Trasección del nervio óptico que preserva la vaina en ratas para evaluar la regeneración de axones e intervenciones dirigidas al axón de las células ganglionares de la retina

Resumen

Este protocolo describe una transección del nervio óptico que preserva la vaina del nervio óptico en ratas. La presión hidrostática de las microinyecciones en el nervio óptico genera una transección completa, lo que permite la reposición sin suturas de los extremos del nervio óptico seccionados y la orientación directa del compartimento axonal en un modelo de transección.

Resumen

Los axones de las células ganglionares de la retina (RGC) convergen en la cabeza del nervio óptico para transmitir información visual desde la retina hasta el cerebro. Patologías como el glaucoma, los traumatismos y las neuropatías ópticas isquémicas lesionan los axones de RGC, interrumpen la transmisión de estímulos visuales y causan pérdida de visión. Los modelos animales que simulan la lesión de los axones de RGC incluyen los paradigmas de aplastamiento del nervio óptico y transección. Cada uno de estos modelos tiene ventajas y desventajas inherentes. Un aplastamiento del nervio óptico es generalmente menos grave que una transección y se puede utilizar para analizar la regeneración de los axones a través del sitio de la lesión. Sin embargo, las diferencias en la fuerza y la duración del aplastamiento pueden afectar las respuestas de los tejidos, lo que resulta en una reproducibilidad variable y en la integridad de la lesión. Con la transección del nervio óptico, hay una lesión grave y reproducible que lesiona completamente todos los axones. Sin embargo, la seccionación del nervio óptico altera drásticamente la barrera hematoencefálica al violar la vaina del nervio óptico, exponiendo el nervio óptico al entorno periférico. Además, la regeneración más allá de un sitio de transección no se puede evaluar sin volver a colocar los extremos nerviosos cortados. Además, distintos cambios degenerativos y vías celulares se activan por una lesión por aplastamiento o transección.

El método descrito aquí incorpora las ventajas de los modelos de aplastamiento y transección del nervio óptico, al tiempo que mitiga las desventajas. La presión hidrostática suministrada al nervio óptico por microinyección atraviesa completamente el nervio óptico mientras mantiene la integridad de la vaina del nervio óptico. Las terminaciones del nervio óptico seccionadas se recolocan para permitir los ensayos de regeneración de axones. Una limitación potencial de este método es la incapacidad de visualizar la transección completa, una fuente potencial de variabilidad. Sin embargo, la confirmación visual de que la porción visible del nervio óptico ha sido seccionada es indicativa de una transección completa del nervio óptico con un éxito del 90-95%. Este método podría aplicarse para evaluar las estrategias de promoción de la regeneración axonal en un modelo de transección o investigar intervenciones dirigidas a los compartimentos axonales.

Introducción

La lesión axonal y la degeneración se producen en las células ganglionares de la retina (CGR) tras un traumatismo o en enfermedades neurodegenerativas como el glaucoma ^1,2. La pérdida de RGCs y la alteración de las proyecciones retinófugas dan lugar a una pérdida permanente de la visión³. Para comprender las vías moleculares responsables de los procesos degenerativos y desarrollar estrategias para mitigar la pérdida axonal y de RGC o para regenerar los axones de RGC, se han utilizado modelos animales experimentales para simular la lesión del nervio óptico, incluidos los modelos de aplastamiento del nervio óptico y de transección del nervio óptico. Al seleccionar un modelo experimental, se deben tener en cuenta las ventajas y desventajas de cada enfoque, así como las vías moleculares activadas por la lesión⁴.

La razón para desarrollar el método descrito aquí es aprovechar las ventajas de los modelos de aplastamiento del nervio óptico⁵ y transección⁶ y, al mismo tiempo, mitigar las desventajas. Los objetivos de este método fueron generar una lesión del nervio óptico reproducible en la que todos los axones estén seccionados de manera incuestionable y completa, se minimice la exposición al sistema inmune periférico y los extremos seccionados del nervio óptico se reappongan fácilmente para permitir la evaluación de la regeneración de RGC. Además, el método se desarrolló para permitir el acceso compartimentado a la porción axonal de las RGC lesionadas y para administrar intervenciones específicas del axón (por ejemplo, factores neurotróficos, trasplantes celulares) localmente al nervio óptico retroorbitario.

