Aislamiento, proliferación y diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo de macaco rhesus

Resumen

En este artículo, describimos el aislamiento de células madre derivadas de tejido adiposo derivadas de macaco rhesus (ADSC) utilizando un protocolo de digestión enzimática de tejidos. A continuación, describimos la proliferación de ADSC que incluye el desprendimiento celular, el conteo y el recubrimiento. Por último, la diferenciación de ADSC se describe utilizando agentes inductores adipogénicos específicos. Además, describimos técnicas de tinción para confirmar la diferenciación.

Resumen

El tejido adiposo proporciona una fuente rica y accesible de células madre multipotentes, que son capaces de autorrenovarse. Estas células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) proporcionan un sistema celular ex vivo consistente que es funcionalmente similar al de los adipocitos in vivo. El uso de ADSC en la investigación biomédica permite la investigación celular de la regulación metabólica y la función del tejido adiposo. La diferenciación ADSC es necesaria para la expansión adecuada de los adipocitos, y la diferenciación subóptima es un mecanismo importante de la disfunción adiposa. Comprender los cambios en la diferenciación de ADSC es crucial para comprender el desarrollo de la disfunción metabólica y la enfermedad. Los protocolos descritos en este manuscrito, cuando se siguen, producirán adipocitos maduros que pueden usarse para varias pruebas funcionales in vitro para evaluar la función metabólica de ADSC, que incluyen, entre otros, ensayos que miden la absorción de glucosa, lipólisis, lipogénesis y secreción. Los macacos Rhesus (Macaca mulatta) son fisiológica, anatómica y evolutivamente similares a los humanos y, como tales, sus tejidos y células se han utilizado ampliamente en la investigación biomédica y para el desarrollo de tratamientos. Aquí, describimos el aislamiento de ADSC utilizando tejido adiposo subcutáneo y omental fresco obtenido de macacos rhesus de 4 a 9 años de edad. Las muestras de tejido adiposo se digieren enzimáticamente en colagenasa seguida de filtración y centrifugación para aislar las ADSC de la fracción vascular estromal . Las ADSC aisladas proliferan en medios estromales seguidas de aproximadamente 14-21 días de diferenciación utilizando un cóctel de 0,5 μg/ml de dexametasona, 0,5 mM de isobutilmetilxantina y 50 μM de indometacina en medios estromales. Los adipocitos maduros se observan aproximadamente a los 14 días de diferenciación. En este manuscrito, describimos protocolos para el aislamiento, proliferación y diferenciación de ADSC in vitro. Aunque nos hemos centrado en las ADSC del tejido adiposo del macaco rhesus, estos protocolos se pueden utilizar para el tejido adiposo obtenido de otros animales con ajustes mínimos.

Introducción

El tejido adiposo está compuesto por una mezcla heterogénea de células, predominantemente adipocitos maduros y una fracción vascular estromal que incluye fibroblastos, células inmunes y células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC)^1,2,3. Las ADSC primarias pueden aislarse directamente del tejido adiposo blanco y estimularse para diferenciarse en adipocitos, cartílagos o células óseas⁴. Las ADSC exhiben características clásicas de células madre, como el mantenimiento de la multipotencia in vitro y la autorrenovación; y son adherentes al plástico en cultivo ^5,6. Las ADSC son de importante interés para el uso en medicina regenerativa debido a su multipotencia y capacidad de ser fácilmente cosechadas en grandes cantidades utilizando técnicas no invasivas⁷. La diferenciación adipogénica de las ADSC produce células que imitan funcionalmente los adipocitos maduros, incluida la acumulación de lípidos, la captación de glucosa estimulada por insulina, la lipólisis y la secreción de adipocinas⁸. Su parecido con los adipocitos maduros ha llevado al uso generalizado de ADSC para la investigación fisiológica de las características celulares y la función metabólica de los adipocitos. Cada vez hay más evidencias que apoyan la idea de que el desarrollo de disfunciones metabólicas y trastornos se origina a nivel celular o tisular 9,10,11,12. Se requiere una diferenciación óptima de ADSC para una expansión suficiente del tejido adiposo, una función adecuada de los adipocitos y una regulación metabólica efectiva¹³.

Los protocolos descritos en este manuscrito son técnicas sencillas que utilizan equipos de laboratorio estándar y reactivos básicos. El manuscrito describe primero el protocolo para el aislamiento de ADSC primarias del tejido adiposo fresco mediante digestión mecánica y enzimática. A continuación, se describe el protocolo para la proliferación y el paso de ADSC en medio estromal. Por último, se describe el protocolo para la diferenciación adipogénica de ADSC. Después de la diferenciación, estas células se pueden utilizar para estudios para comprender mejor el metabolismo de los adipocitos y los mecanismos de disfunción. También se describen los protocolos para la confirmación de la diferenciación adipogénica y la detección de gotas lipídicas mediante tinción Oil Red O y boro-diprometeno (BODIPY). Los detalles de estos protocolos se centraron en las ADSC primarias aisladas del tejido adiposo omental fresco de macacos rhesus. Nosotros y otros hemos utilizado este protocolo para aislar con éxito ADSC de depósitos de tejidos adiposos subcutáneos y omentales de macacos rhesus^14,15. Para la misma cantidad de tejido utilizado, hemos observado que el tejido adiposo subcutáneo es más denso, más resistente y produce menos células de la digestión en comparación con el tejido adiposo omental. Este protocolo también se ha utilizado para aislar ADSC de muestras adiposas humanas¹⁶.

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Protocolo

Todos los tejidos y procedimientos obtenidos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Estatal de Louisiana y se realizaron de acuerdo con las pautas del Instituto Nacional de Salud (publicación de los NIH No. 85-12, revisada en 1996).

1. Preparación de tampones y soluciones

1. Prepare una solución estéril de tampón de lavado salino tamponado con 5-fosfato (5-PBS) agregando 5% de penicilina/estreptomicina (pluma/estreptococo) y 0,25 μg/ml de inhibidor fúngico a 1x PBS. Prepare una solución estéril de tampón de lavado de 2-PBS (2-PBS) agregando 2% de pluma/estreptococo y 0.25 μg/ml de inhibidor fúngico en 1x PBS. Los tampones de lavado se pueden almacenar a 4 °C para su uso futuro y deben usarse dentro de las 4 semanas.
   NOTA: El tampón 5-PBS se utiliza para la recolección de tejido adiposo y el lavado inicial para minimizar la posible contaminación, ya que las muestras de tejido obtenidas en la necropsia se recogen en un ambiente no estéril.
2. Prepare tampón de colagenasa estéril (CB) combinando 0.075% de colagenasa Tipo I (125 unidades / mg de actividad), 2% de pluma/estreptococo y 0.25 μg / ml de inhibidor fúngico en la solución salina balanceada de Hank (HBSS) con albúmina sérica bovina al 1%. CB debe utilizarse en el plazo de 1 h.
3. Prepare un medio de crecimiento ADSC estéril utilizando tampón α-MEM. Combine 100 ml de suero fetal bovino (FBS), 5 ml de solución de L-glutamina de 200 mM, 500 μL de 0.25 μg/ml de inhibidor fúngico y 10 ml de solución de pluma/estreptococo en 394 ml de tampón α-MEM. El medio de cultivo ADSC puede conservarse a 4 °C y debe utilizarse en un plazo de 4 semanas.
   NOTA: La inactivación por calor de FBS no es necesaria.
4. Preparar el medio de diferenciación ADSC estéril combinando el medio de crecimiento ADSC como se preparó anteriormente y agentes de inducción para alcanzar una concentración final de 0,5 μg/ml de dexametasona, 0,5 mM de isobutilmetilxantina y 50 μM de indometacina.

2. Aislamiento ADSC

1. Preparación y digestión de tejidos
   1. Pipetear ~10 ml de tampón 5-PBS en cuatro placas de cultivo celular de 100 mm.
   2. Transfiera ~50 g de muestra adiposa a uno de los platos de 100 mm que contienen 5-PBS. Lave la muestra de tejido adiposo recolectada cuatro veces transfiriéndola secuencialmente a través de las cuatro placas de cultivo que contienen 5-PBS.
   3. Transfiera la muestra adiposa a una placa de cultivo limpia de 100 mm y pique bien el tejido adiposo con tijeras o dos bisturís estériles. La picadura permite aumentar el área de superficie para una digestión enzimática eficiente y completa.
   4. Transfiera el tejido adiposo picado a un tubo cónico de plástico de 50 ml que contenga 13 ml de CB (sección de tejido de 1 a 3 cm por 15 ml de CB).
   5. Enjuague la placa de cultivo con 2 ml de CB y transfiera el medio al tubo cónico de plástico de 50 ml.
      NOTA: En este punto, debe haber un total de 15 ml de CB con tejido en un tubo cónico de plástico de 50 ml.
   6. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces con pipeta serológica de 25 ml para facilitar la digestión mecánica del tejido.
   7. Incubar el tubo cónico de plástico de 50 ml que contiene tejido en CB en un balancín a velocidad media a 37 °C durante 30-60 min.
2. Recubrimiento ADSC para cultivo
   1. Agregue 10 ml de medio de crecimiento ADSC al tubo de 50 ml que contiene tejido para neutralizar la actividad enzimática. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces con pipeta serológica de 25 ml para separar cualquier agregado de tejido adiposo.
   2. Transfiera la porción líquida a un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml dejando atrás los sólidos. Lave el tubo original de 50 ml 3 veces con ~7 ml de tampón 2-PBS y transfiera la porción líquida al tubo de 50 ml.
   3. Centrifugar a 500 x g durante 5 min para obtener un pellet celular. Retire con cuidado la mayor cantidad posible de sobrenadante con una pipeta serológica sin alterar el pellet celular. No decantar.
   4. Resuspender el pellet de células en 1 ml de 1x tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Agregue 5 ml de medio de crecimiento ADSC al tubo y centrifugar a 500 x g durante 5 minutos, luego retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante.
   5. Añadir 5 ml de medio de crecimiento ADSC y centrifugar a 500 x g durante 5 min para lavar el pellet celular. Deseche el sobrenadante.
   6. Resuspenda el pellet en 2 ml de medio de crecimiento ADSC y filtre a través de un filtro celular de 70 μm en un nuevo tubo cónico de plástico estéril de 50 ml.
   7. Enjuague el colador celular con 2 ml adicionales de medio de crecimiento ADSC. Transfiera 4 ml de la suspensión que contiene ADSC del tubo cónico de 50 ml a una placa de cultivo estéril de 100 mm.
   8. Lave el tubo cónico de 50 ml 2 veces con 3 ml de medio de cultivo ADSC y transfiera el líquido a la placa de cultivo de 100 mm que contiene ADSC para un total de 10 ml de medio en placa de cultivo.
   9. Vea las celdas bajo un microscopio invertido con un aumento de 10x para verificar si hay células flotantes en los medios, como se muestra en la Figura 1A. Las células deben mantenerse en una incubadora de CO2 a 37 °C al 5% de_CO2 y al 100% de humedad relativa.
   10. Después de 24 h, observe las células bajo un microscopio invertido para verificar la adherencia celular. Aspirar el medio de crecimiento ADSC de la placa y reemplazarlo con 10 ml de medio fresco y tibio (37 °C). Retire y reemplace los medios cada 48 h hasta que las células tengan un 80%–90% de confluente (Figura 1B).
       NOTA: Al menos el 10-20% de las células serán adherentes a las 24 h. Revise el cultivo celular para detectar signos de contaminación, como granularidad celular, turbidez de los medios o crecimiento de esporas. Una vez que las células son 80% confluentes, pueden ser cosechadas para proliferación y criopreservación o inducidas a diferenciarse. Las ADSC se pueden expandir a 4-6 pasajes antes de perder su capacidad de proliferar o diferenciarse de manera eficiente.

