Descelularización del complejo cardiopulmonar murino

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo descelularizar el corazón y los pulmones de los ratones. Los andamios de matriz extracelular (ECM) resultantes pueden ser inmunoteñidos y fotografiados para mapear la ubicación y la topología de sus componentes.

Resumen

Presentamos aquí un protocolo de descelularización para corazón y pulmones de ratón. Produce andamios estructurales de ECM que se pueden usar para analizar la topología y composición de ECM. Se basa en un procedimiento microquirúrgico diseñado para cateterizar la tráquea y la aorta de un ratón sacrificado para perfundir el corazón y los pulmones con agentes descelularizantes. El complejo cardiopulmonar descelularizado puede ser posteriormente inmunoteñido para revelar la ubicación de las proteínas ECM estructurales. Todo el procedimiento se puede completar en 4 días.

Los andamios ECM resultantes de este protocolo están libres de distorsiones dimensionales. La ausencia de células permite el examen estructural de las estructuras de ECM hasta la resolución submicrónica en 3D. Este protocolo se puede aplicar a tejido sano y enfermo de ratones de tan solo 4 semanas de edad, incluidos modelos de ratón de fibrosis y cáncer, abriendo el camino para determinar la remodelación de ecm asociada con la enfermedad cardiopulmonar.

Introducción

La ECM es una red tridimensional formada por proteínas y glicanos que da cabida a todas las células de un organismo multicelular, dando a los órganos su forma y regulando el comportamiento celular a lo largo de la ^vida1. Desde la fertilización del óvulo en adelante, las células construyen y remodelan el ECM, y a su vez están estrictamente controlados por él. El propósito de este protocolo es abrir una forma de analizar y mapear la ECM de ratón, ya que los ratones son el organismo modelo más utilizado en la fisiopatología de mamíferos.

El desarrollo de este método fue impulsado por la necesidad de caracterizar y aisla....

Protocolo

Todos los procedimientos incluidos aquí han sido revisados y aprobados por el comité ético que regula la medicina experimental en la Universidad de Copenhague y están de acuerdo con la legislación danesa y europea. Para demostrar este protocolo, hemos utilizado ratones hembra BALB/cJ de 8-12 semanas de edad y un ratón hembra MMTV-PyMT de 11 semanas de edad.

NOTA: Evitar la contaminación bacteriana del andamio ECM descelularizado proporciona el mejor resultado de imagen y permite el almacenamiento de muestras a largo plazo. Por lo tanto, es importante mantener todos los pasos estériles. Como tal, todos los instrumentos y material quirúrgico,....

Resultados

Descelularización cardiopulmonar
Después de completar con éxito el protocolo, el corazón y los pulmones, así como el tejido anexo, como el arco aórtico, estarán libres de células. La descelularización puede ser validada por tinción de hematoxilina-eosina (Figura 1) de los andamios de ECM que muestran la eliminación de los núcleos en comparación con el tejido nativo. Estos andamios conservan las dimensiones de los órganos fres.......

Discusión

Las técnicas de descelularización basadas en la agitación tisular alteran la estructura de la ECM, haciéndolas inadecuadas para el análisis de la estructura de la ^ECM4. La descelularización por perfusión, mediante una vía anatómica como la aorta de la tráquea, permite llegar al lecho capilar, o alvéolos terminales, y facilita la entrega de agentes descelularizantes por todo el órgano. Se reporta el uso de detergentes zwitteriónicos, aniónicos y no iónicos para descelularizar el

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L