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  • Divulgaciones
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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí presentamos un método que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección para generar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sin necesidad de transfección génica o vectores retrovirales. Esta estrategia es, por lo tanto, prometedora para la medicina traslacional y representa un avance notable en la tecnología de organoides de células madre.

Resumen

El fenotipo celular puede ser revertido o modificado con diferentes métodos, con ventajas y limitaciones que son específicas para cada técnica. Aquí describimos una nueva estrategia que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección, para generar células pluripotentes de mamíferos. Se requieren dos pasos principales. En el primer paso, las células adultas maduras (diferenciadas terminalmente) se exponen al borrador epigenético 5-aza-citidina para llevarlas a un estado pluripotente. Esta parte del protocolo se desarrolló, basada en la creciente comprensión de los mecanismos epigenéticos que controlan el destino y la diferenciación celular, e implica el uso del modificador epigenético para borrar el estado diferenciado celular y luego conducir a una ventana transitoria de alta plasticidad.

En el segundo paso, las células borradas se encapsulan en microbiorreactores de politetrafluoroetileno (PTFE), también conocidos como mármoles líquidos, para promover el reordenamiento celular 3D para extender y mantener de manera estable la alta plasticidad adquirida. El PTFE es un compuesto sintético hidrófobo no reactivo y su uso permite la creación de un microambiente celular, lo que no se puede lograr en los sistemas tradicionales de cultivo 2D. Este sistema fomenta e impulsa el mantenimiento de la pluripotencia a través de señales relacionadas con la biomenosensing.

Los procedimientos técnicos descritos aquí son estrategias simples para permitir la inducción y el mantenimiento de un estado de alta plasticidad en células somáticas adultas. El protocolo permitió la derivación de células de alta plasticidad en todas las especies de mamíferos probadas. Dado que no implica el uso de la transfección génica y está libre de vectores virales, puede representar un avance tecnológico notable para las aplicaciones de la medicina traslacional. Además, el sistema de microbiorreactor proporciona un avance notable en la tecnología de organoides de células madre mediante la recreación in vitro de un microambiente específico que permite el cultivo a largo plazo de células de alta plasticidad, es decir, como ESC, iPSC, células borradas epigenéticamente y MSC.

Introducción

Durante las últimas décadas, se revisó por completo el concepto ampliamente aceptado de progresión unidireccional hacia el compromiso y la diferenciación celular. Se ha demostrado que la especificación celular puede ser revertida, y una célula diferenciada terminalmente puede ser empujada hacia un estado menos comprometido y más permisivo, utilizando diferentes métodos.

Entre los varios métodos propuestos, uno de los métodos más prometedores implica el uso de compuestos químicos para inducir a las células a una llamada pluripotencia inducida químicamente. Las pequeñas moléculas utilizadas en este abordaje son capaces de interactuar y modificar la firma epigenética de una célula adulta madura, evitando la necesidad de cualquier vector transgénico y/o viral 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Numerosos estudios han demostrado recientemente que es posible cambiar las células de un fenotipo a otro proporcionando estímulos bioquímicos y biológicos específicos que inducen la reactivación de genes hipermetilados 11,12,13,14,15. Estos eventos desmetilantes permiten la conversión de células diferenciadas terminalmente en un progenitor primitivo, una célula multipotente o de alta plasticidad/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Paralelamente, muchos estudios se han centrado recientemente en la comprensión de las señales relacionadas con la mecanodetección y, más concretamente, en la posibilidad de utilizar fuerzas mecánicas para influir directamente en la plasticidad y/o diferenciación celular 16,17,18,19. De hecho, se ha demostrado claramente que la matriz extracelular (ECM) juega un papel clave en el control del destino celular. En particular, las señales biomecánicas y biofísicas producidas por la ECM regulan directamente los mecanismos moleculares y las vías de señalización, influyendo en el comportamiento y las funciones celulares20,21. Estos datos recientes han allanado el camino para el desarrollo de nuevos sistemas de cultivo 3D que imitan más de cerca el microambiente celular in vivo, replicando estímulos mecánicos y físicos que impulsan el comportamiento celular.

