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  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La integración de diversas entradas sinápticas a las neuronas se mide mejor en una preparación que preserva todos los núcleos presinápticos para la sincronización natural y la plasticidad del circuito, pero las rebanadas cerebrales suelen cortar muchas conexiones. Desarrollamos una rebanada cerebral modificada para imitar la actividad del circuito in vivo mientras mantenemos la capacidad de experimentación in vitro.

Resumen

Las técnicas de electrofisiología de rebanadas in vitro miden la actividad de una sola célula con una resolución eléctrica y temporal precisa. Las rebanadas cerebrales deben ser relativamente delgadas para visualizar y acceder adecuadamente a las neuronas para la sujeción de parches o imágenes, y el examen in vitro de los circuitos cerebrales se limita sólo a lo que está físicamente presente en la rebanada aguda. Para mantener los beneficios de la experimentación in vitro en rodajas conservando al mismo tiempo una porción más grande de núcleos presinápticos, desarrollamos una nueva preparación de la rebanada. Esta "rebanada de cuña" fue diseñada para grabaciones electrofisiología de parches-pinza para caracterizar las diversas entradas monoaurales impulsadas por sonido a las neuronas olivocochlear medial (MOC) en el tronco cerebral. Estas neuronas reciben sus entradas excitatorias e inhibitorias aferentes primarias de las neuronas activadas por estímulos en el oído contralateral y el núcleo coclear correspondiente (CN). Se diseñó una rebanada cerebral asimétrica que es más gruesa en el dominio rostro-caudal en el borde lateral de un hemisferio y luego se adelgaza hacia el borde lateral del hemisferio opuesto. Esta rebanada contiene, en el lado grueso, la raíz nerviosa auditiva que transmite información sobre los estímulos auditivos al cerebro, el circuito NC intrínseco, y tanto el excitatorio disynaptic y trisináptica inhibitorio aferente vías que convergen en las neuronas MOC contralaterales. La grabación se realiza a partir de neuronas MOC en el lado delgado de la rebanada, donde se visualizan utilizando óptica DIC para experimentos típicos de abrazadera de parche. La estimulación directa del nervio auditivo se realiza al entrar en el tronco cerebral auditivo, lo que permite que la actividad intrínseca del circuito CN y la plasticidad sináptica se produzcan en las sinapsis aguas arriba de las neuronas MOC. Con esta técnica, se puede imitar la activación del circuito in vivo lo más cerca posible dentro de la rebanada. Esta preparación de la rebanada de cuña es aplicable a otros circuitos cerebrales donde los análisis de circuitos se beneficiarían de la preservación de la conectividad aguas arriba y las entradas de largo alcance, en combinación con las ventajas técnicas de la fisiología in vitro de las rebanadas.

Introducción

La observación de la actividad de los circuitos neuronales se realiza idealmente con entradas sensoriales nativas y retroalimentación, y conectividad intacta entre las regiones cerebrales, in vivo. Sin embargo, la realización de experimentos que dan resolución de una sola célula de la función del circuito neural todavía está limitada por desafíos técnicos en el cerebro intacto. Mientras que la electrofisiología extracelular in vivo o los métodos de imagen multifoton se pueden utilizar para investigar la actividad en sistemas nerviosos intactos, interpretar cómo diferentes entradas integran o miden las entradas sinápticas de subtrasinas sigue siendo difícil. Las grabaciones de células enteras in vivo superan estas limitaciones, pero son difíciles de realizar, incluso en regiones cerebrales a las que se puede acceder fácilmente. Los desafíos técnicos de los experimentos de resolución de una sola célula se amplifican aún más en ciertas poblaciones de neuronas que se encuentran en lo profundo del cerebro, o en poblaciones espacialmente difusas que requieren herramientas genéticas para localizar células in vivo (por ejemplo, expresión genética de channelrhodopsin emparejada con registro de optrode) o identificación histoquímica post-hoc después de registrar el etiquetado del sitio (por ejemplo, con marcadores específicos de la neurotransmisión). Al estar ubicadas difusamente cerca de la superficie ventral del tronco cerebral, las neuronas olivocochlear medial (MOC) sufren de las limitaciones anteriores1,por lo que son extremadamente difíciles de acceder para la experimentación in vivo.

Las rebanadas cerebrales (espesor de 100-500 m) se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar los circuitos cerebrales, incluyendo circuitos auditivos de tronco encefálica, debido a la segregación física de las neuronas conectadas que se encuentran dentro de la misma rebanada2,3,4,5,6,7,8,9. En otros laboratorios se han empleado experimentos con rodajas mucho más gruesas (>1 mm) para entender cómo se integran las entradas bilaterales en áreas del complejo olivar superior (SOC), incluyendo la aceituna superior medial10,11. Estas rebanadas se prepararon de tal manera que los axones del nervio auditivo (AN) permanecieron intactos dentro de la rebanada y fueron estimulados eléctricamente para iniciar la liberación de neurotransmisores sinápticos en el CN, imitando la actividad de las neuronas auditivas de primer orden, ya que responderían al sonido. Una de las principales desventajas de estas rebanadas gruesas es la visibilidad de las neuronas para las grabaciones electrofisiológicas de la abrazadera de parches ("parcheing"). Parchear se vuelve cada vez más difícil a medida que los numerosos axones de esta zona se miinantican conedades de 12,13,14,15años, haciendo que el tejido ópticamente denso y oscureciendo las neuronas incluso en una rebanada cerebral típica, delgada. Nuestro objetivo es crear preparaciones in vitro que se asemejen más a la conectividad de circuito de las grabaciones in vivo, pero con las capacidades de grabación de alto rendimiento y alta resolución de la electrofisiología de la abrazadera de parche guiada visualmente en las rebanadas cerebrales.

Nuestro laboratorio investiga la fisiología de las neuronas del sistema auditivo eferente, incluidas las neuronas MOC. Estas neuronas colinérgicas proporcionan una retroalimentación eferente a la cóclea modulando la actividad de las células pilosas externas (OHC)16,17,18,19,20. Estudios previos han demostrado que esta modulación juega un papel en el control de ganancia en la cóclea21,22,23,24,25,26 y la protección contra el trauma acústico27,28,29,30,31,32,33. En ratones, las neuronas MOC se encuentran difusamente en el núcleo ventral del cuerpo trapezoidal (VNTB) en el tronco cerebral auditivo1. Nuestro grupo ha utilizado la línea de ratón ChAT-IRES-Cre cruzada con la línea de ratón reportero tdTomato para apuntar a las neuronas MOC en rebanadas de tronco cerebral bajo iluminación epifluorescente. Mostramos que las neuronas MOC reciben una aporte inhibitoria aferente del núcleo medial ipsilateral del cuerpo trapezoide (MNTB), que está excitado, a su vez, por axones de células tupidas globulares (GBC) en el núcleo coclear contralateral (CN)34,35,36,37,38. Además, las neuronas MOC probablemente reciben su entrada excitatoria de células T-estelares en el NC contralateral39,40,41. En conjunto, estos estudios muestran que las neuronas MOC reciben insumos excitatorios e inhibitorios derivados del mismo oído (contralateral). Sin embargo, las neuronas presinápticas, y sus axones convergentes en las neuronas MOC, no están lo suficientemente cerca unas de otras para estar completamente intactas en una preparación típica de la rebanada coronal. Para investigar cómo la integración de las entradas sinápticas a las neuronas MOC afecta a sus patrones de disparo potencial de acción, con un enfoque en la inhibición recién descrita, desarrollamos una preparación en la que podríamos estimular los diversos aferentes a las neuronas MOC de un oído de la manera más realista fisiológicamente posible, pero con los beneficios técnicos de los experimentos in vitro de la división cerebral.

La rebanada de cuña es una preparación de rodaja gruesa modificada diseñada para la investigación de la integración de circuitos en neuronas MOC (esquemática en la Figura 1A). En el lado grueso de la rebanada, la cuña contiene los axones cortados del nervio auditivo (llamado "raíz nerviosa auditiva" en lo sucesivo) a medida que entran en el tronco encefálica desde la periferia y la sinapsis en el NC. La raíz nerviosa auditiva se puede estimular eléctricamente para evocar la liberación de neurotransmisores y la activación sináptica de las células de la CN42completamenteintacta,43,44,45,46. Este formato de estimulación tiene varios beneficios para el análisis de circuitos. En primer lugar, en lugar de estimular directamente los axones T-estelar y GBC que proporcionan una entrada diferente a las neuronas MOC, estimulamos la AN para permitir la activación de circuitos intrínsecos abundantes en la NC. Estos circuitos modulan la salida de las neuronas CN a sus objetivos en todo el cerebro, incluyendo las neuronas MOC46,47,48,49,50,51. En segundo lugar, la activación polisináptica de los circuitos aferentes desde el AN a través de la CN aguas arriba de las neuronas MOC permite un tiempo de activación más natural y que la plasticidad se produzca en estas sinapsis como lo harían in vivo durante la estimulación auditiva. En tercer lugar, podemos variar nuestros patrones de estimulación para imitar la actividad ano. Por último, las proyecciones monoaurales excitatorias e inhibitorias a las neuronas MOC están intactas en la rodaja de cuña, y su integración se puede medir en una neurona MOC con la precisión de la electrofisiología de la abrazadera de parche. En su conjunto, este esquema de activación proporciona un circuito más intacto a las neuronas MOC en comparación con una preparación típica de la rebanada cerebral. Esta rebanada de cuña de tronco encefálica también se puede utilizar para investigar otras áreas auditivas que reciben aporte inhibitorio de MNTB ipsilateral incluyendo la aceituna superior lateral, núcleo olivario superior y aceituna medial superior10,11,52,53,54,55,56. Más allá de nuestra preparación específica, este método de corte se puede utilizar o modificar para evaluar otros sistemas con los beneficios de mantener la conectividad de entradas de largo alcance y mejorar la visualización de las neuronas para una variedad de electrofisiología de resolución de una sola célula o técnicas de imagen.

Este protocolo requiere el uso de una etapa vibratoria o una plataforma que se puede inclinar aproximadamente 15o. Aquí utilizamos una etapa magnética de 2 piezas disponible comercialmente donde la "etapa" es un disco de metal con un fondo curvo colocado en una "base de etapa" magnética cóncava. A continuación, se puede desplazar el escenario para ajustar el ángulo de corte. Los círculos concéntricos en la base del escenario se utilizan para estimar el ángulo de forma reproducible. La base de la etapa y la etapa se colocan en la cámara de corte, donde también se puede girar la base de la etapa magnética.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares/Instituto Nacional sobre Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación Comité de Cuidado y Uso Animal.

1. Preparaciones experimentales

NOTA: Los detalles relativos a la preparación de la rebanada, incluyendo la solución de corte, la temperatura de corte, la temperatura de incubación de rodajas y el aparato (etc.) son específicos para la preparación del tronco encefálico realizado en este experimento. Los detalles de incubación de rebanadas se pueden alterar por experiencia de laboratorio.