Existen múltiples ventajas de esta técnica sobre los métodos alternativos. En comparación con un aplastamiento del nervio óptico, este método secciona el nervio óptico de forma completa y fiable; Esto aborda un problema potencial de preservación de axones no deseados⁷. Además, el método descrito causa una lesión axonal grave que no depende de la cantidad y duración de la fuerza aplicada por el operador como en una lesión por aplastamiento, reduciendo así la variabilidad⁸. A diferencia de los métodos establecidos para seccionar el nervio óptico, el enfoque detallado en este protocolo mantiene la integridad de la vaina del nervio óptico. Una ventaja de preservar la vaina del nervio óptico es que evita que el nervio óptico quede expuesto al sistema inmunitario periférico. Además, las fuerzas mecánicas ejercidas por la vaina del nervio óptico sobre el nervio óptico seccionado readaptan los extremos del nervio cortados sin necesidad de manipulaciones microquirúrgicas desafiantes ^9,10,11. Finalmente, con la vaina del nervio óptico intacta, el método produce un espacio físico entre los muñones del nervio óptico en el que se pueden introducir directamente células madre, factores neurotróficos o polímeros en los axones RGC lesionados.

El aplastamiento del nervio óptico es el modelo de referencia en el que se evalúan las estrategias de regeneración del nervio óptico para determinar la eficacia de los tratamientos. El tamaño del nervio óptico del roedor limita las posibles manipulaciones, especialmente la transección y readaptación del nervio. Sin embargo, en el campo de la lesión medular y la regeneración, existe consenso en que una transección completa es el modelo ideal para distinguir la regeneración axonal del axón¹² preservado. El método descrito aquí reduce las barreras técnicas para evaluar las estrategias regenerativas en un modelo de transección del nervio óptico. Como tal, este modelo podría usarse para validar estrategias prometedoras identificadas en paradigmas de aplastamiento del nervio óptico con una transección del nervio óptico. Además, dado que este modelo se dirige directamente al compartimento axonal, permite estudiar intervenciones sobre los axones RGC adultos lesionados y los mecanismos responsables de los procesos degenerativos y regenerativos axonales.

El modelo de transección del nervio óptico descrito en este estudio secciona completamente el nervio óptico mientras preserva la vaina del nervio óptico. Este nuevo enfoque es apropiado para experimentos que tienen como objetivo evaluar la regeneración de axones en un modelo de transección sin la necesidad del proceso técnicamente desafiante de reaplicar los extremos del nervio óptico. Los aspectos de la técnica son similares a la realización de un aplastamiento del nervio óptico; Por lo tanto, el abordaje puede ser realizado por operadores experimentados con un aplastamiento del nervio óptico. El abordaje quirúrgico no requiere instrumentos especialmente diseñados y puede completarse con instrumentos quirúrgicos fácilmente disponibles y un sistema de microinyección, lo que lo hace accesible y económico.

Protocolo

Los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Sistema de Salud de Asuntos de Veteranos de San Diego. Los instrumentos y soluciones quirúrgicas se esterilizaron antes de la cirugía para limitar las infecciones y complicaciones postoperatorias.

1. Técnica quirúrgica

1. Realizar experimentos utilizando técnicas asépticas y de acuerdo con los protocolos de uso animal específicos de la institución.
2. Esterilizar los instrumentos y materiales que entran en contacto con tejidos vivos para prevenir infecciones, evitar afectar negativamente el bienestar animal y minimizar las posibles influencias negativas en el estudio. Limpie los instrumentos quirúrgicos a fondo con agua y detergente o productos enzimáticos para eliminar materiales extraños y esterilizarlos mediante vapor o esterilización instantánea.
3. Alícuotas de líquidos en recipientes estériles en una campana de cultivo de tejidos. Esterilice la jeringa de microlitros enjuagándola con etanol al 70% y enjuagándola con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).

