Método de interferencia de ARN mediado por electroporación en Odonata

Resumen

Proporcionamos un protocolo detallado para la interferencia de ARN mediado por electroporación en insectos de la orden Odonata (libélulas y damiselas) utilizando la presa de cola azul (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) y la libélula pied skimmer libélula (Pseudothe zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Resumen

Las libélulas y las damiselas (orden Odonata) representan uno de los insectos más ancestrales con metamorfosis, en el que cambian su hábitat, morfología y comportamiento drásticamente de larvas acuáticas a adultos terrestres/aéreos sin estadio pupal. Los adultos Odonata tienen una visión de color bien desarrollada y muestran una notable diversidad en los colores y patrones del cuerpo a través de sexos, etapas y especies. Si bien se han realizado muchos estudios ecológicos y conductuales sobre Odonata, los estudios genéticos moleculares han sido escasos principalmente debido a la dificultad para aplicar el análisis funcional géne genético a Odonata. Por ejemplo, la interferencia de ARN (ARN) es menos eficaz en la Odonata, como se indica en el Lepidoptera. Para superar este problema, establecimos con éxito un método RNAi combinado con la electroporación in vivo. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que incluye un video del método RNAi mediado por electroporación de la siguiente manera: preparación de larvas, identificación de especies, preparación de solución de dsRNA/siRNA y agujas de inyección, anestesia helada de larvas, inyección de ARN/SIRNA, electroporación in vivo y rearme individual hasta la aparición de adultos. El método RNAi mediado por electroporación es aplicable tanto a las presas (suborden Zygoptera) como a las libélulas (suborden Anisoptera). En este protocolo, presentamos los métodos para la damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) como ejemplo de especies de damselfly y la libélula pied skifly Pseudothemis zonata (Libellulidae) como otro ejemplo de especies de libélulas. Como ejemplos representativos, mostramos los resultados del ARNi dirigido al gen de síntesis de melanina multicopper oxidasa 2. Este método RNAi facilitará la comprensión de varias funciones génicas implicadas en la metamorfosis, la morfogénesis, la formación de patrones de color y otras características biológicas de Odonata. Además, este protocolo puede ser generalmente aplicable a organismos no modelo en los que el ARNi es menos eficaz en la supresión de genes debido a la ineficiencia y baja penetración.

Introducción

Las libélulas y las damiselas (el orden Odonata) se encuentran entre los grupos más ancestrales de insectos que exhiben "metamorfosis"^1,2. Por metamorfosis, cambian su hábitat, morfología y comportamiento drásticamente de larvas acuáticas a adultos terrestres/aéreos^3. Los adultos Odonata tienen una visión de color bien desarrollada y representan una notable diversidad en los colores y patrones del cuerpo a través de sexos, etapas y especies^3,4,5. Si bien muchos estudios ecológicos y conductuales sobre Odonata se han realizado^6,7, los estudios genéticos moleculares se han visto obstaculizados principalmente por la dificultad para aplicar el análisis funcional del gen a Odonata.

El método de interferencia de ARN convencional (ARNI), en el que se inyecta ARN de doble cadena (dsRNA) para suprimir la función del gen de interés^8,resultó ser ineficaz en los insectos Odonata^9,como se indica en los insectos Lepidopteran¹⁰. Por otro lado, informes anteriores han sugerido que el RNAi mediado por la electroporación es eficaz en las especies de lepidópteros, especialmente en los tejidos epidérmicos^11,12,13. Recientemente descubrimos que el ARNi mediado por electroporación funciona eficazmente en la diminuta libélula Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)⁹, pero N. pygmaea es una especie relativamente rara y por lo tanto no es adecuada para estudios genéticos moleculares.

La mayoría de las especies de Odonata se clasifican en cualquiera de los dos subordenes, Zygoptera (damselflies) o Anisoptera (verdaderas libélulas)³. Aquí nos centramos en la presa de cola azul Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Figura 1A) como una especie representativa de Zygopteran y el pied skifly libélula Pseudothemis zonata (Libellulidae; Figura 1B) como una especie representativa de Anisopteran. Las dos especies se encuentran entre las especies Odonata más comunes en estanques naturales y urbanos en Japón, incluyendo las de la ciudad de Tsukuba, y podemos recolectar muchas larvas de las dos especies en el campo. Recientemente establecimos un sistema de cría de laboratorio para larvas individuales de I. senegalensis,que permitió el seguimiento continuo del desarrollo y la morfogénesis de las larvas de Odonata en detalle¹⁴.

En este informe, proporcionamos un método refinado y un protocolo de video para el RNAi mediado por electroporación en I. senegalensis y P. zonata. En Japón, I. senegalensis e Ischnura asiatica,que están genéticamente cerca, a menudo se encuentran simpáticamente¹⁵, y son difíciles de distinguir en las larvas¹⁶. También describimos cómo dos especies de Ischnura se pueden distinguir por el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP).

Para evaluar la eficacia del RNAi mediado por electroporación, seleccionamos el gen multicopper oxidasa 2 (MCO2; también conocido como laccase2) como un gen objetivo representativo, debido al fenotipo visible de color de cutícula más pálido al derribar la expresión génica⁹. MCO2 es conocido por ser esencial para el oscurecimiento de la epidermis en una variedad de especies de insectos^17,18.

Protocolo

NOTA: El esquema general de los protocolos se muestra en la Figura 1.

1. Preparación de larvas de libélulas o damiselas.

1. Recoger larvas en el campo usando una red de mano.
   NOTA: Las larvas de I. senegalensis a menudo se aferran a plantas de agua que flotan en la superficie del agua, mientras que las larvas de P. zonata a menudo permanecen entre la hojarasca en la parte inferior. En la ciudad de Tsukuba, las larvas instar finales de I. senegalensis se encuentran principalmente de marzo a junio, y las de P. zonata de mayo a junio. I. larvas de senegalensis se pueden criar de huevos en el laboratorio^14,pero las larvas recogidas en el campo tienen la tasa de éxito claramente mayor de la aparición de adultos.
2. Identificación de especies por polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) de productos amplificados por PCR.
   NOTA: Este paso sólo es necesario si la especie es difícil de identificar a partir de la apariencia de las larvas, como en I. senegalensis.
   1. Sostenga una de las branquias caudales de una larva usando fórceps. Luego, la larva cae de su propia branquia caudal (causando autotomía).
      NOTA: Las larvas de las presas Zygopteran suelen tener tres branquias caudal(Figura 1A). Cuando son atacados por un depredador, pueden quitar sus propias branquias caudales para escapar. Si la branquia caudal no está disponible, se disecciona una parte de la pierna.
   2. Coloque una branquia caudal en 100 l de solución PBS [0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,115% Na₂HPO₄y 0,02% KH₂PO₄ (p/v)] y homogeneice con una batidora con una mano utilizando un pestillo de depósito.
   3. Gire hacia abajo la mezcla a 5.000 x g durante 10 segundos, y someta 0,5 ml del sobrenadante a la amplificación de PCR utilizando DNA polimerasa e imprimaciones para amplificar la región 1 (ITS1) interna del espaciador transcrito del ADN nuclear.
      NOTA: Realice el PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante. La combinación de imprimaciones ITS-F0 (5'- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3') y 5.8S-AS1 (5'- GCC GGC CCT CAG CAG -3') puede amplificar la región ITS1 en casi todas las especies de Odonata¹⁹.
   4. Incubar la mezcla de 1 l de producto amplificado por PCR, 0,3 l de tampón de 10x M, 0,1 ml de enzima de restricción de DraI y 1,6 l de agua a 37 oC durante 1 h.
      NOTA: Seleccione las mejores enzimas de restricción, dependiendo de la combinación de especies. Si no hay enzimas de restricción adecuadas para la identificación de especies, confirme mediante secuenciación de ADN.
   5. Cargue 2 l de los productos con tinte de carga en gel de agarosa al 2% y ejecute electroforesis.
      NOTA: Es difícil identificar especies cuando se utiliza 1% o 1.5% de gel de agarosa.
   6. Compruebe el patrón de electroforesis para identificar la especie (Figura 2).
      NOTA: Los patrones RFLP dependen de las especies y de la población. En la población de Tsukuba, I. asiatica tiene una banda importante de 400-500 bp, mientras que I. senegalensis tiene una banda principal de aproximadamente 200 bp y una banda adicional de menos de 100 bp (una punta de flecha en la Figura 2). La región ITS1 existe en múltiples copias en el genoma, y en las especies de Ischnura, el polimorfismo de microsatélite dentro de la región ITS1 a menudo está presente en el mismo individuo, afectando el patrón de los RFLPs.
3. Rearte las larvas recogidas en el laboratorio hasta su uso para ARNi.
   1. Coloque cada larva por separado en cada pozo de una placa de 12 pozos con aproximadamente 3 ml de agua.
      NOTA: Las larvas de I. senegalensis deben mantenerse individualmente porque con frecuencia canibalizan entre sí, mientras que las larvas de P. zonata se pueden mantener en un grupo porque rara vez canibalizan.
   2. Alimente las larvas I. senegalensis con camarones salmuera Artemia todos los días y larvas de P. zonata con gusanos de sangre y/o gusanos Tubifex al menos dos veces por semana hasta que crezcan a la etapa de desarrollo adecuada para el ARNAi.
      NOTA: La alimentación frecuente es fundamental para aumentar la tasa de éxito de la aparición de adultos.
   3. Cambie el agua tan pronto como se ensucie con heces o sobras.
      NOTA: El cambio frecuente del agua también es importante para aumentar la tasa de éxito de la aparición de adultos.
   4. Juzgue la etapa de desarrollo apropiada para el ARNi.
      NOTA: Las larvas instar finales de I. senegalensis se pueden clasificar en cinco etapas de desarrollo^14,20. La primera etapa (etapa A, antes de que las alas comiencen a expandirse) o la segunda etapa (etapa B) de las larvas instar finales es adecuada para experimentos con ARNi, al considerar el fenotipo claro de arNI después de la aparición de adultos (ver Discusión). En P. zonata,las larvas instar finales antes de la expansión del ala (correspondientes a la etapa A de I. senegalensis)se utilizaron en este estudio.