  1. Prepare soluciones internas para la sujeción de parches.
    1. Preparar la solución de abrazadera de tensión que contenga (en mM) 76 Cs-methanesulfonato, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-phosphocreatine, 5 QX-314 y 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Ajuste el pH a 7.2 con CsOH.
    2. Preparar la solución de abrazadera actual que contiene (en mM) 125 K-gluconato, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-phosphoatine y 0.01 Alexa Fluor-488 hidrasido. Ajuste el pH a 7.2 con KOH.
  2. Preparar 100 ml de agar al 4% añadiendo 4 g de agar a 100 ml de agua caliente (cerca de hervir). Coloque sobre la placa de agitación calentada para mantener la temperatura y revuelva hasta que se disuelva por completo. Vierta en platos Petri de plástico de 100 mm a aproximadamente 1 cm de profundidad y déjese enfriar. Refrigere hasta que sea necesario.
  3. Preparar 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contenga en mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4y 10 dextrosa. Burbuja con carbógeno (5% CO2 / 95% O2) durante al menos 10 min, luego ajuste el pH final a 7.4 con 1 M NaOH si es necesario. Mantener la oxigenación y el pH de la solución burbujeando continuamente con carbógeno durante todo el experimento.
  4. Preparar una solución de corte de 200 ml añadiendo 1 mM de ácido cifrénico a ACSF. Sonicar la solución en un baño de agua sonicante durante 10 minutos hasta que el ácido kynurenic se disuelva. Burbuja continua con carbógeno y colocar sobre hielo.
    ADVERTENCIA: Utilice el equipo de protección personal adecuado al manipular el ácido kynurenic.
  5. Monte una cuchilla adecuada en el vibratome siguiendo las instrucciones del fabricante. Enfríe la cámara de corte del vibratoma rodeándola con hielo.

2. Extirpación cerebral con raíz nerviosa auditiva intacta para la estimulación

NOTA: Los ratones para estos experimentos se obtuvieron cruzando ratones transgénicos ChAT-IRES-Cre en un fondo C57BL/6J con ratones reportero tdTomato (Ai14). Los ratones utilizados para la histología y la electrofisiología fueron después del inicio de la audición (P14-P23), que es alrededor de P12 en ratones. Las neuronas que expresan tdTomato en el núcleo ventral del cuerpo trapezoidal (VNTB) se han caracterizado previamente como neuronas MOC en esta líneade ratón 57.

  1. Eutanasiar (por ejemplo, asfixia deCO2) y decapitar al animal utilizando procedimientos institucionales aprobados.
  2. Con una cuchilla de afeitar, corta la piel en la línea media del cráneo desde la nariz hasta la parte posterior del cuello. Pelar hacia atrás la piel para exponer el cráneo.
  3. Usando tijeras pequeñas, haz una incisión en el cráneo a través de la línea media comenzando en la base (extremo caudal cerca de la médula espinal) del cráneo y continuando hacia la nariz.
  4. En la sutura lambda, haz cortes en el cráneo desde la línea media, lateral hacia la oreja en ambos lados. Pelar hacia atrás el cráneo para exponer el cerebro.
  5. Comenzando en el extremo rostral, levante suavemente el cerebro lejos del cráneo con una pequeña espátula de laboratorio o fórceps romos. Cortar el nervio óptico y continuar trabajando suavemente el cerebro hacia atrás, exponiendo la superficie ventral.
  6. Corte los nervios trigéminos pellizcándolos con fórceps finos cerca de la superficie ventral del tronco encefálica.
    NOTA: Haga esto cuidadosamente ya que el nervio vestibulocochlear se encuentra justo debajo de esto y necesita estar intacto para una estimulación eventual.
  7. Coloque la preparación en un plato de petri de vidrio lleno de solución de corte en frío. Coloque el plato debajo de un microscopio de disección. Burbuja suave con carbógeno.
  8. Recorta el nervio facial cerca del tronco encefálica y expone el nervio vestibulocochlear.
  9. Usando fórceps finos, empuja las puntas hacia el foramina donde el nervio vestibulocochlear sale del cráneo lo más lejos posible y pellizca el nervio para cortarlo, dejando la raíz nerviosa unida al tronco cerebral. Repite esto en el otro lado.
  10. Una vez que ambas raíces nerviosas estén libres, retire las meninges y la vasculatura de la superficie ventral del tronco encefálica cerca del cuerpo trapezoidal.
  11. Libera el cerebro completamente del cráneo pellizcando los nervios craneales restantes y el tejido conectivo teniendo cuidado de preservar la médula espinal restante si es posible.

