Demostración de complejos heterólogos formados por proteínas de membrana tipo III residentes de Golgi utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida

Resumen

El protocolo presentado aquí está destinado a demostrar la ocurrencia de interacciones heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi con N- y/o C-termini expuestas citoplasmáticamente en células vivas de mamíferos utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida.

Resumen

El objetivo de este protocolo es explorar la aplicabilidad de la variante más reciente de complementación de luciferasa dividida para demostrar complejos heterólogos formados por transportadores de azúcar de nucleótidos (NST). Estas proteínas multitransmembrana residentes en ER y Golgi transportan los azúcares nucleótidos sintetizados citoplasmáticamente a través de las membranas de orgánulos para suministrar enzimas que median la glicosilación con sus sustratos. Los NST existen como dímeros y/oligómeros superiores. También se han reportado interacciones heterólogas entre diferentes NST. Para verificar si la técnica es adecuada para estudiar el fenómeno de heteromerización de NST, la probamos contra una combinación de los dos NST residentes en Golgi que previamente se ha demostrado que se asocian por varios otros medios. El ensayo de complementación con luciferasa parece ser particularmente adecuado para estudiar las interacciones entre las proteínas de membrana residentes en Golgi, ya que no requiere altos niveles de expresión, que a menudo desencadenan una mala localización de las proteínas y aumentan el riesgo de falsos positivos.

Introducción

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para verificar la presencia de interacciones heterólogas entre las proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi en células humanas transfectadas transitoriamente utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida. El procedimiento ha sido probado más extensamente contra transportadores de azúcar de nucleótidos (NST), pero también pudimos obtener resultados positivos para otras proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi cuyos N- y / o C-termini se enfrentan al citoplasma.

Nuestro grupo de investigación explora el papel de los NST en la glico....

Protocolo

1. Generación de plásmidos de expresión

1. Examinar la topología de membrana de las proteínas de interés utilizando una herramienta de predicción de topología.
2. Diseñar la estrategia de clonación para que los fragmentos más grandes y más pequeños se enfrenten al citoplasma una vez que las proteínas de fusión se hayan insertado en las membranas de Golgi. Si, como en el caso aquí presentado, tanto N- como C-termini de las proteínas de interés están orientadas citoplasmáticamente, etiquete las proteínas de ocho maneras posibles (ver Figura 1B). Si N- o C-terminal de una o ambas proteínas de interés está orientada luminalmente....

Resultados

Para obtener los datos más fiables en este enfoque se deben probar todas las combinaciones posibles (ver Figura 1). Paralelamente, deben incluirse controles positivos y negativos. El control positivo debe consistir en las dos proteínas que se sabe que interactúan, de las cuales una está fusionada con el fragmento más grande y la otra está fusionada con el fragmento más pequeño. El control negativo idealmente debería consistir en las dos proteínas de membrana de tipo III que no inte.......

Discusión

Aquí proporcionamos un protocolo detallado que permite la demostración de complejos heterólogos formados entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi, como los NST, utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida. El enfoque propuesto para el análisis e interpretación de datos implica relacionar la luminiscencia obtenida para la combinación proteica de interés con la luminiscencia obtenida para la combinación de control correspondiente, que está compuesta por una de las proteínas de.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler