Trasplante intramiocardio de hidrogeles inyectables msc-loading después de infarto de miocardio en un modelo murino

Resumen

La terapia basada en células madre ha surgido como una estrategia eficiente para reparar los tejidos cardíacos lesionados después del infarto de miocardio. Proporcionamos una aplicación in vivo óptima para el trasplante de células madre utilizando hidrogeles de gelatina que son capaces de ser enzimáticamente cruzados.

Resumen

Uno de los principales problemas a los que se enfrentan las terapias actuales de células madre cardíacas para prevenir la insuficiencia cardíaca postinfarto es la baja retención y las tasas de supervivencia de las células trasplantadas dentro del miocardio lesionado, limitando su eficacia terapéutica. Recientemente, el uso de biomateriales de andamios ha ganado atención para mejorar y maximizar la terapia con células madre. El objetivo de este protocolo es introducir una técnica simple y directa para trasplantar células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (MSC) utilizando hidrogeles de ácido propionico hidroxifenilo inyectable (GH); los hidrogeles son favorables como plataforma de administración celular para aplicaciones de ingeniería de tejidos cardíacos debido a su capacidad de estar intercontrados in situ y alta biocompatibilidad. Presentamos un método sencillo para fabricar hidrogeles GH (MSC/hidrogeles) que cargan MSC y evaluar su supervivencia y proliferación en cultivo in vitro tridimensional (3D). Además, demostramos una técnica para el trasplante intramiocardial de MSC/hidrogeles en ratones, describiendo un procedimiento quirúrgico para inducir infarto de miocardio (MI) a través de ligadura arterial coronaria de descenso anterior (LAD) izquierda y posterior trasplante de MSC/hidrogeles.

Introducción

La terapia con células madre cardíacas ha surgido como un enfoque potencial para la reparación y regeneración de miocárdica^1,2. A pesar de los recientes resultados positivos en modelos animales y ensayos clínicos, la aplicación de terapia basada en células madre para la reparación de miocardio es limitada debido a la baja retención y la mala supervivencia de las células inyectadas en los tejidos cardíacos infartos^3,4. Como resultado, el uso de ingeniería de tejidos a base de células, incluyendo biomateriales inyectables^5,parches cardíacos^6,y hojas celulares⁷, se ha estudiado intensamente para mejorar la retención celular y la integración dentro del miocardio huésped.

Entre los diversos enfoques potenciales para la reparación de tejidos cardíacos bioingenieros, los hidrogeles inyectables combinados con tipos celulares apropiados, como las células madre mesenquimales (MSC), las células madre embrionarias (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), son una opción atractiva para entregar eficazmente células en las regiones miocárdicas^8,9. La gelatina, un polímero natural bien conocido, se puede utilizar como una matriz inyectable debido a su gran biocompatibilidad, biodegradabilidad considerable e inmunogenicidad reducida en comparación con una amplia gama de biomateriales utilizados en aplicaciones biomédicas. Aunque las plataformas inyectables a base de gelatina tienen un gran potencial, su aplicabilidad in vivo sigue siendo limitada en función de su baja rigidez mecánica y fácil degradabilidad en el entorno fisiológico.

Para superar estas limitaciones, se ha propuesto un diseño novedoso y sencillo de hidrogeles a base de gelatina que consisten en ácido propionico hidroxifenilo para aplicaciones in vivo. Los conjugados de ácido propionico gelatinoso-hidroxifenilo (GH) se pueden cruzar in situ en presencia de una enzima, peroxidasa rábano picante (HRP), y posteriormente encapsular varios fármacos, biomoléculas o células dentro del hidrogel, lo que sugiere un gran potencial en aplicaciones de ingeniería de tejidos^{10,11,12,13,14.} Además, recientemente hemos investigado los efectos terapéuticos de los hidrogeles GH que contienen MSC encapsulados y hemos demostrado su uso en la reparación y regeneración cardíaca exitosa después de la MI en un modelo murino^15. En este protocolo, describimos una técnica simple para la encapsulación y proliferación in vitro tridimensional (3D) de MSC dentro de los hidrogeles GH. También presentamos un procedimiento quirúrgico diseñado para generar un modelo de MI murino a través de ligadura de arteria coronaria y trasplante intramiocardial de hidrogeles GH de carga DE MSC en el corazón infarto.

Protocolo

Todos los procedimientos de investigación animal se proporcionaron de conformidad con la Ley de Bienestar de los Animales de Laboratorio, la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las Directrices y Políticas para experimentos de roedores proporcionadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Escuela de Medicina de la Universidad Católica de Corea.