3. Bloquear y montar el cerebro en el escenario (disco magnético)

  1. Preparar la superficie del cerebro para fijarse a la etapa bloqueando el cerebro a nivel del quiasmo óptico.
    1. Con la superficie ventral hacia arriba, estabilice el cerebro usando una herramienta contundente para inmovilizar suavemente la médula espinal de modo que el cerebro no se incline durante el siguiente paso.
    2. A nivel del quiasmo óptico, usa fórceps abiertos para crear el plano para bloquear el cerebro insertando a través del cerebro hasta la parte inferior del plato. Inserte los fórceps en un ángulo de aproximadamente 20o desde la vertical para que las puntas salgan de la superficie dorsal del cerebro caudal al quiasmo óptico.
    3. Corte a lo largo de los fórceps con la cuchilla de afeitar.
  2. Pega el cerebro a la superficie de la etapa.
    1. Preparar un bloque pequeño (1 cm3)de agar al 4% para apoyar el cerebro.
    2. Coloque una pequeña gota de pegamento en el escenario y extiéndalo en un rectángulo para que tanto el cerebro como el bloque de agar puedan ser pegados hacia abajo.
    3. Usando fórceps, levante cuidadosamente el cerebro y deslice suavemente el exceso de líquido usando el borde de una toalla de papel. Coloque la superficie bloqueada sobre el pegamento, la superficie ventral estará hacia la hoja durante el corte.
    4. Empuje el bloque de agar suavemente contra la superficie dorsal del cerebro para apoyarlo durante el corte y para asegurar el posicionamiento adecuado del cerebro (es decir, ángulo).

4. Cortar el cerebro para crear rodajas de cuña

NOTA: Preparar una rebanada cerebral usando vibratomo que tenga la raíz nerviosa coclear en el lado grueso y las neuronas olivocochlear medial (MOC) y el núcleo medial del cuerpo trapezoidal (MNTB) en el lado delgado.

  1. Coloque el disco magnético con el cerebro conectado en la base del escenario y colóquelo en la cámara de corte con la superficie ventral del cerebro orientada hacia la hoja.
  2. Llene la cámara con solución de corte frío y burbuja con carbógeno.
  3. Baje la hoja en la solución y corte las rodajas caudal a la región de interés para asegurarse de que las rebanadas son simétricas. Si los sectores parecen asimétricos, incline ligeramente el escenario para obtener simetría.
    NOTA: Las velocidades de la hoja entre 0,05-0,10 mm/s fueron eficaces para cortar rodajas saludables y pueden variar dependiendo de la edad del animal y la región cerebral.
  4. Una vez que las rebanadas son simétricas, cambie la etapa de 15o (correspondiente a aproximadamente 3 anillos concéntricos en la base del escenario) a un lado.
    NOTA: Aleje el escenario de la raíz nerviosa auditiva que desea conservar en la rebanada.
  5. Continúe cortando cuidadosamente hasta que la raíz del nervio auditivo esté cerca de la superficie de un lado, y el nervio facial se pueda ver en la superficie del otro lado.
  6. Cambie la etapa hacia atrás 15o a la posición original.
  7. Aleje la hoja del tejido y gire la base de la etapa 90o para que el borde lateral del lado delgado esté mirando hacia la hoja. Baje la hoja varios cientos de micras y luego lentamente acerca la hoja al borde del tejido. Repita esto hasta que la hoja toque el borde lateral. Baje la hoja al espesor deseado del borde delgado de la rebanada, aquí doscientos micras adicionales.
    NOTA: La rebanada resultante es idealmente de 300 mm de espesor a nivel del núcleo ventral del cuerpo trapezoidal (VNTB) en el lado donde se llevará a cabo la sujeción del parche.
  8. Mueva la hoja hacia atrás lejos del tejido y gire la base de la etapa hacia atrás para que la superficie ventral esté orientada hacia ella.
  9. Haga el corte que designe la superficie rostral de la rebanada de cuña. Transfiera la rebanada a un pedazo de papel de interfaz (1 cm2) superficie caudal hacia abajo. Mueva la rodaja a la cámara de incubación u otro aparato de incubación adecuado para su recuperación (30 min a 35oC).
    NOTA: El nervio facial debe ser visible en ambos hemisferios de la rebanada en la superficie rostral (ver Figura 1B).

5. Configuración y grabación de electrofisiología

  1. Coloque la rodaja de cuña en la cámara de grabación y fije la rodaja con un arpa o un sistema estabilizador. Perfunda el tejido continuamente a una velocidad de 7-10 ml/min con ACSF caliente (35 oC) burbujeado con carbógeno.
  2. Identifique las neuronas MOC etiquetadas genéticamente en el VNTB utilizando epifluorescencia con filtros de emisión de 561 nm para grabaciones de abrazaderas de parches. Voltear sector si no hay celdas potencialmente parcheables.
  3. Usando la óptica DIC, concéntrese en la raíz nerviosa auditiva en el lado grueso de la rebanada y use un micromaniprógrafo para mover el electrodo estimulante de tungsteno bipolar hasta la raíz del nervio auditivo y suavemente en la superficie del tejido.
    NOTA: Los electrodos de aspiración se han utilizado en experimentos de estimulación del nervio auditivo en otros laboratorios. Los electrodos de vidrio Theta, o métodos de estimulación óptica se pueden emplear si es aplicable a otras preparaciones específicas.
  4. Mueva el campo de visión de nuevo al VNTB para elegir una neurona MOC para apuntar a la electrofisiología de la abrazadera de parche.
  5. Llene una pipeta de grabación con la solución interna adecuada para el experimento propuesto.
  6. Parche y registro de la neurona MOC en la configuración de células enteras. Compensar la capacitancia de la membrana y la resistencia en serie si es necesario.
  7. Ajuste la amplitud de estimulación eléctrica de la raíz nerviosa auditiva para obtener eventos postsinápticos consistentes en la neurona MOC.
    NOTA: Puede ser necesario mover el electrodo de estimulación.
  8. Ejecute protocolos de estimulación adecuados para observar corrientes sinápticas evocadas en MOC (pinza de tensión) o patrones potenciales de acción (pinza de corriente).
    NOTA: La preparación de la rebanada de cuña se puede utilizar con cualquier herramienta típica de sujeción de parches, como grabaciones de parches sueltos, farmacología, optogenética, imágenes de calcio, eliminación de descapatas de neurotransmisores, etc.

6. Confirmación histológica de núcleos de tronco encefálica

NOTA: Esto se hace con tinción de color violeta cresil, en rodaja de cuña fija y re-seccionada. Este método permite la visualización de núcleos que están contenidos en el sector.

  1. Después de preparar una rodaja de cuña, sumerja la rodaja en fijador (4% PFA en PBS) durante la noche. Enjuagar la rodaja 3x durante 10 minutos en PBS (temperatura ambiente en una coctelera), luego colocar en 30% sacarosa en PBS durante la noche a 4 oC para crioprotecer.
  2. Vuelva a seccionar la rebanada en un microtoma de congelación (40-70 mm) y recoja las secciones seriales en una placa de 24 pozos en PBS.
  3. Montar secciones sobre portaobjetos recubiertos de gelatina y dejar secar completamente. Coloque las diapositivas en el carro deslizante.
  4. Preparar soluciones violetas cresil
    1. Preparar 1% de acetato de crema violeta mezclando 5 g de acetato de crema violeta en 500 ml dH2O
    2. Preparar el tampón de acetato preparando primero la solución de 90 ml A (ácido acético glacial de 540 ml + 89,46 ml de dH2O) y 10 ml de solución B (136 mg de acetato de sodio en 10 ml de dH2O). Combine la solución A y la solución B produciendo el tampón de acetato.
    3. Combine 1% de acetato de crema violeta con el tampón de acetato 1:1 para 0.5% de crema violeta en tampón de acetato. Filtrar antes de usar.
    4. Preparar 95% y 70% de etanol diluyendo 100% etanol con volúmenes adecuados de dH2O
  5. Realice el protocolo de tinción violeta de cresil. Mueva el carro deslizante a través de las bandejas de solución, hinchando el exceso de solución en una toalla de papel entre las bandejas: xileno – 5 min; 95% etanol – 3 min; 70% etanol – 3 min; dH2O – 3 min; 0.5% solución violeta cresil – 8-14 min monitoreo con frecuencia hasta que la tinción nuclear se convierte en púrpura oscuro; dH2O – 3 min; 70% etanol – 3 min; 95% etanol – 1-2 min; 100% etanol – diapositivas de inmersión dos veces; xileno – 5 min; xileno: 25 min hasta que se realiza el montaje.
    ADVERTENCIA: Utilice xilenes sólo debajo de una campana de humos.
  6. Retire las diapositivas del xileno de uno en uno e inmediatamente coloque los resbalones de la cubierta en las diapositivas utilizando el medio de montaje. Deje que el medio de montaje se seque (durante la noche).
  7. Secciones de imagen.