2. Anestesia

1. Anestesiar ratas usando un sistema de vaporizador de isoflurano. Vaporice el isoflurano a una concentración del 4,5% utilizando oxígeno de grado médico a una tasa de 1 L/min en una caja de anestesia adjunta. Coloque al animal en la caja de anestesia hasta que la respiración se ralentice y el animal esté sedado.
   NOTA: Este paso inicial de usar anestesia con un anestésico gaseoso no es necesario si el operador se siente cómodo y familiarizado con la administración de anestésicos inyectables a animales no sedados.
2. Extraer un volumen suficiente de un cóctel anestésico compuesto por ketamina (50 mg/kg), xilacina (2,6 mg/kg) y acepromazina (0,5 mg/kg) en una jeringa de tuberculina de 30 G. Retire al animal sedado de la caja de anestesia. Administrar la inyección de anestesia por vía intraperitoneal para lograr una profundidad constante de sedación durante todo el procedimiento y devolver al animal a su jaula.
3. Comience el procedimiento cuando un pellizco en el dedo del pie no provoque una respuesta. Evalúe al animal para determinar la profundidad y la frecuencia de la respiración, y con un pellizco en los dedos de los pies cada 5 minutos durante todo el procedimiento para asegurarse de que no haya dolor.
4. Una vez finalizada la cirugía, retire al animal del marco estereotáxico. Administrar una inyección subcutánea de solución salina (3 mL), ampicilina (0,15-0,2 mg/kg) y banamina (2,5-5 mg/kg) para proporcionar analgesia y soporte líquido. Transfiera al animal a una incubadora calentada para mantener la temperatura corporal.

3. Abordaje quirúrgico

1. Coloque a la rata (7-8 semanas de edad, cepa Fischer 344) en un marco estereotáxico de la cabeza y encima de una almohadilla térmica. Coloque el marco estereotáxico con la cabeza de rata mirando hacia la izquierda del cirujano y centre la órbita izquierda en el campo de visión quirúrgico.
2. En el ojo izquierdo aplicar una gota de proparacaína y limpiar el ojo aplicando povidona yodada al 5% en el párpado y el ojo. Extienda el ungüento oftálmico en la córnea de ambos ojos para mantener la humedad de la córnea y prevenir la formación de cataratas.
3. Pasar una sutura de poliglactina 4-0 a través de la epidermis del párpado superior hasta la cara central del margen del párpado, utilizando esta sutura para una tarsorrafia temporal en pasos posteriores. Utilice la sutura para everdir el párpado y exponer el fórnix superior.
4. Pega la sutura de poliglactina al marco estereotáxico para aplicar tracción y exposición constantes. Evite la tracción excesiva, ya que esto puede limitar la exposición del contenido retroorbital.
5. Con las pinzas Colibrí, eleve la conjuntiva superior e incida la conjuntiva a lo largo del limbo con unas tijeras Vannas. Realice una peritomía a las 4 en punto a lo largo del limbo superior.
6. Aplique una ligera tracción inferior al globo colocando una sutura de polipropileno en bucle a lo largo del limbo superior con los extremos libres debajo del globo. El tejido residual a lo largo del limbo superior después de la peritomía es suficiente para proporcionar tracción en el asa de sutura sin necesidad de pasar la sutura a través de la esclerótica o el limbo.
   1. Asegure los extremos del lazo con una abrazadera de bulldog y deje que la abrazadera cuelgue libremente en el aire. El peso de la abrazadera aplicará una tracción inferior en el globo y expondrá más espacio retroorbital.
7. Disección roma con tijeras Vannas a lo largo de la esclerótica siguiendo la cara posterior del globo y debajo del recto superior. Desinserte los músculos rectos superiores del globo cortando el tendón muscular con unas tijeras Vannas para acceder al espacio retroorbitario.

4. Acceso al nervio óptico

1. Disección roma con pinzas Dumont #5/45 a lo largo de la cara temporal del globo posterior e identificación de la vena de vórtice lateral superior. Disección continua de la nariz a la vena de vórtice lateral superior para exponer el cono del músculo orbitario alrededor del nervio óptico y evitar dañar prematuramente el nervio óptico. Evite lesionar la vena del vórtice, ya que esto puede causar un sangrado significativo. Si se produce sangrado, se puede aplicar un aplicador de punta de algodón hasta que se detenga el sangrado.
2. Con las pinzas Dumont #5/45, inserte con cuidado la punta en la cara temporal del cono muscular orbital y abra las pinzas paralelas al curso de las fibras musculares para revelar el nervio óptico. Use las pinzas para desplazar lateralmente las fibras musculares que recubren el nervio óptico y exponer completamente el nervio. Asegúrese de que solo la vaina del nervio óptico cubra el nervio óptico, ya que las fibras musculares residuales evitarán que la pipeta capilar de vidrio estirada perfore fácilmente el nervio óptico.
3. Mantenga la exposición del nervio colocando dos pinzas Dumont #5/45 a lo largo de ambos aspectos laterales del nervio y abriendo las pinzas. La cantidad de exposición debe permitir que el nervio óptico se aplaste entre 1,5 y 2,0 mm por detrás del globo y que se inserte una pipeta capilar de vidrio estirado en el nervio óptico desde la cara dorsal.

5. Seccionar el nervio óptico dentro de la vaina óptica

1. Con las pinzas Dumont #5/45, coloque las puntas a cada lado del nervio óptico al menos 1,5-2,0 mm por detrás del globo. Asegúrese de que las puntas de las pinzas abarquen el diámetro del nervio. Cierre completamente las pinzas durante 5 segundos para aplastar el nervio óptico y tomar nota de la posición del sitio de trituración.
2. Con una jeringa de microlitros, llene una pipeta capilar extraída de vidrio con 1-2 μL de PBS y fije la pipeta a un soporte de pipetas. Monte el soporte de pipeta en un micromanipulador y fije el micromanipulador en el marco estereotáxico.
3. Ajuste el sistema de microinyección para entregar un solo pulso de 4 ms de duración a una presión de 20 psi con cada pulsación del botón. Coloque la pipeta en el campo quirúrgico.
4. Bajo el endoscopio quirúrgico, utilice un par de pinzas #55 para romper y biselar la punta de la pipeta hasta un tamaño (~20-30 μm de diámetro) capaz de proporcionar un volumen pequeño pero lo suficientemente grande como para proporcionar la rigidez suficiente para penetrar en la vaina del nervio óptico. Confirme la permeabilidad de la punta de la pipeta dando un solo pulso y observando si hay líquido en la punta de la pipeta.
5. Ajuste la posición de la punta de la pipeta justo por encima del sitio del aplastamiento del nervio óptico en el centro del nervio óptico y en contacto con la vaina del nervio óptico. Observe la posición vertical de la pipeta en el micromanipulador para determinar posteriormente una profundidad de 200 μm.
6. Baje la pipeta mientras observa la punta debajo del endoscopio quirúrgico hasta que la pipeta entre en el nervio óptico. Si la punta de la pipeta se dobla y carece de la rigidez necesaria para penetrar en la vaina del nervio óptico, retraiga la pipeta y utilice un par de pinzas #55 para disminuir la longitud y aumentar el diámetro de la punta de la pipeta. Una vez realizados los ajustes en la punta de la pipeta, vuelva a intentar penetrar en la vaina del nervio óptico con la pipeta.
7. Al entrar en el nervio óptico con la punta de la pipeta, retraiga la pipeta si es necesario. La posición de la punta de la pipeta, indicada por el micromanipulador estereotáxico, debe estar a 200 μm por debajo de la superficie del nervio óptico desde la posición inicial indicada en el paso 5.5.
8. Mientras observa el nervio óptico bajo el endoscopio quirúrgico, aplique pulsos de presión hidrostática con el sistema de microinyección. A medida que se aplican pulsos, se debe observar una separación lineal entre los extremos distal y proximal del nervio óptico para verificar la transección del nervio óptico.
   NOTA: El volumen de inyección de 250 a 500 nL es generalmente suficiente para proporcionar la fuerza necesaria para atravesar el nervio óptico. Las inyecciones que requieren más de 1 μL pueden indicar la necesidad de reposicionar el lugar de la inyección. Es posible que los volúmenes más grandes inyectados en el parénquima intacto no causen daño adicional en el RGC, dado que el método atraviesa completamente el nervio óptico, pero es más probable que se rastree a lo largo de los fascículos del nervio óptico. El hecho de no observar una transección lineal del nervio óptico a pesar de la inyección de un volumen de fluido suficiente probablemente indica una posición incorrecta de la pipeta en el sitio de trituración y la necesidad de reposicionarla. También puede ser necesario un aumento del 50% en la presión de inyección.

6. Cierre y recuperación

1. Retraiga la pipeta y retire las pinzas retráctiles Dumont #5/45. Vuelva a colocar el ojo en una posición neutra retirando la pinza bulldog y la sutura de polipropileno en bucle del globo.
2. Vuelva a colocar la conjuntiva en el limbo corneal, asegurándose de liberar cualquier conjuntiva que se haya invertido para permitir la aposición adecuada del tejido y la curación. Aplique ungüento antibiótico tópico oftálmico en el ojo.
3. Retire la cinta de la sutura de poliglactina 4-0 del párpado y mantenga la sutura en su lugar para usarla en una tarsorrafia temporal. Pasar la sutura a través del margen palpebral del párpado inferior, a través de la zona subcuticular inferiormente, y salir por la epidermis. Ata la sutura con la presión suficiente para cerrar el ojo.
4. Administrar analgésicos posquirúrgicos de acuerdo con los protocolos institucionales y las directrices de las autoridades de cuidado animal. Aloje al animal de forma independiente en una jaula climatizada para que se recupere después de la cirugía. No coloque la ropa de cama en la jaula de recuperación para evitar la aspiración accidental.

Resultados

La transección del nervio óptico generalmente resulta en la pérdida apoptótica del 80-90% de las RGC lesionadas dentro de los 14 días posteriores a la lesión. La técnica descrita secciona el nervio óptico manteniendo la integridad de la vaina del nervio óptico (Figura 1). El grado de pérdida de RGC es comparable a los modelos tradicionales de transección del nervio óptico y aplastamiento del nervio óptico, con la ventaja de que los extremos del nervio cortados se colocan sin esfuerzo después de la transección con el método descrito aquí (Figura 2). La reconexión de los extremos del nervio óptico cortados de esta manera permite la evaluación de la regeneración axonal de RGC en un modelo de transección al proporcionar un sustrato sobre el cual pueden crecer los axones y sin la necesidad de manipulación microquirúrgica para volver a conectar los extremos nerviosos cortados (Figura 3). El trazado anterógrado de los axones de RGC con la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) demuestra que los axones positivos para CTB se seccionan completamente siguiendo una vaina que preserva la transección del nervio óptico (Figura 4). La preservación de la vaina del nervio óptico mientras se secciona el nervio óptico también crea un espacio cerrado en el que los materiales de investigación, como factores neurotróficos o células, pueden administrarse a los axones RGC lesionados y mantenerse en su posición (Figura 5). Durante las fases iniciales del entrenamiento, se espera una tasa de éxito del 60-70% de la transección total. Con la experiencia, la tasa de éxito de la transección total es de aproximadamente el 90-95%.