Aquí describimos un protocolo de dos pasos que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección, para generar células pluripotentes de mamíferos. En el primer paso, las células se incuban con la molécula desmetilante 5-aza-citidina (5-aza-CR). Este agente es capaz de inducir una significativa desmetilación global del ADN a través de un efecto combinado de la acción directa mediada por la translocación 2 (TET2) 8,10 y la inhibición indirecta de las ADN metiltransferasas (DNMT)22,23. Este paso induce la eliminación de los bloqueos epigenéticos con una posterior reactivación de la expresión génica relacionada con la pluripotencia y, por tanto, la generación de células de alta plasticidad 1,2,3,8,10, en adelante denominadas "células borradas epigenéticamente". En el segundo paso, las células se encapsulan en un sistema de cultivo 3D. Para ello, se utiliza como microbiorreactor el compuesto sintético hidrofóbico no reactivo politetrafluoroetileno (PTFE; con un tamaño de partícula de 1 μm), que permite la creación de un microambiente celular inalcanzable mediante el uso de sistemas tradicionales de cultivo 2D10. Las partículas de polvo de PTFE se adhieren a la superficie de la gota líquida en la que las células se vuelven a suspender y aíslan el núcleo líquido de la superficie de soporte, al tiempo que permiten el intercambio de gases entre el líquido interior y el entorno circundante24. El "microbiorreactor de PTFE" así obtenido, también conocido como "Mármol Líquido", anima a las células a interactuar libremente entre sí, promoviendo el reordenamiento celular 3D 25,26,27, y extiende y mantiene de forma estable el estado de alta plasticidad adquirido a través de señales relacionadas con la biomenosensibilidad 10.

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Protocolo

Todos los estudios fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Milán. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (NIH). El aislamiento de células humanas de individuos adultos sanos fue aprobado por el Comité de Ética del Ospedale Maggiore Policlinico, Milán. Todos los métodos de nuestro estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas.

1. Aislamiento de fibroblastos en la piel

NOTA: Todos los procedimientos descritos a continuación se pueden aplicar a fibroblastos aislados de diferentes especies de mamíferos, incluidos ratones, porcinos y humanos. Se aislaron células murinas de ratones machos de 7 semanas de edad y se recolectó tejido de piel porcina en el matadero local. Las células humanas se aislaron de pacientes adultos, después de un consentimiento informado por escrito.

  1. Preparar solución de gelatina porcina al 0,1%.
    1. Pesar 0,1 g de gelatina porcina y disolverla en 100 ml de agua. Esterilizar la solución de gelatina en autoclave antes de su uso.
    2. Cubra la placa de Petri de 35 mm con gelatina porcina al 0,1% añadiendo 1,5 ml de la solución preparada. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente.
  2. Cortar biopsias de piel de mamíferos (ratón, porcino y humano) de aproximadamente 2-5 cm de longitud y colocarlas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco que contiene una solución antimicótica antimicótica al 2%. Conservar a + 4 °C hasta su uso.
    NOTA: Las colecciones de biopsia deben realizarse de acuerdo y previa aprobación del Comité Ético, de acuerdo con las pautas establecidas.
  3. Lave extensamente las biopsias recolectadas tres veces en PBS estéril fresco que contenga una solución antimicótica antimicótica al 2%.
  4. Recoger biopsias del último lavado y colocarlas en una placa de Petri estéril de 100 mm. Utilice un bisturí estéril para cortarlos en trozos de aproximadamente 2 mm3 de tamaño.
  5. Al final de la incubación de 2 h, retire el exceso de solución de gelatina de la placa de Petri de 35 mm (descrita en el paso 1.1.2) y, utilizando una pinza quirúrgica estéril, coloque inmediatamente 5-6 fragmentos de piel en cada plato de cultivo precubierto.
  6. Humedezca los fragmentos añadiendo gotas de 100 μL de medio de aislamiento de fibroblastos (Tabla 1) sobre cada uno de ellos. Cultivo a 37 °C en incubadora de CO2 al 5%.
    NOTA: Para evitar que el medio se evapore, coloque la placa de Petri de 35 mm dentro de una placa de Petri de 100 mm o más grande que contenga agua estéril. Asegúrese de tapar ambas placas de Petri.
  7. Después de 24 h de cultivo, compruebe la cantidad del medio en la placa de Petri de cultivo de 35 mm. Si es necesario, agregue 500 μL de medio de aislamiento de fibroblastos para mantener húmedos los fragmentos.
  8. Retire con cuidado el medio y refresque al menos cada 2 días de cultivo con una pipeta.
  9. Cuando los fibroblastos comienzan a crecer fuera de la piel, los fragmentos colocados en la placa de Petri de 35 mm (descritos en el paso 1.5.) y comienzan a formar una monocapa celular (generalmente 6 días). Retire las piezas de piel con una pinza quirúrgica estéril y cultivo en 2 ml de medio de aislamiento de fibroblastos.
  10. Continúe cultivando la monocapa celular a 37 °C en incubadora de CO2 al 5% hasta una confluencia del 80% y refresque el medio cada dos días.