7. Etiquetado de biocitina para el rastreo anterogrado de axones en tejido vivo y sin fijo

  1. Prepare una rodaja de cuña como arriba (Pasos 2-4).
  2. Transfiera el corte al papel de interfaz (1 cm2). Bajo un microscopio de disección, localice la NC en el lado grueso de la rebanada.
  3. Retire con cuidado el exceso de ACSF del área que rodea la rebanada retorciendo una esquina de un papel tisú para alejar el ACSF del tejido. Esto evita que la biocytina se propague a las áreas circundantes de la rebanada, lo que podría conducir a la absorción en las células fuera de la NC.
  4. Con fórceps finos, seleccione un pequeño cristal de biocytin y colóquelo en la superficie del CN. Presione suavemente el cristal en el tejido para promover el contacto con las neuronas y la posterior absorción en somata. Repita este paso para cubrir la región de interés deseada, en este caso las regiones CN que contienen neuronas T-estelares y GBC.
  5. Coloque la rebanada en una cámara de incubación. Dejar incubar la rebanada durante 2-4 h a 35oC para permitir la absorción y el transporte de la biocictina. Después de la incubación, enjuague la rodaja en ACSF para eliminar las partículas de biocitina.
  6. Colocar la rebanada en fijador (4% PFA en PBS) durante la noche. Enjuagar 3x durante 10 min en PBS.
  7. Cryoprotect rebanada en 30% sacarosa en PBS durante la noche a 4 oC o hasta que la rodaja se hunda.
  8. Resecar el tejido para producir secciones transversales en un microtoma de congelación a 70-100 mm.
  9. Procesar tejido utilizando métodos inmunohistoquímicos estándar con una estreptavidina conjugada fluorescentemente.
    NOTA: Se puede realizar inmunohistoquímica adicional en las secciones si es útil para etiquetar cuerpos celulares presinápticos, axones, receptores u otras moléculas sinápticas importantes para la visualización de circuitos (es decir, los pasos de anticuerpos primarios no deben afectar negativamente a la visualización secundaria de la biocitina).
  10. Imagen del tejido.

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Resultados

Examen histológico de la rodaja de cuña
Para nuestra investigación de la función de la neurona del tronco encefálica auditiva, la preparación de la rebanada de cuña fue diseñada para contener la raíz nerviosa auditiva y la NC contralateral a las neuronas MOC dirigidas a las grabaciones (ejemplo de sector mostrado en la Figura 1B). El examen histológico inicial de la preparación es importante para confirmar que la rebanada contiene los núcleos necesarios para l...