1. Preparación de MSCs e hidrogeles de gelatina inyectables

1. Cultivo MSCs en un plato de cultivo de 100 mm a 37 °C y 5% CO₂. Cuando el crecimiento de los MSC alcance el 80% de confluencia, lave el plato dos veces con DPBS y agregue 1 ml de trypsin-substitute a 37 °C durante 3 minutos.
   NOTA: Los MSC fueron aislados de la médula ósea murina siguiendo los procedimientos convencionales^16,cultivados en el Medio de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco que contiene un 10% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de solución antimicómica-antimicótica, y utilizados entre el paso 7\u20129 para este estudio.
2. Añadir 9 ml de medio de cultivo y centrífuga a 500 x g durante 3 min. A continuación, deseche el sobrenadante resultante, resuspend las células en 1 ml de PBS y mantenga la suspensión celular en el hielo.
3. Diluir 10 μL de suspensión celular con 10 μL de azul trypan y obtener la concentración celular utilizando un contador de células automatizado.
4. Resuspend y transferir MSC a un tubo de 1 mL a una densidad de 1 x 10⁷ células/ml.
5. Prepare un 6,25% de la solución gh conjugada en PBS y separe en 2 viales. A continuación, mezcle las soluciones GH con 6 μg/ml de HRP (solución GH A) o 0,07 wt% de H₂O₂ (solución GH B).
   NOTA: Preparar el ácido propionico gelatinoso-hidroxifenilo (GH) conjugados de acuerdo con los protocolos publicados^12,15.
   1. Mantenga una relación volumétrica de 9:1 de solución gh conjugada a HRP (solución GH A) y GH conjugar solución a H₂O₂ (solución GH B), respectivamente.
6. Antes de mezclar los MSC con la solución GH A, centrífuga brevemente la suspensión celular a 1.000 x g y aspire cuidadosamente el sobrenadante resultante. Posteriormente, mezcle el pellet que contiene MSCs con la solución GH A.

2. Carga in situ de MSC y cultivo in vitro tridimensional

1. Cargue la solución GH A (que contiene MSC) y la solución GH B a ambos lados de una jeringa dual. Placa 300 μL de las soluciones gh combinadas con MSC a una densidad final de 5 x 10⁶ celdas/ml en una diapositiva de cámara de ocho pozos.
2. Después de la formación in situ de hidrogel y posterior encapsulación msc a través de enlace cruzado enzimático, añadir 700 μL de DMEM que contiene 10% FBS y 1% solución antibiótico-antimicótico.
3. Incubar la diapositiva a 37 °C y 5% CO₂ y reemplazar el medio de cultivo cada 2\u20123 días.

3. Confirmación de la proliferación in vitro y supervivencia de los MSCs dentro de los hidrogeles GH

1. Para determinar la viabilidad de los MSC cultivados en 3D dentro de los hidrogeles GH, utilice un ensayo de tinción de células vivas/muertas después del tiempo de incubación predeterminado.
2. Después de la incubación de los MSC encapsulados en hidrogeles GH durante 3, 5, 7 o 14 días, aspirar el medio y lavar el pozo dos veces con PBS.
3. Preparar una solución de tinción que contenga 5 μL de calceína AM y 20 μL de etidio homodimer-1 (EthD-1) en 10 ml de DPBS.
4. Añadir 200 μL de la solución de tinción al pozo e incubar durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
5. Aspirar la solución de tinción y lavar el pozo dos veces con PBS.
6. Separe cuidadosamente la cámara de la diapositiva y coloque una cubierta completa sobre los hidrogeles GH. Utilice una microscopía confocal para visualizar el grado de proliferación y los cambios morfológicos de los MSC encapsulados.
   NOTA: Las imágenes fluorescentes fueron adquiridas bajo aumento de 200x e imágenes a las longitudes de onda de excitación/emisión de 470/540 nm para calceína y 516/607 nm para EthD-1.

4. Inducción del infarto de miocardio en ratones

1. Anestesteize macho de 7 semanas de edad C57BL/6 ratones (20\u201222 g) con inyección intraperitoneal de una mezcla de Zoletil (30 mg/kg) y Rompun (10 mg/kg) en solución salina.
2. Antes de la cirugía, despiblar el pecho del ratón usando crema para la depilación y esterilizar la piel con yodo.
3. Coloque el ratón sobre una mesa de trabajo e intubado insertando un catéter en la tráquea para proporcionar oxígeno suplementario a través de ventilación mecánica.
4. Corte suavemente a través de la piel usando tijeras quirúrgicas y luego penetre en los músculos intercostales con micro tijeras. Separe las costillas izquierdas 2ª y 3ª usando una sutura de seda de 5-0 para mantener una cavidad torácica abierta.
5. Ligar cuidadosamente la arteria coronaria de descenso anterior izquierdo (LAD) usando un soporte de aguja con un 8-0 sutura de polipropileno y cortar la sutura usando electrocautería.
6. Observe un cambio de color inmediato en la pared ventricular izquierda anterior.

