición correcta y conéctelo al electrometro.
4. Asegúrese de que todos los parámetros de irradiación enumerados en la sección 1 sean correctos (alto voltaje, intensidad, filtraciones adicionales, distancia de la muestra de origen, etc.).
5. Pre-irradiar la cámara de ionización durante 5 min y realizar la reducción a cero del electrometro.
6. Tome 10 mediciones de 1 min para determinar la tasa media de dosis en el kerma de aire (Gy.min^-1). Calcule la determinación de la velocidad de dosis en_{el aire} K de la siguiente manera:
   
   donde M es la lectura del dosímetro corregido por temperatura, presión, efecto polaridad, recombinación de iones y calibración del electrometro. N_Kair y K_q son los factores de calibración y corrección de la calidad de la radiación, cuyos valores son específicos de cada cámara de ionización.

5. Medición de la atenuación y dispersión de los medios de cultivo celular

NOTA: Manipule las películas EBT3 con guantes durante todo el procedimiento.

1. Preparación del experimento
   1. Corta pequeñas piezas de películas EBT3 al menos 24 h antes de la irradiación.
   2. Determine el tamaño de las películas en función del contenedor de celdas utilizado para experimentos de radiobiología (4 x 4 cm para un matraz T25, por ejemplo).
      Cortar dos conjuntos de películas radiocromáticas: Un conjunto para las curvas de calibración compuestas por tres piezas de película radiocromática EBT3 por dosis o punto de tiempo (nueve puntos en total para este trabajo); y un conjunto para la cuantificación de la atenuación de los medios de cultivo celular, también tres piezas por punto.
   3. Numere todas las películas para su identificación (esquina superior derecha aquí) y escanee en la misma posición en el escáner.
   4. Mantenga las películas alejadas de la luz.
   5. Prepare el contenedor de celdas utilizado para las mediciones de película EBT3 y, si es necesario, corte una pieza para colocar la película dentro (un ejemplo con un T25 se da en la Figura 4).
2. Estimación de la tasa de dosis
   1. Mida la tasa de dosis para la configuración como se describe en la sección anterior.
   2. Mantenga esta configuración en su lugar para la irradiación de las películas radiocromáticas EBT3 y utilice el mismo tipo de contenedor de células.
3. Construcción de la curva de calibración
   1. Tome las películas EBT3 precortadas para la curva de calibración.
   2. No irradiar tres piezas (0 Gy).
   3. Coloque la primera película dentro del contenedor de celdas, en la misma configuración que para la irradiación celular.
   4. Irradiarlo para obtener los primeros puntos de dosis.
   5. Repita esta operación para obtener tres piezas de películas EBT3 irradiadas con la misma dosis.
   6. Realice esto para cada punto de dosis (nueve puntos de dosis en este trabajo (0, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5 y 3 Gy) como se ilustra en la Figura 5).
4. Evaluación de la atenuación de los medios de cultivo celular y dispersión.
   1. Eligió el mismo tiempo de irradiación para todas las irradiaciones (60 s, por ejemplo).
   2. Irradia tres piezas de películas EBT3 en el recipiente sin agua.
   3. Irradia tres piezas de películas EBT3 en el recipiente con agua de la siguiente manera.
      1. Coloque la película dentro del contenedor.
      2. Llene el recipiente con la cantidad exacta de agua para representar los medios de cultivo celular (5 ml aquí). Utilice pequeñas piezas de cinta si las películas no permanecen sumergidas correctamente.
      3. Coloque el recipiente de celda dentro de la carcasa y asegúrese de que la película esté correctamente sumergida.
      4. Cuando se complete la irradiación, tome las películas EBT3, séquelas con papel absorbente y guárdelas lejos de la luz.