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Discusión

El procedimiento de corte descrito aquí llamado una rebanada de cuña es potente para mantener intacta el circuito neuronal presináptico, pero con la accesibilidad de la experimentación de la rebanada cerebral para el análisis de la función neuronal. Se debe tener mucho cuidado en varios pasos iniciales con el fin de maximizar la utilidad de la preparación para el análisis de circuitos. Las dimensiones de la cuña deben confirmarse mediante el examen histológico, que es fundamental para la confirmación de que ta...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Experimental Preparations
Agar, powderFisher ScientificBP14235004% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning
AlexaFluor Hydrazide 488InvitrogenA10436Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch
Analytical BalanceGeneses Scientific (Intramalls)AV114Weighing chemicals
Double edged razor bladeTed Pella121-6Vibratome cutting blade
Kynurenic acid (5g)Sigma AldrichK3375-5GSlicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping
pH MeterFisher Scientific (Intramalls)13-620-451Solution pH tester
Plastic petri dishes 100mm dia X 20mmFisher Scientific (Intramalls)12-556-0024% Agar Prep
Stirring HotplateFisher Scientific (Intramalls)11-500-150Heating for 4% Agar preparation
Dissection and Slicing
BiocytinSigma AldrichB4261-250MGChemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)
Dissecting MicroscopeAmscopeSM-1BNFor precision dissection during brain removal
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-20Fine forceps dissection tool
Economy tweezers #3WPI501976Forceps dissection tool
Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm HFisher Scientific (Intramalls)08-747EDissection dish
Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)Thomas Scientific1220823Slice incubation/biocytin application
Leica VT1200S VibratomeLeica1491200S001Vibratome for wedge slice sectioning
Mayo scissorsRobozRS-6872Dissection tool
Single-edged carbon steel bladesFisher Scientific (Intramalls)12-640Razor blade for dissection
Specimen disc, orientingLeica14048142068Specialized vibratome stage for reproducible tilting
SpoonulaFisherSci14-375-10Dissection tool
Super GlueNewegg15187Used for glueing tissue to vibratome stage
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-09Dissection tool
Electrophysiology
A1R Upright Confocal MicroscopeNikon InstrumentsElectrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology
Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm longSutter InstrumentBF150-110-10Patch clamping pipette glass
Electrode Filler MicroFilWPICMF20GPatch electrode pipette filler
In-line solution heaterWarner Instruments (GSAdvantage)SH-27BSlice perfusion system heater
Multi-Micromanipulator SystemsSutter IntrumentsMPC-200 with MP285Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement
P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettesSutter instrumentsFG-P1000Patch clamp pipetter puller
Patch-clamp amplifier and SoftwareHEKAEPC-10 / Patchmaster NextCan be any amplifier/software
Recording ChamberWarner InstrumentsRC26GSlice "bath" during recording
Recording Chamber HarpWarner Instruments640253Stablizes slice during electrophysiology recording
Slice Incubation ChamberCustom BuildHeated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing
Stimulus isolation unitA.M.P.I.Iso-FlexStimulus isolation unit for electrophysiology
Syringe 60CCFischer Scientific (Intramalls)14-820-11Electrophysiology perfusion fluid handling
Temperature controllerWarner Instruments (GSAdvantage)TC-324CSlice perfusion system temperature controller
Tubing 1/8 OD 1/16 IDFischer Scientific (Intramalls)14-171-129Electrophysiology perfusion fluid handling
Tugsten concentric bipolar microelectrodeWPITM33CCINSStimulating electrode for electrophysiology
Histology
24 well PlateFisher Scientific (Intramalls)12-556006Histology slice collection and immunostaining
Alexa Fluor 488 StreptavidinJackson Immuno labs016-540-084Secondary antibody for biocytin visualization
Corning Orbital ShakerSigmaCLS6780FPShaker for immunohistochemistry agitation
Cresyl Violet AcetateSigma Aldrich (Intramalls)C5042-10GCellular stain for histology
Disposable Microtome BladesFisher Scientific22-210-052Sliding microtome blade
Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2umFisher Scientific (Intramalls)09-740-34ASyringe filter for filling recording pipettes with internal solution
Fluoromount-G Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01Immunohistochemistry fluorescence mounting medium
glass slide staining dish with rackFisher Scientific (Intramalls)08-812Cresyl Violet staining chamber
Microm HM450 Sliding MicrotomeThermoFisher910020Freezing microtome for histology
Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mmFisher Scientific (Intramalls)12-543DHistochemistry slide cover glass
Permount mounting mediumFisher ScientificSP15-100Cresyl violet section mounting medium
Superfrost SlidesFisher Scientific22-034980Histology slides

Referencias

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