5. Trasplante intramiocardial de hidrogeles GH que cargan MSC

1. Después de inducir el infarto de miocardio por ligadura LAD, inyecte 10 μL de soluciones GH de carga MSC en dos puntos diferentes en la zona fronteriza infarta (total: 2 x 10⁵ MSCs/20 μL) utilizando una jeringa dual equipada con una aguja 26G.
   1. Siguiendo el mismo procedimiento descrito en el paso 1, prepare y transfiera las soluciones GH de carga de MSC a una jeringa dual.
      NOTA: Para evaluar el engraftment de los hidrogeles GH de carga MSC dentro del área infarto, los MSC y gh conjugados fueron preetiquetados con PHK26 e isoticianato de fluoresceína (FITC), respectivamente.
2. Restaura la cavidad torácica abierta y cierra los músculos y la piel usando suturas 5-0.
   NOTA: Antes del cierre del pecho, retire el aire con una jeringa catéter.
3. Retire el tubo traqueal y coloque el ratón en una jaula debajo de una lámpara infrarroja durante la recuperación.
4. Para la analgesia postoperatoria, administrar inyecciones subcutáneas de ketoprofeno (5 mg/kg por día) durante un mínimo de 72 h. Todos los ratones deben ser monitoreados de cerca durante un tiempo adecuado para asegurar una recuperación adecuada después de los procedimientos quirúrgicos, así como un tratamiento adecuado para el dolor.

6. Ecocardiografía

1. Cuatro semanas después del trasplante, inicialmente anestesia el ratón con un 5% de isoflurano y luego ajusta la concentración de isoflurano al 1%.
2. Despique el pecho usando crema para la depilación y coloque el ratón en una almohadilla de calefacción. Aplique gel transductor de ultrasonido en el pecho.
3. Adquiera vistas de eje corto parasteral bidimensional y registre trazados en modo M a nivel del músculo papilar.
   NOTA: Coloque un transductor lineal de matriz (7\u201215 MHz) en la línea parasteral izquierda y vea las estructuras anatómicas.
4. Mida las líneas correspondientes para LVAW, LVID y LVPW para obtener espesor de pared cardíaca, dimensión de la cámara y acortamiento fraccionaria.
   NOTA: Compare la función cardíaca incluyendo la fracción de eyección (EF), el acortamiento fraccionaria (FS) y el volumen sistólico final (ESV) a nivel del músculo papilar para asegurar una evaluación adecuada en la misma ubicación anatómica.

7. Evaluación histológica

1. En el momento predeterminado después del trasplante de hidrogeles GH que cargan MSC en el corazón infarto, eutanasia al ratón en una cámara de CO₂ y recoge el corazón para el análisis histológico^15.
2. Para la hematooxilina y la eosina (H&E) y la tinción tricroma (MT) de Masson, fije los tejidos cardíacos diseccionados en un 4% de paraformaldehído (PFA) e incrustarlos en parafina. A continuación, corte los bloques cardíacos incrustados en parafina en secciones serie de 4 μm utilizando un microtome y manche las secciones con mancha MT de acuerdo con los protocolos estándar¹⁷.
3. Adquiera imágenes en un escáner de diapositivas a una ampliación de 20x y calcule el tamaño infarto de los grupos de tratamiento.
   Tamaño infarto (%) = circunferencia infarta total / circunferencia total de LV x 100
4. Calcule ambas circunferencias mediante la medición de longitud media. Para circunferencias de línea media LV, mida las longitudes de la línea central entre las superficies endocardial y epicardial. Para circunferencias infartas de línea media, mida las longitudes de infarto incluyendo más del 50 % de todo el espesor del miocardio¹⁸.
   NOTA: Todos los análisis de imágenes se realizaron utilizando el software ImageJ.
5. Mida el grosor de la pared de la cicatriz a los niveles musculares papilares.
6. Calcular la fracción del área de colágeno.
   Área de colágeno (%) = área total de fibrosis intersticial/área de miocitos x 100

Resultados

Para entregar eficazmente los MSC al miocardio infarto, en este protocolo se utilizaron hidrogeles enlazables cruzados de carga MSC descritos en la Figura 1. Antes del trasplante in vivo, la proliferación y supervivencia de los MSC en los hidrogeles GH fueron confirmados por un ensayo de tinción de células vivas/muertas in vitro en 3D (en vivo: verde; muerto: rojo). Como se muestra en la Figura 2,las imágenes representativas mostraron suficiente proliferaci?...

Discusión

Los hidrogeles GH inyectables tienen un gran potencial para aplicaciones in vivo debido a su capacidad para incorporar homogéneamente diversos agentes terapéuticos in situ. Además, sus propiedades físicas y bioquímicas se pueden manipular fácilmente en función de los requisitos dependientes de la enfermedad. En este sentido, se han propuesto hidrogeles inyectables para hacer frente a las principales limitaciones en la terapia actual de células madre cardíacas obstaculizadas por la mala supervivencia y retención...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430