2. Preparación de la solución de dsRNA/siRNA y agujas de inyección para ARNI.

NOTA: Seleccione el ARN interferente pequeño (siRNA) (paso 2.1) o el ARN de doble cadena (dsRNA) (paso 2.2) como solución para arNI.

1. Preparación de la solución de siRNA
   1. Diseñe siRNA utilizando siDirect versión 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)²¹, siguiendo las pautas previamente reportadas en lepidopteran insects²².
   2. Obtener siRNA sintetizada comercialmente.
      NOTA: Las secuencias de siRNA dirigidas al gen MCO2 de I. senegalensis utilizadas en este estudio fueron las siguientes: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3' para hilo de sentido y 5'- UAU UAUGAA CGG AAA GUG CUC -3' para cadena antisenso. Como control negativo, las secuencias de siRNA dirigidas al gen de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) fueron las siguientes: 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3' para hilo de sentido y 5'- UUG AAG UUC UUC UUG UUG AUG CCG -3' para antisonaz¹¹.
   3. Diluir el siRNA a 100 m con tampón de inyección [100 mM CH₃COOK, 2 mM Mg(CH₃COO)₂, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4]²².
   4. Conservar a -80oC hasta su uso.
2. Preparación de la solución de dsRNA.
   1. Seleccione una región de 300-400 bp para dsRNA utilizando la versión 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)²³ del programa primer3 y diseñe los conjuntos de imprimación.
   2. Obtener conjuntos de imprimación sintetizados comercialmente.
      NOTA: Para producir plantillas para la síntesis de dsRNA, los primeros conjuntos utilizados en este estudio fueron los siguientes: (5'- GCC TGT CAG CTT TGT CTT CC -3' para la imprimación directa y 5'- GGT GTC TGG CGG CGG ACA ACT AT -3' para la imprimación inversa) para los genes MCO2 de I. senegalensis (IsMCO2, adhesión no. LC589180) y (5'- CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3' para imprimación directa y 5'- GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3' para imprimación inversa) para genes MCO2 de P. zonata (PzMCO2, adhesión no. LC589179). Como control negativo, la imprimación establecida para dsRNA dirigida β-lactamasa (bla) en el vector de clonación fueron (5'- CTA TGT GGC GCG GTA T -3' para la imprimación directa y 5'- CAG AAG TGG TCC TGC TGC T -3' para la imprimación inversa).
   3. Extraiga el ARN de las larvas de Odonata utilizando un kit de extracción de ARN disponible comercialmente y realice la síntesis de ADNC utilizando la transcriptasa inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      NOTA: También se puede utilizar la biblioteca cDNA preparada para el análisis de secuenciación de ARN.
   4. Amplificar las secuencias de destino utilizando el cDNA sintetizado y el conjunto de imprimación diseñado y clonarlas en el vector de clonación utilizando una ligasa comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   5. Transformar el plásmido en células competentes de E. coli y recoger una sola colonia después de la incubación durante la noche.
   6. Amplificar PCR la región de inserción utilizando imprimaciones en el vector.
   7. Confirme la secuencia clonada mediante la secuenciación de Sanger.
   8. PCR-amplificar la plaquita utilizando imprimaciones vectoriales que contienen la secuencia promotora de la polimerasa T7^{24, 25}.
      NOTA: En este estudio, se utilizaron las siguientes imprimaciones: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') y T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T - 3') ²⁵.
   9. Purifique el producto PCR utilizando el kit de purificación de PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante, elula el ADN con 50 ml de agua destilada y concentre la solución de ADN eluido a aproximadamente 10 l utilizando un evaporador centrífugo.
   10. Sintetice el dsRNA mediante la transcripción in vitro según el protocolo del fabricante. Utilice un total de 1000 ng de ADN de plantilla y eluda dsRNA sintetizada con 100 l de búfer de elución.
   11. Mida la concentración de dsRNA utilizando un espectrofotómetro y confirme la calidad del ARNrn por electroforesis en un gel de agarosa del 1,5%.
       NOTA: Se puede ver una sola banda cuando la síntesis de dsRNA es exitosa.
   12. Diluir el dsRNA a 1000 ng/L con el tampón de elución y almacenar a -20 oC hasta su uso.
3. Preparación de agujas de inyección
   1. Tire de un capilar de vidrio utilizando un tirador de aguja de vidrio.
   2. Coloque la punta del capilar tirado sobre una cinta adhesiva de doble cara y rompa la punta del capilar con fórceps.
   3. Ajuste el capilar a un inyector.
      NOTA: Es más fácil manejar el capilar si usa guantes de nitrilo.
   4. Cargue la solución de siRNA/dsRNA en el capilar preparado.
      NOTA: No utilice el capilar repetidamente ya que la punta del capilar inyectado puede quedar obstruida con suciedad porque las larvas recogidas en el campo vivían en el barro.