6. Lectura de películas radiocromáticas EBT3

1. Lea las películas ebt3 al menos 24 h después de la irradiación.
2. Escanea las películas en un escáner dedicado.
3. Establezca los parámetros del escáner como: formato tiff rojo-verde-azul de 48 bits, 150 ppp en modo de transmisión y sin corrección de imagen.
4. Realice un calentamiento del escáner de la siguiente manera.
   1. Coloque una película no irradiada en el escáner.
   2. Inicie una vista previa del análisis.
   3. Inicie un temporizador y espere 30 s.
   4. Inicie la exploración.
   5. Al final de la exploración, inicie un temporizador y espere 90 s.
   6. Al mismo tiempo, registre el escaneo, abra la imagen con ImageJ, trace un ROI cuadrado (siempre del mismo tamaño y en la misma posición) y realice una medición del nivel medio de píxel rojo de la zona.
   7. Al final de los años 90, repita el procedimiento desde el paso 2 (sin tocar la película dentro del escáner).
   8. Repita esto al menos 30 veces para calentar y estabilizar el escáner (sin variaciones en el nivel medio de píxel rojo del área seleccionada en las películas no irradiadas). Si el escáner, es decir, el valor medio del píxel rojo, no se estabiliza, continúe con el procedimiento.
5. Escaneo de las películas ebt3
   1. Coloque la primera película en el centro de la cama del escáner. Delimitar un área para colocar siempre la película en el mismo lugar y en la misma orientación.
   2. Inicie una vista previa del análisis.
   3. Inicie un temporizador y espere 30 s.
   4. Inicie la exploración.
   5. Al final de la exploración, inicie un temporizador y espere 90 s. Durante estos 90 s cambiar la película EBT3.
      NOTA: Un análisis de las películas radiocromáticas EBT3 se realizó utilizando un programa de C++ autoprogramado. Se pueden utilizar diferentes métodos para el análisis de película EBT3, como el método de canal rojo o el método de tres canales^14,15. En este caso, hemos utilizado el método del canal rojo sin resta de fondo, y las imágenes se convirtieron en densidades ópticas y luego a la dosis utilizando nuestro programa. Como este método ya está bien definido, nuestro programa de C++ no se incluyó aquí. Además, el software dedicado¹⁶ también se puede utilizar para el análisis de películas EBT3.

7. Determinación de la tasa de dosis a nivel de la monocapa celular

1. Convierta la tasa media de dosis obtenida con la cámara de ionización corregida por la atenuación y dispersión de los medios de cultivo celular (K) en el kerma de agua utilizando la relación del coeficiente medio de absorción de energía masiva para el agua al aire evaluada sobre el espectro de fluencia del fotón (μ_en/ρ).
   
   Un software dedicado¹⁷ se utilizó para calcular el espectro de energía de fotones en el aire sin fantasma, y utilizamos la tabla NIST¹⁸ para calcular el coeficiente medio de absorción de energía masiva.

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Resultados

En este trabajo, utilizamos una plataforma dedicada a la irradiación de animales pequeños^19; sin embargo, esta plataforma se puede utilizar para irradiar otros tipos de muestras como las células. La fuente de irradiación es un tubo de rayos X Varian (NDI-225-22) que tiene una filtración inherente de 0,8 mm de berilio, un gran tamaño de deporte focal de 3 mm, un rango de alto voltaje de aproximadamente 30 a 225 kV y una intensidad máxima de 30 mA.

Los parámetros ...

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Discusión

Este trabajo presenta el protocolo utilizado e implementado para las irradiaciones celulares utilizando instalaciones de rayos X de baja energía. Hoy en día, muchos experimentos de radiobiología se realizan con este tipo de irradiador, ya que son fáciles de usar, rentables y con muy pocas restricciones de radioprotección, en comparación con la fuente de cobalto, por ejemplo. Aunque estas configuraciones tienen muchas ventajas, ya que utilizan una fuente de energía de rayos X baja, una modificación de un solo par?...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
31010 ionization chamber	PTW	ionization Radiation, Detectors including code of practice, catalog 2019/2020, page 14	https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/DETECTORS_Cat_en_16522900_12/blaetterkatalog/index.html?startpage=1#page_14
EBT3 radiochromic films	Meditest	quote request	https://www.meditest.fr/produit/ebt3-8x10/
electrometer UNIDOSEwebline	PTW	online catalog, quote request	https://www.ptwdosimetry.com/en/products/unidos-webline/?type=3451&downloadfile=1593& cHash= 6096ddc2949f8bafe5d556e931e6c865
HVL material (filter, diaphragm)	PTW	online catalog, page 70, quote request	thickness foils: 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 and 10 mm of copper, https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/Online_Catalog/Radiation_Medicine_Cat_en_ 58721100_11/blaetterkatalog/index.html#page_70
scanner for radiochromic films	Epson	quote request	Epson V700, seiko Epson corporation, Suwa, Japan
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