3. Proliferación de ADSC

1. Desprendimiento celular
   1. Retire el medio de crecimiento ADSC con un aspirador/pipeta. Enjuague las ADSC confluentes 2 veces con 2 ml de PBS estéril a temperatura ambiente.
   2. Aspirar PBS y añadir 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25 % por placa de cultivo de 100 mm. Asegúrese de que toda la superficie esté cubierta con tripsina.
   3. Incubar la placa durante ~7 min a 37 °C en 5% de_CO2 hasta que se desprendan las ADSC. Retire la placa de la incubadora y desaloje mecánicamente las células pipeteando con fuerza la solución de tripsina en la placa.
   4. Agregue 2 ml de medio de crecimiento ADSC a las células desplazadas y pipete suavemente para mezclar. Transfiera las células a un tubo cónico de plástico estéril de 50 ml. Para asegurar la máxima recuperación celular, enjuague la placa de cultivo con otros 2 ml de medio de crecimiento ADSC y transfiera el medio al tubo cónico que contiene células desprendidas.
   5. Centrifugar el tubo cónico de 50 ml a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un pellet celular. Decantar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la bolita celular.
   6. Resuspender la gránula celular en 5-6 ml de medio de crecimiento ADSC por 1 x 10⁶ células.
2. Recuento de células y recubrimiento
   1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, diluir 10 μL de solución celular desde arriba y 10 μL de solución de azul de tripano al 0,04% (azul de tripano al 0,4% diluido 1:10 en PBS) y contar las células con un hemocitómetro.
   2. Resuspender el número deseado de ADSC en el medio de crecimiento. Para una placa de cultivo de 100 mm, placa ~3.0 x 10⁵ células en medios de crecimiento ADSC de 10 ml para permitir una confluencia del 80% en 72 h o una confluencia del 100% en 96 h.
   3. Vea el plato bajo un microscopio invertido con un aumento de 10x antes de la incubación para garantizar la presencia de células suspendidas. Mantener las celdas a 37 °C al 5% de_CO2 y al 100% de humedad relativa.
   4. Cada 48 h aspirar el medio de crecimiento y reemplazarlo con medio caliente (37 °C) hasta que las células estén entre un 80% y un 90% de confluentidad, como se muestra en la Figura 1B.
   5. Repita los pasos de las secciones 3.1 y 3.2 para obtener el número adecuado de pasajes para obtener el número de celda deseado.
      NOTA: Después de los pasajes 5 a 6, las células primarias parecen sufrir senescencia; Por lo tanto, trate de obtener el número de células deseado por el pasaje 4.

4. Diferenciación adipogénica ADSC

1. Aspirar ADSC medio de crecimiento a partir de ADSC adheridas que han alcanzado 80% a 90% de confluencia.
2. Enjuague rápidamente la capa celular ADSC con PBS estéril a temperatura ambiente.
3. Añadir medio de diferenciación ADSC. Para una placa de cultivo de 100 mm, añadir 10 ml de medio de diferenciación ADSC.
4. Reemplace el medio cada 3 días durante aproximadamente 14-21 días. Los adipocitos maduros generalmente se observan después de 14 días de diferenciación.
5. Examine las células bajo un microscopio de luz invertida con un aumento de 40x para confirmar la presencia de gotas de lípidos como se muestra en la Figura 2A.

5. Detección de adipocitos

NOTA: Esta sección describirá los protocolos de tinción utilizados para la detección de gotas de lípidos en adipocitos diferenciados, sin embargo, la tinción inmunofluorescente para CD105, un marcador de células madre mesenquimales, también se puede utilizar para la confirmación de ADSC.