2. Cultivo de línea celular primaria de fibroblastos

  1. Cuando los fibroblastos alcancen el 80% de confluencia, retire cuidadosamente el medio de aislamiento de fibroblastos y lave las células tres veces con 3 ml de PBS que contengan una solución antimicótica al 1%.
  2. Para la separación celular, añadir 600 μL de solución de tripsina-EDTA al 0,25% en la placa de cultivo e incubar a 37 °C durante 3-5 min.
  3. Añadir 5,4 ml de medio de cultivo de fibroblastos para neutralizar la tripsina cuando las células comiencen a desprenderse de la placa de cultivo (Tabla 1).
  4. Desalojar las células mediante pipeteos repetidos y suaves. Placa de células en nuevas placas de cultivo (sin gelatina), manteniendo la relación de paso entre 1:2 y 1:4 (dependiendo de la tasa de crecimiento).
    NOTA: La centrifugación no es necesaria.
  5. Mantener las células en cultivo y cambiar de medio cada 2 días, hasta que hayan alcanzado el 80% de confluencia y pasarlas.
    NOTA: Propague los fibroblastos dos veces por semana para mantener un crecimiento vigoroso.

3. Exposición de fibroblastos a 5-aza-CR

  1. Prepare una solución de stock fresca de 1 mM 5-aza-CR.
    1. Pesar 2,44 mg de 5-aza-CR y disolverlo en 10 ml de DMEM alto en glucosa. Resuspend el polvo por vórtice. Esterilizar la solución con un filtro de 0,22 μm.
      NOTA: La solución madre 5-aza-CR debe prepararse inmediatamente antes de su uso.
    2. Preparar la solución de trabajo 5-aza-CR diluyendo 1 μL de solución madre de 5-aza-CR (3.1.1.) en 1 ml de medio de cultivo de fibroblastos.
      NOTA: La concentración de solución de trabajo 5-aza-CR es de 1 μM 1,2,3,8,9.
  2. Tripsinizar las células como se describió anteriormente (2.1.-2.3.) y desalojar las células mediante el pipeteo repetido y suave.
  3. Recoge la suspensión celular y transfiérela a un tubo cónico.
  4. Cuente las células utilizando una cámara de conteo bajo un microscopio óptico a temperatura ambiente. Calcular el volumen de medio necesario para volver a suspender células para obtener 4 x 104 células en 30 μL de medio de cultivo de fibroblastos suplementado con 1 μM 5-aza-CR (ver paso 3.1.2.).
    NOTA: La fórmula a utilizar depende del tipo específico de cámara.
    figure-protocol-6228
  5. Centrifugar la suspensión celular a 150 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Retirar el sobrenadante y el pellet de resuspend con el medio de cultivo de fibroblastos suplementado con 1 μM 5-aza-CR (ver paso 3.1.2.). Para el volumen del medio de cultivo de fibroblastos que se va a utilizar, véase el paso 3.4.
    NOTA: Como control negativo, las células resuspendentes obtienen la misma concentración en medio de cultivo de fibroblastos sin 5-aza-CR y proceden con la encapsulación celular en polvo de PTFE (paso 4.1.-4.13.).

4. Encapsulación de fibroblastos en microbiorreactores de PTFE

  1. Llene una placa de Petri de 35 mm con polvo de politetrafluoroetileno (PTFE) para producir un lecho (Figura 1A).
    NOTA: Utilice placas de Petri de bacteriología de 35 mm para evitar la adhesión de mármol líquido. Para obtener una cáscara delgada hidrofóbica y porosa, use un polvo de PTFE con un tamaño de partícula promedio de 1 μm y producido con una molienda máxima de 2.0 NPIRI. Esto permite la creación de mármoles líquidos permeables al gas. Además, el recubrimiento translúcido facilita la observación de los procesos de agregación celular en tiempo real Un tamaño de partícula más grande conduce a una alta polidispersidad que puede causar una evaporación elevada, deformidad y pérdida de la forma esférica, y la disolución prematura de los microbiorreactores.
  2. Dispensar 30 μL de gota única que contenga 4 x 104 células (ver pasos 3.4.- 3.5.) sobre el lecho de polvo (Figura 1B).
  3. Gire suavemente la placa de Petri de 35 mm en un movimiento circular para asegurarse de que el polvo PFTE cubra completamente la superficie de la gota líquida para formar un microbiorreactor de mármol líquido (Figura 1C).
  4. Recoja el microbiorreactor de mármol líquido utilizando una punta de pipeta de 1.000 μL, cortada en el borde, para acomodar el diámetro del mármol (Figura 1D, E). Coloque el microbiorreactor de mármol líquido en una placa de Petri de bacteriología limpia para estabilizarlo (Figura 1F).
    NOTA: Para crear una fricción para agarrar la canica dentro de la punta, corte las puntas de la pipeta con un diámetro aproximadamente ligeramente menor que el diámetro de la canica líquida.
  5. Transfiera el microbiorreactor de mármol líquido de la placa de Petri a una placa de 96 pocillos (una canica/pozo) (Figura 1G).
  6. Agregue lentamente 100 μL de medios desde el margen del pozo. El microbiorreactor comienza a flotar sobre el medio (Figura 1H).
    NOTA: El microbiorreactor se rompe en contacto directo con líquido, debido a la interrupción de la hidrofobicidad del PTFE. Como enfoque alternativo, los microbiorreactores de mármol líquido se pueden colocar individualmente en un plato de cultivo de bacteriología de 35 mm. En este caso, para evitar la evaporación del mármol líquido, la placa de Petri de 35 mm que contiene el microbiorreactor debe insertarse en una placa de Petri de 100 mm, previamente alicitada con agua estéril.
  7. Incubar microbiorreactor de mármol líquido durante 18 h a 37 °C en incubadora 5% CO2 1,2,3,8,9.
    NOTA: El tamaño de partícula de PTFE de 1 μm puede garantizar un intercambio de gases óptimo entre el líquido interior y el entorno circundante.
  8. Después de la incubación de 5-aza-CR durante 18 h, recoja el microbiorreactor de mármol líquido utilizando una punta de pipeta de 1.000 μL cortada en el borde (ver paso 4.5).
  9. Coloque el microbiorreactor en una nueva placa de Petri bacteriológica de 35 mm (Figura 1D-F).
  10. Use una aguja para perforar el mármol líquido y romperlo.
  11. Recuperar esferoides formados con una punta de pipeta de 200 μL, cortada en el borde, bajo un estereomicroscopio (Figura 1I,J).
    NOTA: Las células borradas epigenéticamente encapsuladas en PTFE forman una estructura esférica 3D (un agregado en cada mármol líquido).
  12. Para evaluar la adquisición del estado pluripotente en respuesta a 5-aza-CR, comprobar el inicio de la expresión génica relacionada con la pluripotencia, OCT4, NANOG, REX1 y SOX2, mediante PCR cualitativa (Tabla 2).
  13. Continúe con el segundo paso del protocolo como se describe a continuación.

5. Cultivo en microbiorreactores de PTFE de células borradas epigenéticamente

  1. Preparar medio de cultivo ESC fresco (Tabla 1).
  2. Transferir organoides en una placa de Petri que contenga medio ESC para lavar los residuos de 5-aza-CR (ver pasos 5.1.-5.2.).
  3. Preparar una nueva placa de Petri bacteriológica de 35 mm que contenga lecho de polvo de PTFE (véase también el paso 4.1.).
  4. Dispensar un solo organoide en una gota de medio de cultivo ESC de 30 μL sobre el lecho de polvo utilizando una punta de pipeta de 200 μL, cortada en el borde (ver pasos 4.9.; 5.3.).
  5. Gire suavemente la placa de Petri de 35 mm en un movimiento circular para formar un nuevo microbiorreactor de mármol líquido, recójalo con una punta de pipeta de 1.000 μL, corte en el borde y coloque el microbiorreactor recién formado en un pozo de placa de 96 pocillos (una canica / pozo) (ver pasos 4.3.-4.6.).
  6. Para hacer flotar los microbiorreactores, añadir 100 μL de medios desde el margen del pozo para bañar lentamente el mármol (véase la nota 4.7.).
  7. Cultive microbiorreactores de mármol líquido a 37 °C en incubadora de CO2 al 5% durante el tiempo que sea necesario. Cambiar de medio cada dos días, siguiendo el procedimiento descrito en 5.3.-5.7.
    NOTA: En el presente manuscrito se proporcionan los resultados obtenidos con cultivo de organoides durante 28 días. Sin embargo, si es necesario, se puede realizar un período de cultivo más largo.

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Resultados

El presente protocolo describe todos los pasos a realizar para generar y mantener de forma estable las células pluripotentes de mamíferos a partir de células somáticas adultas. Este método ha tenido éxito con fibroblastos aislados de diferentes especies de mamíferos, a saber, ratones, cerdos y humanos. Los resultados representativos aquí reportados se obtienen de todas las líneas celulares, independientemente de la especie de origen.

Los análisis morfológicos muestran que, tras 18 h...

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Discusión

Durante las últimas décadas, varios estudios se centraron en el desarrollo de estrategias para revertir una célula diferenciada terminalmente hacia un estado menos comprometido y más permisivo. El protocolo aquí descrito permite la generación y el mantenimiento a largo plazo de células pluripotentes a partir de células adultas maduras diferenciadas terminalmente. El método combina dos pasos independientes que implican la inducción de un alto estado permisivo que se logra a través del borrado epigenético quím...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación Carraresi y MiND FoodS Hub ID: 1176436. Todos los autores son miembros de la Acción COST CA16119 Guía y aptitud celular total 3-D in vitro (CellFit).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM7522Component of ESC medium
5-AzacytidineSigma-AldrichA23855-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing
AdenosineSigma-AldrichA4036Component of nucleoside mix for ESC medium
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)Sigma-AldrichA5955Component of fibroblast and ESC media
CFX96 Real-Time PCRBio-Rad LaboratoriesNAThermal cycler for quantitative PCR
CytidineSigma-AldrichC4654Component of nucleoside mix for ESC medium
DMEM, high glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific41966052For fibroblast isolation and culture medium
DMEM, low glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific31885023For ESC medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD5652PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification KitThermo Fisher Scientific61021mRNA estraction
ESGRO Recombinant Mouse LIF ProteinSigma-AldrichESG1106Component of ESC medium
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivatedThermo Fisher Scientific10500064Component of fibroblast and ESC media
FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human ProteinThermo Fisher ScientificPHG0024Component of ESC medium
Gelatin from porcine skinSigma-AldrichG1890For dish coating
GeneAmp PCR System 2700Applied BiosystemsNAThermal cycler for qualitative PCR
Global DNA Methylation ELISA KitCELL BIOLABSSTA-380Methylation study
GoTaq G2 Flexi DNA PolymerasePromegaM7801Qualitative PCR
GuanosineSigma-AldrichG6264Component of nucleoside mix for ESC medium
Ham's F-10 Nutrient MixThermo Fisher Scientific31550031For ESC medium
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828028Component of ESC medium
KOVA glasstic slide 10 with gridsHycor Biomedical87144For cell counting
Leica MZ APO Stereo MicroscopeLeicaNAFor organoid observation
L-Glutamine solutionSigma-AldrichG7513Component of fibroblast and ESC media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140035Component of ESC medium
Millex-GS 0.22 µm pore filtersMilliporeSLGS033SBFor solution sterilization
M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point MutantPromegaM3681mRNA reverse transcription
Multiskan FC Microplate PhotometerThermo Fisher Scientific51119000For ELISA plate reading
Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast MicroscopeNikonNAFor cell observation
Perkin Elmer Thermal Cycler 480Perkin ElmerNAThermal cycler for reverse transcription
Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle sizeSigma-Aldrich430935For generating micro-bioreactor
PureLink Genomic DNA Mini KitThermo Fisher ScientificK182001Genomic DNA estraction
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT KitThermo Fisher ScientificAM1728Quantitative PCR
ThymidineSigma-AldrichT1895Component of nucleoside mix for ESC medium
Tissue Culture Dish 100X20 mm, StandardSarstedt833902For fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, StandardSarstedt833900For Fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, SuspensionSarstedt833900500Bacteriology petri dish for liquid marble culture
Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,FSarstedt833924005For liquid marble culture
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT3924For fibroblast dissociation
Tube 15ml, 120x17mm, PSSarstedt62553041For cell suspension centrifugation
UridineSigma-AldrichU3003Component of nucleoside mix for ESC medium

Referencias

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