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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El protocolo actual describe un método para el aislamiento del ADN de muestras de sangre y biopsias intestinales, la generación de bibliotecas de TCRβ y IGH PCR para la secuenciación de próxima generación, la realización de una ejecución de NGS y el análisis de datos básicos.

Resumen

La memoria inmunológica, el sello distintivo de la inmunidad adaptativa, es orquestada por linfocitos T y B. En la circulación y diferentes órganos, hay miles de millones de clones únicos de células T y B, y cada uno puede unirse a un antígeno específico, lo que lleva a la proliferación, diferenciación y / o secreción de citoquinas. La gran heterogeneidad en las células T y B es generada por la recombinación aleatoria de diferentes segmentos genéticos. Las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), desarrolladas en la última década, permiten una visión en profundidad sin precedentes del repertorio inmunológico de los receptores de células T y B. Los estudios en varias condiciones inflamatorias, inmunodeficiencias, infecciones y malignidades demostraron cambios marcados en clonality, uso del gen, y propiedades biofísicas del repertorio inmune, proporcionando penetraciones importantes sobre el papel de inmunorespuestas adaptante en diversos desordenes.

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para NGS del repertorio inmune de las células de T y de B de la sangre y del tejido. Presentamos una tubería a partir del aislamiento de ADN a través de la preparación de la biblioteca, la secuenciación en el secuenciador NGS y terminando con análisis básicos. Este método permite la exploración de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos, y por lo tanto puede identificar cambios dinámicos en las poblaciones de linfocitos y parámetros de diversidad en diferentes enfermedades. Esta técnica está entrando lentamente en la práctica clínica y tiene el potencial para la identificación de nuevos biomarcadores, estratificación de riesgos y medicina de precisión.

Introducción

El sistema inmune adaptante, comprendido de linfocitos de T y de B, utiliza memoria inmunológica para reconocer un antígeno previamente encontrado e iniciar una respuesta rápida. Los linfocitos se generan en la médula ósea y maduran en el timo (células T) o la médula ósea (células B). Tanto el receptor de células T (TCR) como el receptor de células B (BCR) muestran configuraciones únicas que permiten el reconocimiento de antígenos específicos. En la homeostasis, las células T y B circulan y examinan constantemente los billones de péptidos diferentes presentados en las células presentadoras de antígenos. La ligadura TCR o BCR de un antígeno específico con alta afinidad, junto con la coestimulación adecuada, conduce a la activación celular, lo que resulta en la secreción de citoquinas, la expansión clonal y la generación de anticuerpos, en el caso de las células B.

La enorme variedad de las diferentes células T o B se denomina colectivamente repertorio inmune, lo que permite el reconocimiento de innumerables epítopos diferentes. Para generar un repertorio tan vasto, se lleva a cabo un complejo proceso de ensamblaje aleatorio de diferentes segmentos de genes, creando combinaciones casi infinitas de receptores que pueden unirse a antígenos únicos1. Este proceso, denominado recombinación V(D)J, incluye reordenamientos de diferentes genes variables (V), diversidad (D) y unión (J), acompañados de deleciones aleatorias e inserciones de nucleótidos en las uniones2.

La arquitectura del sistema inmune adaptativo ha interesado a científicos en diferentes campos durante muchas décadas. En el pasado, la secuenciación de Sanger, la determinación complementaria de espectros de la región 3 (CDR3) y la citometría de flujo se utilizaron para caracterizar el repertorio inmunológico, pero proporcionaron baja resolución. En la última década, los avances en los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) permitieron una visión profunda de las características y la composición de los repertorios de TCR y BCR de un individuo3,4. Estos sistemas de alto rendimiento (HTS) secuencian y procesan millones de productos TCR o BCR reorganizados simultáneamente y permiten un análisis de alta resolución de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos. Ngs proporciona una nueva estrategia para estudiar el repertorio inmune en salud y enfermedad. Los estudios que utilizaron HTS demostraron repertorios alterados de TCR y BCR en enfermedades autoinmunes5,inmunodeficiencias primarias6,7,y malignidades, tales como en leucemia mieloide aguda8. Usando NGS, nosotros y otros hemos mostrado la extensión oligoclonal de las copias específicas de la célula de T y de B, en pacientes con la enfermedad de intestino inflamatoria (IBD), incluyendo colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn9,10,11,12,13,14. En general, los estudios de diferentes campos sugieren que los cambios en el repertorio tienen un papel crucial en la patogénesis de los trastornos inmuno-mediados.