Figura 1: Transección del nervio óptico preservando la vaina del nervio óptico. (A) Imagen del campo quirúrgico que demuestre la exposición del nervio óptico intacto antes de la transección. (B) Imagen del nervio óptico después de la transección. Una pipeta de vidrio fino perforó la vaina del nervio óptico en el sitio de la transección y administró una suspensión celular (solución turbia) en el espacio entre los extremos del nervio óptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Pérdida de células ganglionares de la retina después de una vaina del nervio óptico que preserva la transección del nervio óptico. Montajes planos representativos de retina completa de ojos con (A) un nervio óptico intacto, (B) una vaina del nervio óptico que preserva la transección del nervio óptico, (C) una transección del nervio óptico tradicional o (D) un aplastamiento del nervio óptico 14 días antes fueron inmunomarcados para gamma sinucleína (SNCG). Las imágenes se obtuvieron de un microscopio de fluorescencia utilizando un objetivo de 10x, se corrigieron para el sombreado y se unieron para generar una sola imagen. La pérdida de cuerpos de células ganglionares de la retina (RGC) en toda la retina fue evidente en los ojos lesionados. Los recuadros muestran imágenes de mayor aumento de la retina y demuestran una pérdida significativa de RGC después de lesiones del nervio óptico. (E) La cuantificación de la supervivencia de RGC demuestra una pérdida significativa de RGC después de lesiones del nervio óptico en comparación con los nervios ópticos intactos de control. *p< 0,05 en comparación con intacto; ANOVA de un factor con prueba de Tukey post-hoc. n = 3 animales por grupo; Las barras de error representan SD. SP-ONT, transección del nervio óptico que preserva la vaina; ONT: transección del nervio óptico; ONC, aplastamiento del nervio óptico. Barras de escala = 1.000 μm. Barras de escala en inserciones = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Secciones de los nervios ópticos después de lesiones del nervio óptico. Imágenes representativas de la sección longitudinal a través de los nervios ópticos 14 días después de (A-C) una vaina del nervio óptico que preserva la transección, (D-F) transección tradicional del nervio óptico o (G-I) aplastamiento del nervio óptico. (A, D, G) El inmunomarcaje para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) delinea la extensión de la lesión, mientras que el marcaje de ADN (B,E,H) con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) demuestra una celularidad contigua a lo largo del nervio óptico y dentro del sitio de la lesión. (C, F, I) Imágenes combinadas que demuestran la localización del tejido neural positivo para GFAP y la celularidad en el sitio de la lesión. Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Sección de un nervio óptico siguiendo una vaina del nervio óptico que preserva la transección del nervio óptico. Imágenes representativas de una sección longitudinal a través de un nervio óptico 14 días después de una vaina del nervio óptico que preserva la transección con trazado de axones anterógrados con una inyección intravítrea de la subunidad B de la toxina del cólera (CTB). (A) Se puede observar una lesión completa de los axones RGC marcados con CTB que se extienden desde el globo (izquierda) hacia el cerebro (derecha). (B) El inmunomarcaje de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) delinea una lesión extensa que afecta todo el diámetro del nervio óptico. (C) El marcaje del ADN con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) demuestra celularidad dentro del sitio de la lesión. (D) Una imagen combinada que demuestra la localización de los axones marcados con CTB, el tejido neural positivo para GFAP y la celularidad en el sitio de la lesión. Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Sección longitudinal de un nervio óptico seccionado que recibió un injerto de célula. Imágenes representativas de una sección longitudinal a través de un nervio óptico 14 días después de una vaina del nervio óptico que preserva la transección y el trasplante de células madre neurales (NSC) que expresan la proteína fluorescente tdTomato. (A) El inmunomarcaje de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) demostró la separación completa de las terminaciones del nervio óptico seccionadas. (B) Las NSC que expresan tdTomato estaban contenidas dentro del espacio creado por la técnica descrita y continuaron sobreviviendo después del trasplante. (C) Las NSC injertadas se colocaron directamente en ambos extremos cortados del nervio óptico seccionado. Barras de escala, 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los procedimientos quirúrgicos que describen el modelo de transección del nervio óptico han sido publicados previamente⁶. Sin embargo, las técnicas detalladas en esos protocolos implican incidir la vaina meníngea para seccionar el nervio óptico. Además, con el fin de evaluar la regeneración de axones de RGC en modelos de transección anteriores, se requirieron manipulaciones microquirúrgicas desafiantes para colocar los extremos del nervio óptico cortados o un injerto de nervio periférico en el muñón del nervio óptico proximal^10,13. El protocolo descrito aquí interrumpe mínimamente la vaina del nervio óptico mientras secciona el nervio óptico y permite evaluaciones de la regeneración del axón RGC en un modelo de transección sin la necesidad de manipulaciones microquirúrgicas técnicamente desafiantes.