1. Tinción Oil Red O
   1. Preparar la solución madre de Oil Red O al 0,5% en isopropanol. Para 20 ml de solución madre Oil Red O, disolver 100 mg de Oil Red O en 20 ml de isopropanol. Filtrar la solución a través de un filtro de jeringa estéril con membrana de 0,2 μm.
   2. Aspire cuidadosamente el medio de diferenciación y lave las células 2 veces agregando PBS a lo largo de los lados del pocillo para no perturbar la monocapa celular.
   3. Aspire cuidadosamente PBS de las células y agregue suficiente formalina tamponada neutra (NBF, 10%) para cubrir la capa celular. Incubar a temperatura ambiente durante 30–60 min.
   4. Durante la etapa de fijación de formalina, prepare la solución de trabajo Oil Red O diluyendo 3 partes de solución madre Oil Red O con 2 partes de agua destilada. Mezclar la solución y filtrar a través de un filtro de jeringa estéril con membrana de 0,2 μm. La solución de trabajo es estable hasta 2 h.
   5. Aspire cuidadosamente NBF y lave rápidamente (~ 15 s) la capa celular con agua destilada. Agregue suficiente isopropanol al 60% para cubrir la capa celular después de aspirar agua e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
   6. Aspire cuidadosamente isopropanol después de 5 minutos de incubación y agregue suficiente solución de trabajo Oil Red O para cubrir la capa celular e incubar a temperatura ambiente durante 10-15 min.
   7. Aspire cuidadosamente la solución de trabajo Oil Red O y lave la capa celular varias veces con agua destilada hasta que el agua se vuelva clara.
   8. Agregue PBS a la placa de cultivo celular y examine las células bajo un microscopio invertido para detectar la indicación de diferenciación y presencia de gotas de lípidos (Figura 2B).
2. Tinción BODIPY
   1. Preparar 5 mM de solución madre de BODIPY disolviendo 1,3 g de BODIPY en 1 ml de DMSO. Preparar 2 μg/ml de solución de trabajo BODIPY diluyendo la solución madre 1:25.000 veces en PBS.
   2. Aspire cuidadosamente el medio de diferenciación y lave las células 2 veces agregando PBS a lo largo de los lados del pocillo para no perturbar la monocapa celular.
   3. Aspirar cuidadosamente PBS y añadir suficiente solución de trabajo BODIPY para cubrir la capa celular e incubar a 37 °C durante 30 min.
      NOTA: Desde este punto, proteja las células de la luz cubriendo la placa con papel de aluminio.
   4. Aspire cuidadosamente la solución de trabajo BODIPY y lave la capa celular 3 veces con PBS.
   5. Fijar las células añadiendo paraformaldehído al 4% e incubando a temperatura ambiente durante 15 min.
   6. Aspire cuidadosamente el tampón de fijación y lave las celdas 2 veces agregando PBS a lo largo de los lados del pocillo para no perturbar la monocapa celular.
   7. Agregue PBS a la placa de cultivo celular y examine las células bajo un microscopio fluorescente invertido para detectar evidencia de diferenciación y presencia de gotas de lípidos (Figura 2C). Celdas de imagen con un conjunto de filtros FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma. La longitud de onda de excitación es de 480 nm con un ancho de banda de 40 nm y la longitud de onda de emisión está a 535 nm con un ancho de banda de 50 nm. Se puede usar un conjunto de filtros similar o apropiado, y un microscopio.

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Resultados

Las ADSC aisladas de muestras de tejido adiposo de macaco rhesus se sembraron en placas de cultivo y se muestra en la Figura 1. El día del recubrimiento, las células no son adherentes y flotan en la placa de cultivo como se muestra en la Figura 1A. Dentro de las 72 h, las ADSC se volverán 80% confluentes y estarán listas para la diferenciación de adipocitos (Figura 1B). Las ADSC exhiben fuertes características adipogénicas de...

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Discusión

Los protocolos de aislamiento, proliferación y diferenciación de ADSC son sencillos y reproducibles, pero requieren una técnica cuidadosa para garantizar un aislamiento adecuado, una expansión saludable y una diferenciación eficiente. Un entorno de trabajo estéril es fundamental para todos los experimentos de cultivo celular. Las bacterias u hongos pueden introducirse en cultivos celulares a través de herramientas, medios o entornos de trabajo contaminados. La contaminación por hongos está indicada por el crecim...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 % trypan blue	Thermo-Fisher	15250061
1.5-ml microcentrifuge tube	Dot Scientific	707-FTG
100 % isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1838-P
100-mm cell culture dish	Corning	430167
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018
50-mL plastic conical tube	Fisher Scientific	50-465-232
70-µm cell strainer	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
Aluminum foil	Reynolds Wrap
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Collagenase, Type I	Thermo-Fisher	17100017
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma-Aldrich	D2915
Dimethyl sulfoxide, DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Distilled water	Thermo-Fisher	15230162
Fetal Bovine Serum, USDA-approved	Sigma-Aldrich	F0926
Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL)	Thermo-Fisher	15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14175095
Hemacytometer with cover slip	Sigma-Aldrich	Z359629
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Inverted light microscope	Nikon	DIAPHOT-TMD
L-glutamine (200 mM)	Thermo-Fisher	25030081
Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz	Reliable Scientific	Model 55 Rocking
Neutral buffered formalin (10 %)	Pharmco	8BUFF-FORM
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Paraformeldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo-Fisher	15140122
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo-Fisher	10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer	Qiagen	158904
Serological pipettes, 2 to 25 mL	Costar Stripettes
Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2	Sanyo	MCO-17AIC
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo-Fisher	25200056