El protocolo actual describe un método para el aislamiento del ADN de las biopsias intestinales y la sangre, la generación de bibliotecas de TCRβ y IGH PCR para NGS, y la realización de la secuenciación de ejecución. También proporcionamos pasos básicos en el análisis de datos del repertorio inmunológico. Este protocolo también se puede aplicar para la generación de bibliotecas TCRα, TCRγ e IGL. El método también es compatible con otros órganos (por ejemplo, ganglios linfáticos, tumores, líquido sinovial, tejido graso, etc.) siempre y cuando se utilicen protocolos de digestión específicos de tejidos.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional del Sheba Medical Center, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos participantes.

1. Aislamiento y cuantificación del ADN

  1. Digestión y lisis celular de biopsias intestinales
    1. Recuperar biopsias intestinales, ya sean recién recogidas o almacenadas a -20 °C u -80 °C. Si usa biopsias congeladas, descongele sobre hielo.
    2. Añadir 600 μL de solución de lisis de núcleos a un tubo de microcentrifuga estéril de 1,7 mL, refrigerado sobre hielo.
    3. Coloque la biopsia en un tubo de microcentrífuga con solución de lisis e incube a 65 °C durante 15-30 min.
    4. Añadir 17,5 μL de 20 mg/mL de proteinasa K e incubar durante la noche a 55 °C, con temblores suaves.
    5. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de proceder al paso 1.3.
  2. Lisis celular de la sangre entera
    1. Obtenga 3 mL de sangre entera en un tubo que contiene EDTA, heparina o citrato.
    2. Rocíe suavemente el tubo hasta que se mezcle bien y transfiera sangre a un tubo de centrífuga estéril de 15 mL que contenga 9 mL de solución de lisis celular. Invertir varias veces durante un período de incubación de 10 min a temperatura ambiente.
    3. Centrífuga a 2.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente, y luego deseche tanto sobrenadante como sea posible sin alterar el pellet blanco visible. Aproximadamente 50–100 μL de líquido residual permanecerán.
    4. Tubo de vórtice vigorosamente durante 15 s hasta que se resuspended completamente. Añadir 3 mL de solución de lisis de núcleos y pipeta varias veces. La solución debe volverse viscosa.
  3. Precipitación de proteínas
    1. Agregue 200 μL de tampón de precipitación de proteínas al tejido, o 1 mL a la sangre. Vórtice vigorosamente durante 20 s e incubar sobre hielo durante 5 min. Pequeños grupos de proteínas pueden ser visibles después del vórtice.
    2. Centrífuga a 16.000 x g durante 4 min. Se debe formar un pellet apretado que contenga proteínas precipitadas.
    3. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante, sin molestar el pellet, a un nuevo tubo de 1,7 mL.
      NOTA: Si el pellet no está apretado, considere otra centrífuga a 16,000 x g durante 4 min.
  4. Precipitación y rehidratación del ADN
    1. Añadir 1 mL de 2-propanol al tubo que contiene el sobrenadante, y mezclar suavemente invirtiendo. El ADN debe hacerse visible como sustancia flotante blanca.
    2. Centrífuga a 16.000 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante completamente con una pipeta.
    3. Añadir 1 mL de etanol al 70% recién preparado, e invertir el tubo varias veces. Centrífuga a 16.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante con cuidado.
    4. Repita el paso 1.4.3.
    5. Coloque el tubo abierto invertido sobre papel absorbente limpio durante 10-15 min. Vuelva a invertir el tubo y confirme la hidratación completa. Si es necesario, dejar secar al aire durante 10-15 min adicionales.
      NOTA: Es crucial que el pellet se seque por completo.
    6. Añadir 50 μL de agua ultra pura (UPW). Si es necesario, el ADN se puede diluir más después de la cuantificación.
    7. Incubar durante 1 h en bloque de calor a 65 °C, para la rehidratación del ADN.
  5. Cuantificación del ADN
    NOTA: El ADN se cuantificó utilizando un fluorómetro y reactivos designados, como se especifica en la tabla de materiales.
    1. Lleve los estándares a temperatura ambiente y prepare el kit, incluidos los tubos designados de 0.5 mL.
    2. Prepare la mezcla del almacenador intermediario y del tinte en un tubo de 15 mL, según el número de muestras. Añadir 200 μL de tampón y 1 μL de colorante por muestra. Incluya 2 muestras para los estándares. Se recomienda calcular una muestra adicional para evitar que el búfer no sea suficiente.
      1. Para los 2 estándares, coloque 190 μL de la mezcla preparada anteriormente en un tubo de 0.5 mL. Añadir 10 μL de la norma.
      2. Para cada muestra, coloque 199 μL de la mezcla preparada anteriormente en un tubo de 0,5 mL. Añadir 1 μL del ADN.
    3. Lea los ejemplos. El resultado indica la concentración de ADN de la muestra.
    4. Si las muestras están por encima del límite, diluya el ADN 1:10 con UPW y repita la lectura.

2. Preparación de la biblioteca

NOTA: El protocolo actual utiliza un múltiplex, kit de ensayo basado en PCR compatible con secuenciadores NGS. El kit contiene 24 índices diferentes, cada uno dirigido a regiones conservadas dentro de las regiones Vβ y Jβ. Esto permite una reacción de PCR de un solo paso y la agrupación de diferentes muestras. Consulte la tabla de materiales para obtener más detalles.

  1. Prepare las muestras de la DNA. Obtener 150 ng de ADN y añadir UPW para un total de 5 μL.
    NOTA: Es posible utilizar menos de 150 ng de ADN para la preparación de la biblioteca, con una concentración mínima de 10 ng/μL.
  2. Coloque pipetas y puntas en la campana con luz UV durante 15 minutos para descomponer el ADN residual. Mientras tanto, permita que diferentes tubos de índice (para la preparación de la biblioteca) y la ADN polimerasa se descongele en el hielo.
  3. En una campana biológica, agregue 45 μL de los diferentes tubos índice en los tubos de PCR. A continuación, añadir 0,2 μL de la ADN polimerasa y los 5 μL de ADN preparados en el paso 2,1 en tubos de PCR.
  4. Ejecute la reacción de PCR utilizando un programa preestablecido, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

3. Purificación y cuantificación de amplicones

  1. Utilice perlas magnéticas para la eliminación del exceso de cebadores, nucleótidos y enzimas.
    1. Caliente las cuentas al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Prepare suficiente etanol fresco al 80% para 400 μL por muestra.
    2. Añadir 50 μL (IGH) o 35 μL (TCRβ) de las perlas a cada tubo de PCR y mezclar pipeteando 10 veces. Incubar 10 min a temperatura ambiente.
    3. Coloque la muestra mixta en el soporte magnético durante 5 min.
    4. Aspirar 95 μL (IGH) u 80 μL (TCRβ) del líquido transparente y desechar. Aspirar el líquido restante usando una punta de 10 μL.
    5. Añadir 200 μL de etanol al 80% a cada muestra. Incubar 30 s. Aspirar 195 μL de etanol y desechar. Aspirar el líquido restante usando una punta de 10 μL.
    6. Repita el paso 3.1.5. Abra las tapas de los tubos y deje secar al aire durante 5 min.
    7. Inmediatamente después de los 5 min, retirar del soporte magnético y añadir 25 μL de tampón de elución (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Mezclar por pipeteo hasta que sea homogéneo. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
    8. Coloque los tubos en el soporte magnético durante 5 min. Transferir 22 μL a un nuevo tubo de PCR. Medir la concentración de ADN (paso 1.5).
  2. Cuantificación de Amplicon
    NOTA: El protocolo actual utiliza una máquina de electroforesis automatizada para el control de calidad de la concentración de ADN, el tamaño y la integridad. Consulte la tabla de materiales para obtener más detalles.
    1. Coloque los reactivos y la cinta de cribar a temperatura ambiente durante al menos 30 min.
    2. En un nuevo tubo de microcentrifugación de 1,7 mL, realice una dilución de 1 ng/μL de las muestras de ADN cuantificadas en el paso 3.1.8 con UPW para un volumen total de al menos 3 μL.
    3. Adn diluido de vórtice antes de su uso. Coloque 2 μL de tampón, junto con 2 μL del ADN diluido en las tiras de PCR especializadas preetiquetados (proporcionadas en el kit) y coloque las tapas. Colocar en la coctelera durante 1 min, seguido de girar hacia abajo de las tiras de PCR.
      NOTA: Debido a la viscosidad del tampón, asegúrese de que el exceso de tampón se elimine de la punta antes de transferirlo a los tubos de muestra.
    4. Coloque en la máquina, la cinta de pantalla y las tiras de PCR sin las tapas. Abra la tapa de la caja de la punta dentro de la máquina. Asigne la posición con las etiquetas adecuadas. Inicie la máquina.
      NOTA: El histograma de salida debe ser un solo pico en el tamaño deseado de los amplicones (Figura 1A). En muestras de mala calidad, se observarán picos adicionales (Figura 1B), indicando mala limpieza de perlas o formación de dímeros de cebadores.

4. Secuenciación de próxima generación

  1. Cuantificación y puesta en común de la biblioteca
    1. Calcular la concentración final de ADN en nM, utilizando el valor de ADN del paso 3.1.8, y el tamaño en pares de bases (bp) del pico del producto, obtenido a partir de los resultados de la máquina de electroforesis (ver Figura 1).
    2. Para cada muestra, calcular el volumen de ADN a tomar para una concentración final de 4 nM, en un volumen final de 10-20 μL de tampón de elución.
    3. Prepare una nueva mezcla de dilución para cada muestra y tome 2 μL de ella a una nueva mezcla de piscina.
      Nota : para las muestras que tienen menos de 4 nM, agregue la cantidad máxima de muestra posible.
  2. Ngs funcionamiento de la biblioteca
    Nota : el protocolo actual utiliza una plataforma de secuenciador de sobremesa. Consulte la tabla de materiales para obtener más detalles.
    1. Preparar una solución fresca de 0,2 N NaOH. Añadir 10 μL de 0,2 N NaOH a la biblioteca diluida preparada en el paso 4.1.3. Agregue 5% PhiX al tubo y al vórtice brevemente. Gire hacia abajo el tubo para asegurarse de que toda la solución se ha asentado en la parte inferior del tubo.
    2. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente para desnaturalizar el ADN de doble cadena. Agregue 980 μL de tampón pre-refrigerado del kit al tubo que contiene ADN y vórtice brevemente.
    3. Coloque la biblioteca diluida sobre hielo y prepare la biblioteca de la siguiente manera. Para una mezcla de 17 pM, añadir 425 μL de ADN del paso 4.2.2 y 575 μL de tampón. Invertir la biblioteca varias veces y girar hacia abajo. Cargue 600 μL de la biblioteca final en el cartucho designado y coloque muestras en la máquina.
    4. Inicie la ejecución siguiendo las instrucciones del software.

5. Análisis de secuenciación

  1. Descargue las métricas de secuenciación del secuenciador y compruebe que los datos de secuenciación están dentro de los siguientes intervalos (específicos para el kit utilizado en el protocolo actual). Los ejemplos que no cumplen estos criterios están sujetos a repetición de ejecución:
    Densidad de clúster (Densidad (K/mm2)): 945K – 1800K
    Porcentaje de filtro de paso de lecturas (clústeres PF (%)): >90%
    Puntuaciones de calidad (%>=Q30): >85%
    Alineación PhiX (alineada %): 1.5% - 10%
    Tasa de error de PhiX (%): <1,0%

Resultados

Adjunto, describimos un método para el aislamiento de la DNA del tejido y de la sangre intestinales, la preparación de las bibliotecas para ngs, y los pasos básicos de un funcionamiento de la secuenciación para la secuencia del repertorio inmune. La ejecución generará archivos fastq, que se pueden convertir en archivos fasta para su uso en la plataforma internacional ImMunoGeneTics (IMGT) / HighV-QUEST. Este HTS realiza y gestiona muchos análisis de decenas de miles de secuencias tcrβ y IGH reorganizadas, a nivel...

Discusión

Los cambios en la abundancia y la función de los linfocitos B y T se encuentran a menudo en diferentes neoplasias malignas18,trastornos inflamatorios crónicos (por ejemplo, colitis ulcerosa y artritis reumatoide)10,19,y en diversas inmunodeficiencias17,20. El método actual utiliza NGS para facilitar una visión en profundidad de los repertorios de TCR y BCR, lo que permite la de...

Divulgaciones

Todos los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

ninguno.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2-propanolSigmaI9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubesAxygen8187631104051
15 mL centrifuge tubesGreiner188261
Absolute ethanolMerck1.08543.0250
Amplitaq GoldThermo FisherN8080241
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881
Heat blockBioerNot applicable
High Sensitivity D1000 Sample BufferAgilent5067-5603For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kitInvivoscribeTRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq SequencerIlluminaSY-410-1003
PCR strips4titude4ti-0792
Proteinase KInvitrogenEO0491
Qubit 4 FluorometerThermo FisherQ33226
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
ShakerBiosanNot applicable
Tapestation 2100 BioanalyzerAgilentG2940CA
ultra pure waterBio-lab7501
Wizard DNA isolation kitPromegaA1120Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer

Referencias

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