3. Inyección de siRNA/dsRNA

NOTA: El procedimiento es ligeramente diferente para las presas (paso 3.1) y las libélulas (paso 3.2).

1. Inyección a una larva de Zygopteran (damselfly) (por ejemplo, I. senegalensis).
   1. Anestesiar una larva cubierta con un papel húmedo sobre hielo triturado durante 50-70 segundos(Figura 3A-C).
      NOTA: La duración de la anestesia helada depende del estado de la larva; si la larva comienza a moverse después de 70 segundos de anestesia helada, se aplican 70 segundos adicionales de anestesia helada. Para las larvas que rara vez se mueven (por ejemplo, P. zonata),este procedimiento no es esencial.
   2. Fije dos pasadores a ambos lados del protórax y fije la larva a un soporte fijo (por ejemplo, un trozo de espuma de poliestireno) (Figura 3D).
      NOTA: Ajuste la posición y el número de pines, dependiendo del lugar de la inyección.
   3. Estirar la membrana intersegsional entre el 7o y 8o segmento abdominal para arNI en el abdomen o entre el protórax y el sintetizador (mesotórax fundido y metatórax) para el ARNI en el tórax utilizando las manos y los fórceps.
   4. Mantenga la membrana intersegrada estirada a mano.
   5. Inserte la punta del capilar preparado en la membrana intersegrada estirada(Figura 3D, 3F).
   6. Inyecte 1 l de solución de siRNA/dsRNA.
2. Inyección a una larva de Anisopteran (libélula) (p. ej., P. zonata).
   1. Limpie el agua de la superficie larvaria con una toalla de papel.
   2. Si es necesario, coloque dos pasadores a ambos lados del protórax y fije la larva a un soporte fijo (por ejemplo, un trozo de espuma de poliestireno) (Figura 3H).
      NOTA: Ajuste la posición y el número de pines, dependiendo del lugar de la inyección. En el caso de P. zonata,no es esencial fijar las larvas con alfileres en este paso.
   3. Estirar la membrana interseglírica entre el 4o y 5o segmento abdominal a mano.
   4. Haga un pequeño agujero con una aguja fina en la membrana intersegleta entre el 4o y el 5o segmento abdominal.
      NOTA: Este procedimiento es necesario para muchas especies de Anisopteran (libélula) porque la membrana interseglica es demasiado difícil de insertar un capilar de vidrio directamente.
   5. Inserte la punta del capilar preparado en el orificio preparado(Figura 3I).
      NOTA: Como se muestra en la Figura 3H, parte del lado dorsal de las larvas corresponde al lado ventral del adulto, por lo que el fenotipo aparece ventralmente cuando se trata como se muestra en la Figura 3H-J.
   6. Inyecte 1 l de solución de siRNA/dsRNA.

4. electroporación in vivo

1. Si es necesario, agregue más alfileres para fijar la larva a un soporte fijo (por ejemplo, un trozo de espuma de poliestireno).
2. Después de la inyección de la solución de siRNA/dsRNA, aplicar dos gotas de gel de ultrasonido en la superficie larvaria utilizando fórceps.
3. Coloque electrodos en el gel de ultrasonido, con el electrodo positivo en el lado inyectado con la solución de siRNA/dsRNA y un electrodo negativo en el lado opuesto(Figura 3E, 3G, 3J).
   NOTA: No toque directamente la epidermis de la larva para evitar el efecto ardor de la electroporación.
4. Generar pulsos de electroporación 10 veces (280 ms/s cada uno) utilizando un electroporador.
   NOTA: Ajuste el voltaje de la electroporación, dependiendo de las especies, etapas y tejidos. En este estudio, 25 V se aplicó a I. senegalensis y 45 V a P. zonata.
5. Limpie el gel restante en la superficie con una toalla de papel.
6. Mantenga las larvas tratadas apoyadas sobre una toalla de papel húmeda durante aproximadamente un día para su recuperación y transfieralas a una caja de cría al día siguiente.

5. Análisis fenotípico específico del sitio

1. Mantener I. senegalensis individualmente en un plato de Petri (5 cm de diámetro) que contenga aproximadamente 10 ml de agua y un pedazo de toalla de papel, y mantener P. zonata en una jaula de plástico con una malla no tejida desechable (jaula de eclosión¹⁴).
2. Para I. senegalensis,después de que las larvas dejen de comer, muévalas individualmente a una jaula de plástico con una malla desechable no tejida.
   NOTA: No coloque dos o más larvas en la misma jaula. De lo contrario, se canibalizarán unos a otros inmediatamente después de convertirse en adultos.
3. Después de la aparición del adulto, observe y fotografíe el fenotipo alrededor de la región donde se colocó el electrodo positivo para la electroporación.
   NOTA: El fenotipo solo aparece en parches. Los fenotipos a menudo son difíciles de reconocer inmediatamente después de la aparición debido a la pigmentación incompleta.
4. Para examinar la eficiencia del ARNi (por ejemplo, RT-PCR cuantitativo), si el fenotipo es visible, disecciona la región y compárala con la región sin el fenotipo.
   NOTA: Los niveles de fenotipo de ARNi, a saber, el tamaño y la ubicación de la decoloración de la cutícula, a menudo presentan una variación considerable entre los individuos (ver Figura 4).
5. Mantenga a los adultos emergidos en 100% EtOH para futuros análisis.
   NOTA: El color corporal de las especies de Odonata se desvanece rápidamente después de la muerte, por lo que es importante almacenarlas en etanol antes de morir. El etanol a veces decolora a los insectos, en tales casos que los insectos se congelan antes de morir.

Resultados

Aplicamos el protocolo anterior al RNAi mediado por electroporación dirigido al gen MCO2 y a los genes de control negativo(EGFP para siRNA y bla para dsRNA) (i) en el abdomen de I. senegalensis (Figura 4), (ii) en el tórax de I. senegalensis (Figura 5), y (iii) en el abdomen de P. zonata (Figura 6). Los resultados de los experimentos de ARNi se resumen en el Cuadro 1. Debido a que el arSNar/dsRNA cargado negativamente se incorpora únicamente en células cargadas positivamente, se observaron fenotipos de ARNI en toda la región donde se colocó el electrodo positivo para la electroporación.

Tanto en I. senegalensis como en P. zonata, la inhibición de la pigmentación de la melanina (es decir, negro, marrón y marrón rojizo) apareció en parches alrededor de la región donde se colocó el electrodo positivo (puntos de flecha y líneas punteadas en la Figura 4, Figura 5y Figura 6) cuando MCO2 RNAi se realizó en combinación con la electroporación (Tabla 1), como se informó anteriormente en N. pyeama⁹. Por el contrario, no se observaron efectos fenotípicos alrededor del sitio de electroporación cuando se inyectó el gen de control(EGFP siRNA o bla dsRNA) (Figura 4,Figura 5 , y Figura 6, Tabla 1). Además, la inyección del gen MCO2 sin electroporación no tuvo ningún efecto sobre la pigmentación adulta(Figura 4, Tabla 1),lo que indica que la electroporación es esencial para el ARNi en Odonata. Cabe señalar que las coloraciones azul, verde y amarilla no se ven afectadas por el RNAi del gen MCO2 que participa en la síntesis de melanina en la cutícula, que reflejan plausiblemente el hecho de que estos colores corporales se atribuyen a gránulos de pigmento presentes en las células epidérmicas que son visibles a través de la cutícula transparente²⁶. Como se muestra en la Figura 4, no se reconocieron diferencias fenotípicas notables entre los individuos sometidos al tratamiento con ARNR y al tratamiento con ARSRNA, mientras que se observó una variación considerable en el tamaño y la ubicación del fenotipo de ARNi entre diferentes individuos sometidos al mismo tratamiento con ARNI (por ejemplo, comparar dos ejemplos de IsMCO2 dsRNA en la Figura 4).

Para determinar la etapa de desarrollo más adecuada para el tratamiento con ARNi, comparamos las consecuencias fenotípicas del tratamiento con ARNi en cinco etapas morfológicas (etapa A-E) en la estrella final de la larva de I. senegalensis (Figura 7A). Se observó inhibición de la pigmentación de melanina causada por ELNAi MCO2 en todos los adultos surgidos cuando se inyecta en las etapas A y B(Figura 7C). Cuando se inyecta en las etapas C y D, la supresión de la pigmentación de la melanina se observó sin duda en algunos adultos emergidos, pero otros adultos mostraron coloración anormal causada por heridas (Figura 7B).

Figura 1: Métodos de ARNi mediados por electroporación en Odonata. A. Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) como una especie representativa de la presa. B. Pseudothemis zonata (Libellulidae) como una especie representativa de libélulas. C. El esquema general de los protocolos. Las cajas azules y naranjas indican los protocolos para I. senegalensis y P. zonata,respectivamente. Las cajas púrpuras indican los protocolos comunes aplicados a ambas especies. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 2: Resultado representativo de la identificación de especies basadas en polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) para especies de Ischnura. Arrowhead indica la banda específica de I. senegalensis. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: marcador de escalera de par de 100 bases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Método RNAi mediado por electroporación en Odonata. A-C. Anestesia helada de I. senegalensis. Las puntas de flecha indican una larva. A. Poner una larva sobre hielo triturado con un papel mojado. B. Vista magnificada de una larva sobre hielo. C. Una larva cubierta con un papel mojado sobre hielo. D-G. Método RNAi para I. senegalensis. D. Inyección en el tórax. E. Electroporación en el tórax. F. Inyección en el abdomen. G. Electroporación en el abdomen. H-J. Método RNAi para P. zonata. H. Haciendo un pequeño agujero en el abdomen. Yo. Inyección en el abdomen. J. Electroporación en el abdomen. Las flechas indican el punto de hacer un agujero o inyección. +, -: Electrodos laterales positivos/negativos. Los números indican el segmento abdominal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Vistas dorsales de fenotipos de ARNi en el abdomen de I. senegalensis. Las puntas de flecha blancas indican las regiones de la melanización suprimida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Vistas laterales y dorsales de los fenotipos de ARNi en el tórax de I. senegalensis. Las puntas de flecha blancas y las líneas punteadas indican las regiones de pigmentación suprimida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Vistas ventrales de fenotipos de ARNi en el abdomen de P. zonata. Las puntas de flecha blancas y las líneas de puntos indican las regiones de la melanización suprimida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Efectos IsMCO2 RNI dependientes de la etapa durante la estrella larval final de I.senegalensis. A. Cambios morfológicos en los ojos compuestos en cinco etapas morfológicas (etapa A-E) y el número de días para la aparición de adultos en este estudio. Los números entre paréntesis proceden del informe anterior¹⁴. B. Pigmentación anormal debida a heridas. La punta de flecha indica el sitio de electroporación. C. El efecto del ARNi en cinco etapas morfológicas en la pigmentación adulta en I. senegalensis. El número de la barra indica el número de individuos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Especies		I.senegalensis							P.zonata
Región inyectada		Abdomen					Tórax		Abdomen
siRNA/dsRNA		Sirna		Dsarn			Dsarn		Dsarn
Gen objetivo		IsMCO2	EGFP	IsMCO2	IsMCO2	bla	IsMCO2	bla	PzMCO2	PzMCO2	bla
Electroporación		+	+	+	-	+	+	+	+	-	+
Larvas inyectadas		22	25	30	6	53	12	20	17	5	9
Adultos emergidos		7	6	13	4	40	11	14	11	2	5
Adultos con regiones menos pigmentadas (ratio)		7 (100%)	0 (0%)	13 (100%)	0 (0%)	0 (0%)	10 (91%)	0 (0%)	11 (100%)	0 (0%)	0 (0%)

Tabla 1. El efecto del ARNi en la pigmentación adulta en I. senegalensis y P. zonata. Los resultados en la etapa A se muestran en I. senegalensis. IsMCO2: multicopper oxidasa 2 gen de I. senegalensis, EGFP: Gen de proteína fluorescente verde mejorado, bla: gen de lactamasa beta de pGEM-T Easy Vector, PzMCO2: multicopper oxidasa 2 gen de P. zonata. Los resultados de los genes de control representan el número total de experimentos que los autores han realizado hasta la fecha.

Discusión

Letalidad del tratamiento con ARNi

Encontramos que la letalidad del tratamiento con ARNi depende en gran medida de la historia de la crianza y el estado de las larvas de Odonata. Las larvas poco después de la recolección en el campo son generalmente saludables y exhiben bajas tasas de mortalidad después del tratamiento de ARNi mediado por electroporación. Por el contrario, las larvas criadas en el laboratorio durante un largo período de tiempo (por ejemplo, un mes) tienden a sufrir bajas tasas de éxito de aparición de adultos. En I. senegalensis,en lugar de las larvas recogidas en el campo, las larvas criadas en el laboratorio a partir de huevos se pueden utilizar¹⁴, pero las tasas de éxito de ARNi utilizando las larvas criadas en laboratorio tienden a ser considerablemente más bajas (muchos individuos murieron durante la metamorfosis) que los que utilizan las larvas recogidas en el campo. Además, la alimentación larvaria frecuente y la cría de agua limpia son importantes para aumentar las tasas de éxito de la aparición de adultos y reducir la letalidad del tratamiento con ARNi.

Eficiencia del tratamiento con ARNi

Como se describió anteriormente, los niveles de fenotipo de ARNi, a saber, el tamaño y la ubicación de la decoloración de la cutícula, a menudo presentaban variaciones considerables entre los individuos sometidos al mismo tratamiento de ARNi (por ejemplo, la Figura 4),pero los niveles de la penetración fenotípica parecen ser notablemente diferentes entre la especie Odonata. Las regiones fenotípicas observadas fueron más grandes y prominentes en I. senegalensis (Figuras 4-5) que en P. zonata (Figura 6) y N. pygmaea⁹. Esta diferencia puede deberse al grosor de la cutícula en la superficie larvaria, teniendo en cuenta que la cutícula de I. senegalensis es más delgada que la cutícula de P. zonata y N. pygmaea). Por lo que examinamos, no se reconoció una diferencia clara entre los efectos del ARNr y el ARS (Figura 4, Tabla 1).

Etapa de desarrollo adecuada para el ARNi

Cabe señalar que la estadificación larvaria adecuada es importante para realizar el ARNi de manera eficiente. La inhibición de la pigmentación adulta fue causada por EL ARNi MCO2 antes de la etapa D (aproximadamente 3 días antes de la aparición de adultos), lo que es consistente con el informe anterior sobre N. pygmaea⁹. Los fenotipos de ARNi observados cuando se inyectaban en las etapas C y D eran menos visibles que los tratados en las etapas A y B, lo que indica que las etapas C y D pueden ser demasiado tardes para suprimir suficientemente la expresión génica. El momento adecuado para el tratamiento con ARNi depende del momento de la expresión génica, y el gen MCO2 exhibe una expresión significativamente alta durante la aparición adulta⁹, como en otros insectos^17,18. En el apestoso Plautia stali, RNAi derribo del gen MCO2 se observó desde el día 4 en adelante después de la inyección²⁷, que es consistente con los resultados actuales.

Nuestro estudio previo sobre I. senegalensis mostró que, después de la etapa B, los días a la aparición adulta exhiben variaciones relativamente pequeñas entre la mayoría de las larvas instar finales, lo que sugiere que la etapa B puede corresponder al inicio del proceso hacia la aparición adulta, después de lo cual los procesos de desarrollo para la metamorfosis proceden de manera prefijada y coordinada¹⁴. A menudo se observaron anomalías morfológicas causadas por heridas cuando las larvas fueron tratadas con ARNi en las etapas C y D (Figura 7B, 7C). Es probable que esto se asocie con una progresión dramática de la metamorfosis durante estas etapas, lo que sugiere que el tratamiento con ARNI debe evitarse desde la etapa C y en. En resumen, recomendamos que las larvas instar finales en la etapa A o B (o en la etapa antes de que las alas larvales se expandan significativamente) se utilicen para experimentos con ARNi.

Utilidad y superioridad del método de ARNi mediado por electroporación

El RNAi convencional es un método experimental simple y potente, pero algunos linajes de insectos como las mariposas^10,los áfidos²⁸ y las libélulas⁹ exhiben una baja eficiencia de ARNi, para lo cual el establecimiento del análisis de la función génica es un desafío importante. En este estudio, encontramos que el ARNi mediado por la electroporación puede inducir la supresión del gen local en libélulas con casi 100% de eficiencia, al menos en epidermis, si se trata en etapas de desarrollo apropiadas (Tabla 1). Recientemente, los nocauts genéticos basados en CRISPR/Cas9 se han aplicado con éxito a una variedad de insectos, proporcionando una poderosa herramienta genética molecular para organismos no modelo^29. Aquí, sin embargo, señalamos que CRISPR/Cas9 es ciertamente grande, pero el método RNAi mediado por electroporación puede ser superior a CRISPR/Cas9 en algunos aspectos.

En primer lugar, en el método RNAi mediado por electroporación, la región del cuerpo donde aparecen los fenotipos de ARNi puede controlarse fácilmente experimentalmente por la posición del electrodo positivo tras la electroporación. Además, dado que la región donde se suprime la expresión génica está limitada en toda la región donde se colocó el electrodo positivo, los fenotipos de ARNi se pueden comparar fácilmente con los fenotipos de control uno al lado del otro en el mismo individuo. En segundo lugar, en comparación con el método CRISPR/Cas9 en el que los huevos inyectados tienen que ser criados hasta la edad adulta para observar los fenotipos knockout, el ARNI mediado por electroporación es superior en el tiempo que los fenotipos de derribo del gen generalmente se pueden observar en un tiempo mucho más corto. Por ejemplo, I. senegalensis tarda de tres a cuatro meses y para P. zonata de huevos a adultos^14,30. Sin embargo, para observar fenotipos de ARNi dentro de la epidermis adulta, se tarda menos de un mes desde la inyección de dsRNA en larvas instar finales en la etapa B hasta la aparición adulta tanto para I. senegalensis como para P. zonata (Figura 7). En tercer lugar, el método RNAi mediado por electroporación implica la inyección de ARNrna en larvas grandes, que es más fácil que la microinyección en huevos diminutos necesarios para el método CRISPR/Cas9. Además, el ARNi mediado por la electroporación es aplicable a las especies de insectos cuyos huevos recién puestos son difíciles de recolectar. Por ejemplo, las hembras de P. zonata ponen huevos sobre plantas flotantes sobre la superficie del agua durante el vuelo, y por lo tanto es difícil recoger sus huevos tanto en el campo como en el laboratorio. Por lo tanto, esperamos que este protocolo pueda ser generalmente aplicable a organismos no modelo en los que el método RNAi convencional no funciona de manera eficiente.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plate	Violamo	VTC-P12	For rearing larvae before injection
Brine shrimp eggs	JAPAN PET DESIGN	4975677012396
Calibrated micropipette (1-5 µL)	Drummond	2-000-001-90
Deposit pestle 1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	K749520-0090
Digital high defenition microscope camera	Leica Microsystems	MC170HD
Disposable non-woven mesh	HAKUGEN EARTH	DSC-105A
DNA Ligation Kit Ver.2.1	Takara Bio	6022
DraI	Takara Bio	1037A
Electrode (1mmφ)	NEPAGENE	CUY650P1
Electroporator	CellProduce	Cure-gene
Forceps	KOWA Forceps Industry	K-10 No1
Glass needle puller	NARISHIGE	PN-3
Hand mixer	AS ONE	1-229-02
Hand net	HOGA	IS33-3B
HEPES	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	346-01373	For injection buffer
Insect pin capitate No. 3	Shiga Konchu Fukyusha	N230	For fixing larvae
KCl	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-03545	For PBS
KH2PO4	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	169-04245	For PBS
KOAc	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	160-03175	For injection buffer
KOH	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	168-21815	For injection buffer
Laboratory Jack (150x150)	AS ONE	1-4642-11	For adjusting the position of the manipulator
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type	GE Healthcare	2369385
Manipulator	Muromachi Kikai Co., Ltd.	SJ-1	For adjusting the position of the injector and the capillary
MEGAscript RNAi kit	Thermo Fisher Scientific	AM1626
Mg(OAc)2	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	130-00095	For injection buffer
Na2HPO4	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	197-02865	For PBS
NaCl	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	191-01665	For PBS
Petri dish (5 cm diameter)	Iwaki	1010-060	For rearing injected larvae
Pneumatic Injector	NARISHIGE	IM-12
pT7Blue T-Vector	Novagen	69820
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28106
RNAiso Plus	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	9109
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74106
Shiga micro insect pin with stainless headless	Shiga Konchu Fukyusha	N251	For making a small hole
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	S8APO
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Thermo Fisher Scientific	18090010
TaKaRa Ex Taq	Takara Bio	RR001B	For PCR-amplification from plasmid
Tks Gflex DNA Polymerase	Takara Bio	R060B	For PCR-amplification from caudal gill