Varios pasos son críticos en este protocolo. Se debe tener cuidado para evitar dañar la arteria oftálmica y la vasculatura que irriga la cabeza del nervio óptico. Por lo tanto, el paso 5.1 debe completarse al menos 1,5-2,0 mm después del globo. Si se produce un daño en la arteria oftálmica e interrumpe el suministro de sangre a la retina, el ojo debe excluirse de otros experimentos, ya que es probable que se produzca una tisis. Durante los pasos 5.4-5.6, es importante mantener la integridad de la vaina del nervio óptico y minimizar el tamaño de la abertura a través de la cual la pipeta de vidrio ingresa al nervio óptico. Al hacerlo, se forma un sello hermético alrededor de la punta de la pipeta para reducir el reflujo de fluido y permite la generación de suficiente presión hidrostática para atravesar el nervio óptico. El biselado de la punta de las pipetas de vidrio mejorará la facilidad con la que la pipeta entra en el nervio óptico sin causar daños colaterales.

Existen posibles modificaciones que los operadores podrían hacer para mejorar la accesibilidad de este método. Los procedimientos descritos implican una disección y extirpación mínimas del tejido orbitario con preservación del nervio facial y del trigémino. Si bien esto reduce la morbilidad y los riesgos de sangrado, los tejidos como la grasa orbitaria y la glándula lagrimal pueden limitar la visualización de estructuras cruciales. Puede ser necesaria una extracción cuidadosa del tejido que obstruye el campo quirúrgico para mejorar la visualización, especialmente en animales mayores. También se podría utilizar un abordaje lateral para mejorar el acceso al nervio óptico. Sin embargo, una disección lateral corre el riesgo de dañar estructuras adicionales, incluido el nervio trigémino, es más complicada y puede presentar sus propios desafíos para dirigir la instrumentación de las inyecciones.

Una posible limitación de este método es la imposibilidad de manipular directamente el nervio óptico y visualizar completamente toda la transección. Por lo tanto, existe la posibilidad de una transección incompleta. Sin embargo, hemos observado que la confirmación visual de la separación de las terminaciones nerviosas durante el paso 5.8 es un indicador fiable de una transección exitosa y completa. En caso de que las terminaciones nerviosas no se separen, reposicionar la pipeta de inyección o aumentar la presión de la inyección en un 50% debería proporcionar suficiente fuerza para seccionar completamente el nervio.

Con respecto a los métodos existentes, este enfoque preserva la integridad de la vaina del nervio óptico. Al mantener la integridad de la vaina del nervio óptico, los extremos del nervio óptico seccionado no están expuestos al entorno orbitario ni al sistema inmunitario periférico, lo que limita la exposición a factores inmunitarios que podrían influir en las respuestas de RGC. Además, la preservación de la integridad de la vaina del nervio óptico mientras se secciona el nervio óptico crea un espacio físico cerrado delimitado por los extremos del nervio óptico y la vaina del nervio óptico. La entrega localizada de factores neurotróficos, células o polímeros al compartimento axonal de las CGR lesionadas se puede lograr inyectando en el espacio recién formado. ¹⁴ Alternativamente, la regeneración de axones de RGC puede evaluarse en un modelo de transección permitiendo que los extremos del nervio óptico seccionados se anastomeen sin la necesidad de técnicas microquirúrgicas desafiantes.

Las aplicaciones de este método incluyen la evaluación del compartimento axonal RGC lesionado con intervenciones específicas de axones para identificar las vías responsables de la degeneración axonal y prevenir la pérdida axonal después de una lesión por transección. Además, este método hace que los estudios de la regeneración axonal de RGC en un modelo de transección sean accesibles para la comunidad investigadora en general al eliminar la necesidad de procedimientos de anastomosis del nervio óptico técnicamente difíciles. Las intervenciones destinadas a promover la regeneración de los axones de RGC podrían evaluarse con este modelo de lesión grave y proporcionar resultados consistentes y reproducibles sin preocuparse por los axones preservados.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL