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Resumen

En un modelo de excitotoxicidad de C. elegans , este protocolo emplea imágenes in vivo para analizar la regulación de la neurodegeneración necrótica, el efecto de los genes que codifican mediadores candidatos y la participación de las mitocondrias. La disociación y clasificación celular se utiliza para obtener específicamente neuronas en riesgo para el análisis transcriptómico específico de células de la neurodegeneración y los mecanismos de neuroprotección.

Resumen

La necrosis excitotóxica es una de las principales formas de neurodegeneración. Este proceso de necrosis regulada se desencadena por la acumulación sináptica del neurotransmisor glutamato y la estimulación excesiva de sus receptores postsinápticos. Sin embargo, se carece de información sobre los eventos moleculares posteriores que culminan en la morfología distintiva de la inflamación neuronal de este tipo de neurodegeneración. Otros aspectos, como los cambios en compartimentos subcelulares específicos, o la base de la vulnerabilidad celular diferencial de distintos subtipos neuronales, siguen siendo poco explorados. Además, una serie de factores que entran en juego en los estudios que utilizan preparados in vitro o ex vivo podrían modificar y distorsionar la progresión natural de esta forma de neurodegeneración. Por lo tanto, es importante estudiar la necrosis excitotóxica en animales vivos mediante el seguimiento de los efectos de las intervenciones que regulan el alcance de la necrosis neuronal en el sistema modelo genéticamente aceptable y transparente del nematodo Caenorhabditis elegans. Este protocolo describe métodos para estudiar la necrosis excitotóxica en neuronas de C. elegans , combinando análisis ópticos, genéticos y moleculares. Para inducir condiciones excitotóxicas en C. elegans, se combina un knockout de un gen transportador de glutamato (glt-3) con un fondo genético sensibilizador neuronal (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) para producir hiperestimulación del receptor de glutamato y neurodegeneración. El contraste de interferencia diferencial (DIC) de Nomarski, la microscopía fluorescente y la microscopía confocal en animales vivos son métodos utilizados para cuantificar la neurodegeneración, seguir la localización subcelular de las proteínas marcadas con fluorescencia y cuantificar la morfología mitocondrial en las neuronas en degeneración. La clasificación de células activadas por fluorescencia neuronal (FACS) se utiliza para clasificar claramente las neuronas en riesgo para el análisis transcriptómico específico del tipo de célula de la neurodegeneración. Una combinación de métodos de imágenes en vivo y FACS, así como los beneficios del organismo modelo de C. elegans , permiten a los investigadores aprovechar este sistema para obtener datos reproducibles con un tamaño de muestra grande. Los conocimientos de estos ensayos podrían traducirse en nuevos objetivos para la intervención terapéutica en enfermedades neurodegenerativas.

Introducción

La excitotoxicidad es la principal causa de muerte neuronal en la isquemia cerebral y un factor contribuyente en múltiples enfermedades neurodegenerativas 1,2,3,4,5,6,7,8,9. La interrupción del flujo sanguíneo oxigenado al cerebro (por ejemplo, debido a un coágulo de sangre) resulta en el mal funcionamiento de los transportadores de glutamato, lo que lleva a la acumulación de glutamato en la sinapsis. Este exceso de glutamato activa en exceso los receptores de glutamato postsinápticos (GluR), lo que conduce a una afluencia excesiva (catalítica, no estequiométrica) de Ca2+ a las neuronas (Figura 1A). Esta afluencia perjudicial conduce a una neurodegeneración postsináptica progresiva que morfológica y mecánicamente va desde la apoptosis hasta la necrosis regulada 10,11,12. A pesar de que se basaron en intervenciones exitosas en modelos animales, múltiples ensayos clínicos de antagonistas de GluR que buscaban bloquear la entrada de Ca2+ y promover la viabilidad celular han fracasado en el ámbito clínico 13,14,15,16. Un probable contribuyente crítico a estos fracasos es el hecho de que (a diferencia de los modelos animales) el tratamiento en el entorno clínico se administra horas después del inicio del accidente cerebrovascular, lo que hace que la intervención bloquee los mecanismos neuroprotectores de acción tardía, mientras que no interrumpe la señalización degenerativa aguas abajo de GluRs 14,16,17. Un abordaje alternativo, que se basa en la trombólisis, solo puede administrarse dentro de un período de tiempo muy restringido, lo que hace que muchos pacientes (que sufren un accidente cerebrovascular en casa con un tiempo de inicio poco identificable) no puedan beneficiarse de él17. Estos contratiempos enfatizan la necesidad de centrar la investigación de la excitotoxicidad en el estudio de los eventos que ocurren después de la hiperestimulación con GluR y diferenciar las cascadas degenerativas posteriores de los procesos neuroprotectores concurrentes. Este enfoque puede ayudar a prevenir el daño celular e identificar dianas farmacológicas eficientes que puedan administrarse más tarde tras la aparición del daño.

Un enfoque para identificar eventos posteriores en la excitotoxicidad es estudiar los mecanismos de señalización de muerte celular aguas abajo de la hiperestimulación GluR, como los que conducen al colapso mitocondrial. El mal funcionamiento drástico de la fisiología y la dinámica mitocondrial es un sello distintivo de la neurodegeneración, como se observa en la excitotoxicidad 18,19,20. Si bien todas las células dependen de la función y disponibilidad mitocondrial para sobrevivir, actividad y mantenimiento celular, las neuronas dependen particularmente de la producción de energía mitocondrial para apoyar la transmisión y propagación de señales. En concreto, las neuronas gastan ~50% de su consumo de energía relacionado con la señalización para restaurar el potencial de membrana en reposo tras la activación de los receptores/canales postsinápticos21, con una alta dependencia del oxígeno y la glucosa. La reducida disponibilidad de glucosa y oxígeno observada en el ictus conduce a graves alteraciones mitocondriales, provocando una mayor reducción de la producción de ATP 19,22,23,24. Sin embargo, los estudios para identificar la secuencia de eventos que conducen al colapso mitocondrial produjeron resultados controvertidos y carecieron de consenso. El análisis de la morfología mitocondrial puede ayudar a comprender estos eventos que conducen a la patología mitocondrial, ya que es un buen indicador de la salud neuronal 25,26,27,28,29. Las mitocondrias filamentosas son representativas de una neurona sana, mientras que las mitocondrias fragmentadas revelan un daño neuronal sustancial que podría conducir a la muerte celular. El análisis de la morfología mitocondrial en animales vivos bajo diferentes condiciones genéticas puede ayudar a centrarse en genes específicos y vías implicadas en la neurodegeneración dependiente de mitocondrias en la excitotoxicidad.

Otro enfoque para identificar eventos posteriores que podrían regular el alcance de la neurodegeneración excitotóxica es estudiar los mecanismos neuroprotectores transcripcionales que mitigan algunos de los efectos de la excitotoxicidad14,16. Sin embargo, la falta de especificidad de los factores de transcripción neuroprotectores clave y la divergencia de las configuraciones experimentales impiden el éxito de los esfuerzos para identificar claramente los programas neuroprotectores centrales (especialmente en la necrosis regulada).

Por lo tanto, tanto el estudio de las vías de señalización de la muerte aguas abajo como el estudio de la neuroprotección transcripcional en la excitotoxicidad encontraron grandes dificultades y desacuerdos sobre los resultados observados. Es probable que gran parte de esta controversia surja del uso de modelos ex vivo o in vitro de excitotoxicidad, y de la variabilidad introducida por la especificidad de diferentes configuraciones experimentales. Por lo tanto, es muy beneficioso centrarse en la identificación de los mecanismos centrales que están altamente conservados y estudiarlos in vivo. El sistema modelo simple del nematodo C. elegans ofrece una opción particularmente efectiva, debido a la potente combinación de herramientas de investigación particularmente poderosas y diversificadas, la conservación de las vías centrales de muerte celular y la rica información sobre la estructura y conectividad de su sistema nervioso 30,31,32,33. De hecho, el trabajo seminal del laboratorio Driscoll sobre el análisis genético de la neurodegeneración necrótica en neuronas mecanosensoriales es una excelente demostración del poder de este enfoque34. Es importante destacar para el análisis de la excitotoxicidad, que la conservación de las vías de señalización en el nematodo incluye todos los componentes principales de la neurotransmisión glutamatérgica35,36.

El modelo de excitotoxicidad de los nematodos se basa en estos estudios seminales, lo que permite al investigador estudiar procesos bioquímicos similares a los que ocurren en el accidente cerebrovascular y otras enfermedades neurodegenerativas afectadas por la neurotoxicidad dependiente del glutamato. Para inducir condiciones excitotóxicas en C. elegans, este enfoque experimental utiliza una cepa de excitotoxicidad que es la combinación de un knockout de un gen transportador de glutamato (glt-3) y un fondo genético sensibilizador neuronal (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) para producir hiperestimulación y neurodegeneración de GluR37. Esta cepa de excitotoxicidad expone 30 neuronas específicas (que expresan glr-1) que son postsinápticas a las conexiones glutamatérgicas con la neurodegeneración excitotóxica. De estas 30 neuronas en riesgo, las neuronas individuales pasan por necrosis a medida que el animal avanza en el desarrollo (con estocasticidad mixta y preferencia parcial hacia ciertas neuronas específicas38), mientras que al mismo tiempo los cadáveres de células también se eliminan gradualmente. En combinación con la accesibilidad de muchas cepas mutantes, este enfoque permite el estudio de múltiples vías que afectan a la neurodegeneración y la neuroprotección. Estos enfoques ya se han utilizado para analizar algunas de las cascadas de señalización de muerteposteriores 39 y los reguladores transcripcionales de la neurodegeneración excitotóxica en la excitotoxicidad38,40. Al igual que otros casos de neurodegeneración necrótica en el gusano41, la neurodegeneración excitotóxica del nematodo no implica la apoptosis clásica40.

Este artículo de métodos describe el sistema básico para inducir, cuantificar y manipular la neurodegeneración necrótica excitotóxica en C. elegans. Además, describe dos protocolos principales que se utilizan actualmente para agilizar los estudios de aspectos específicos de la excitotoxicidad de los nematodos. Mediante el uso de reporteros fluorescentes e imágenes in vivo en vivo, el investigador puede estudiar la participación mitocondrial y la dinámica en el modelo de nematodos de la neurodegeneración excitotóxica. Para determinar el efecto de factores de transcripción neuroprotectores específicos, el investigador puede utilizar la expresión específica del tipo celular de marcadores fluorescentes, la disociación de animales en células individuales y FACS para aislar neuronas específicas que están en riesgo de necrosis por excitotoxicidad. Estas neuronas aisladas específicas de un tipo de célula se pueden utilizar para la secuenciación de ARN en cepas que albergan mutaciones en factores de transcripción clave. En conjunto, estos métodos pueden permitir a los investigadores desentrañar los fundamentos moleculares de la neurodegeneración excitotóxica y la neuroprotección in vivo con gran claridad y precisión.

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Protocolo

1. Cepas utilizadas para investigar la neurodegeneración excitotóxica y la neuroprotección

  1. Utilice la cepa de excitotoxicidad de nematodos ZB1102 como punto de referencia para la neurodegeneración excitotóxica estándar.
    NOTA: La excitotoxicidad dependiente de glutamato en C. elegans se produce en la cepa ZB1102 mediante la combinación de un knockout (ko) de un transportador de glutamato con un transgén que sensibiliza las neuronas de estos animales a la neurotoxicidad y se expresa en un subconjunto de neuronas postsinápticas a las conexiones glutamatérgicas37. Esta combinación genética se conoce como la cepa de excitotoxicidad del nematodo, y está disponible gratuitamente en el Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC).
  2. Para estudiar el efecto de los genes que codifican candidatos a reguladores de la necrosis excitotóxica, combine una mutación en dichos genes (por ejemplo, dapk-1 o crh-1) con la cepa de excitotoxicidad del nematodo.
  3. Realizar cruzamientos genéticos de acuerdo con los métodos estándar de C. elegans 30, como se describe en wormbook.org42,43.
  4. Dado que la base molecular de la mutación suele estar documentada, hay que seguir la progenie cruzada mediante el genotipado del locus específico mediante PCR. Diferencie WT vs mutante por tamaño de fragmento (para deleciones) o secuenciación (para mutaciones puntuales).
    NOTA: En la Tabla 1 se describen las cepas que se utilizaron para estudiar distintas vías de neurodegeneración y neuroprotección, específicamente para este protocolo.
  5. Derivar todas las cepas críticas por dos líneas independientes y probarlas por separado para confirmar la validez del fenotipo observado.

2. Medios de cultivo y cría de animales

  1. Cultive lombrices a 16-25 °C en placas NGMestándar 30,37,42 o placas MYOB 38,44 sembradas con E. coli OP50 según los métodos estándar.
    NOTA: Las placas MYOB dan resultados idénticos a las placas NGM, pero son un poco más fáciles de preparar.
  2. Mantener las cepas experimentales consistentemente bien alimentadas.
    NOTA: La inanición puede afectar a la neurodegeneración y reducir el número de neuronas de la cabeza que mueren. Si los gusanos están mal alimentados o hambrientos, colóquelos en platos frescos y espere algunas generaciones antes de continuar con los experimentos. El efecto transgeneracional de la inanición disminuirá después de unas pocas generaciones.

3. Cuantificación de neuronas cabeza en degeneración mediante contraste de interferencia diferencial (DIC) de Nomarski y puntuación

  1. Utilice la cepa de excitotoxicidad de nematodos (ZB1102: glt-3(bz34) IV; nuIs5 V) como control experimental para la cuantificación, representando los niveles normales de excitotoxicidad. El protocolo no sigue al mismo animal a través de diferentes etapas de desarrollo. En su lugar, proporciona una instantánea de una población de animales en etapas mixtas, de modo que en total se recopila información de diferentes animales para representar todas las etapas de desarrollo.
    NOTA: El transgén nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L). Pglr-1::GFP]45 (que expresa una Gαs y GFP activadas en las neuronas postsinápticas a las conexiones glutamatérgicas) produce un nivel de neurodegeneración necrótica independiente de GluR de ~1 neurona principal/animal moribunda (en cualquier momento dado durante el desarrollo). La adición de glt-3 (ko) aumenta la neurodegeneración necrótica de las neuronas postsinápticas que expresan nuIs5 de forma dependiente de GluR, llegando a 4-5 neuronas de cabeza moribundas/animal en el tercer estadio larvario (L3)37.
  2. Para las cepas de ensayo, utilice animales de un cruce genético recientemente terminado, o descongele las cepas de interés a partir de cepas congeladas a -80 °C preparadas a partir de cruces frescos. Espere unas cuantas generaciones (≥4) antes de anotar un fenotipo y una neurodegeneración.
  3. Corta y retira un pequeño trozo de agar de una placa de una población de animales bien alimentados en una etapa mixta, y móntalo en un cubreobjetos volteando el trozo de agar, de modo que los animales que se arrastraban por la superficie del agar ahora miren hacia el cubreobjetos.
    NOTA: Los animales aún pueden moverse, pero ahora están algo restringidos y se pueden observar sin anestesia. Dicho trozo se puede usar durante ~ 1 hora antes de reemplazarlo por uno nuevo.
  4. Usando un visor DIC invertido con ocular x10 y objetivo x40 o x63, escanee animales al azar deslizando el cubreobjetos manualmente. Mientras que otros pasos de imagen que se describen a continuación se pueden realizar en microscopios invertidos o verticales, el examen de gusanos en el trozo de agar requiere un endoscopio invertido.
  5. Identifique la etapa de desarrollo de cada animal por la forma de su útero (consulte los diagramas de útero en wormbook.org).
  6. Para cada animal, registre su etapa de desarrollo y el número de neuronas moribundas (es decir, vacuoladas). Cuente y registre el número total de neuronas moribundas en la cabeza, el número de neuronas moribundas en el ganglio retrovesicular (que facilita la identificación de células específicas) y el número de neuronas moribundas en la cola (que no se ve afectada por el glutamato y sirve como control interno, confirmando que el transgén sensibilizador nuIs5 está completamente activo).
  7. Registre estos datos en una tabla en la que los animales de una cepa determinada se agrupan por categorías de etapa de desarrollo.
  8. En cada sesión, recoja datos al azar de gusanos de varias etapas de desarrollo; Realice varias sesiones de puntuación a lo largo de varios días para recopilar suficientes datos para el análisis estadístico. Registre los niveles de neurodegeneración en múltiples etapas y construya un gráfico de barras similar a la Figura 1C.
    NOTA: Este método permitirá determinar si un determinado tratamiento o mutación aumenta/disminuye los niveles de neurodegeneración en todas las etapas (desplazando la distribución hacia arriba/abajo) o desplaza el pico de neurodegeneración a una etapa de desarrollo más temprana o posterior (desplazando la distribución izquierda/derecha).
  9. Realizar la recopilación de datos sin conocer la identidad del genotipo. Confirmar en dos aislados independientes de la línea genética (para minimizar el peligro de efectos no deseados de otras diferencias genéticas inesperadas entre los aislados) y agrupar los datos para su análisis.
  10. En cada cepa, calcule el promedio y el SEM del número de neuronas degeneradas en la cabeza (incluido el ganglio retrovesicular) en cada etapa del desarrollo (Figura 1D). Realice un análisis similar de las neuronas de ganglios retrovesiculares y de cola moribundas, según sea necesario.

4. Identificación de neuronas principales degenerativas específicas

  1. Monte animales individuales (o pequeños grupos de) en una almohadilla de agar46 y paralice el gusano con tetramisol (ver más abajo, sección 5).
  2. Con un osciloscopio combinado de fluorescencia y DIC (vertical o invertido) localiza neuronas vacuoladas específicas.
  3. Determine la identidad neuronal específica de la neurona vacuolada mediante el seguimiento de sus procesos marcados con GFP y comparando la ubicación del cuerpo de la célula y la forma de los procesos con los de las neuronas que se sabe que expresan glr-1 utilizando WormAtlas47.
    NOTA: Alternativamente, la identificación puede ser asistida por nuevos métodos para identificar rápidamente las neuronas mediante el etiquetado multicolor que pronto llegarán del laboratorio Hobert48.

5. Imágenes en vivo de la morfología mitocondrial neuronal por microscopía fluorescente de cepas reporteras

  1. Para obtener imágenes de los cambios mitocondriales en las neuronas postsinápticas en degeneración (que están marcadas con GFP citoplasmática en la cepa de excitotoxicidad original), examine la fluorescencia de mito-mCherry.
  2. Cruce la cepa de excitotoxicidad de prueba con cepas que marquen las mitocondrias de las neuronas postsinápticas con fluorescencia roja (expresando una fusión entre la proteína fluorescente y el N-terminal de TOM-20 bajo el promotor glr-1 ; para más detalles sobre las construcciones y las cepas, véase49). Ahora se pueden obtener imágenes de los animales utilizando un microscopio de epifluorescencia normal (vertical o invertido) o un microscopio confocal.
  3. Para paralizar el gusano sin afectar la supervivencia neuronal, pipetee 5 μL de tetramisol de 10 mM en una almohadilla de agarosa recién preparada. Véase Arnold et al.46 para un protocolo detallado sobre la preparación de la almohadilla.
  4. Coloque los animales en el centro de la caída de tetramisol y móntelos con un cubreobjetos.
  5. Sella los lados del cubrebotas con esmalte de uñas y deja que el esmalte de uñas se seque.
  6. Dentro de los 20 minutos posteriores al tratamiento con tetramisol y utilizando un endoscopio con DIC e imágenes de fluorescencia, localice los gusanos con una lente de objetivo de 20x.
  7. Una vez que se localiza la cabeza del gusano (o las neuronas de interés), pase a un objetivo de aceite 100x y concéntrese en el marcaje de fluorescencia de las mitocondrias en el soma.
  8. Capture imágenes de pila Z con la configuración de filtro DIC, GFP y TxRed.

6. Puntuación y cuantificación de la morfología de las mitocondrias neuronales

  1. Analice la morfología mitocondrial, ya sea durante la obtención de imágenes en vivo del gusano o después de la adquisición de imágenes mediante ImageJ u otro software de imágenes.
  2. Para facilitar la identificación y el análisis repetido de neuronas específicas, identifique las tres neuronas en el ganglio retrovesicular, RIGL/R y AVG (en algunos casos solo dos están presentes debido a la eliminación del cadáver celular en la excitotoxicidad).
  3. Clasifique las mitocondrias en tres grupos principales: filamentosas, intermedias y fragmentadas 50,51,52.
    NOTA: Las mitocondrias filamentosas aparecen como estructuras delgadas continuas en el soma de las neuronas, generalmente alrededor del núcleo. Las mitocondrias intermedias aparecen como una combinación de al menos una red filamentosa aparente, aunque con rupturas, y cierta fragmentación en el soma. Las mitocondrias fragmentadas exhiben rupturas completas en la red mitocondrial, tienen apariencia hinchada y están dispersas por todo el soma (Figura 2A).
  4. Para cada gusano, marque el porcentaje de neuronas con mitocondrias filamentosas, intermedias o fragmentadas para un total de al menos 30 gusanos.
  5. Realizar análisis estadístico utilizando ANOVA de un factor seguido de una prueba de Tukey post hoc para cada morfología mitocondrial entre cepas53.

7. Preparación de tampones y reactivos para la disociación de gusanos para FACS de neuronas en riesgo de neurodegeneración

  1. Prepare el tampón M9 de la siguiente manera: 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl, H2O a 1 L. Esterilizar en autoclave. Añadir 1 mL de 1 M MgSO4 esterilizado por filtro. Almacene a temperatura ambiente.
  2. Prepare el tampón de huevo de la siguiente manera: 118 mM de NaCl, 48 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2 ; Autoclave para esterilizar. Añadir 2 M de solución madre HEPES pH 7,3 (previamente filtrada con un filtro de tapa de botella de 0,2 μm) hasta una concentración final de 25 mM. Ajuste el pH a 7.3 con 1 N NaOH (no más de 10 mL). Utilice un osmómetro para asegurarse de que la osmolaridad final esté entre 335 y 345 mOsm. Filtro esteriliza el tampón de huevo con filtros de tapa de botella de 0,2 μm. Conservar a 4 °C.
    NOTA: Las sales se disuelven más fácilmente cuando se utilizan MgCl2 ·6H2O y CaCl2·2H2O para hacer soluciones madre de MgCl2 y CaCl2 respectivamente. También puede hacer un caldo de 10x tampón de huevo y diluirlo cuando sea necesario en agua desionizada estéril.
  3. Prepare SDS-DTT de la siguiente manera: 20 mM HEPES pH 8.0, 0.25% SDS, 200 mM DTT, 3% sacarosa. En una campana de cultivo de tejidos, esterilice SDS-DTT con un filtro de jeringa de 0,2 μm. Almacene 300 μL de alícuotas a -20 °C cubiertas con papel de aluminio para protegerlas de la luz.
  4. Prepare la solución de pronasa de la siguiente manera: prepare el día de la disociación 15 mg/mL de pronasa en tampón de huevo. Almacenar en hielo.

8. Sincronización de edad para FACS específico de neuronas

  1. Utilice animales que combinen el genotipo de excitotoxicidad (y otras mutaciones, según se desee) con la expresión transgénica de un marcador fluorescente fuerte que pueda usarse fácilmente para la clasificación (por ejemplo, FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)54. Cultive animales en dos o tres placas NGM/MYOB de 100 mm a 20 °C hasta que la placa esté llena de gusanos predominantemente grávidos.
  2. Lave los gusanos de las placas con un tampón M9. Transfiera los gusanos a tubos cónicos de 50 mL con una pipeta serológica de vidrio de 10 mL.
  3. Centrifugar a temperatura ambiente durante 2,5 min a 250x g y eliminar el sobrenadante.
  4. Vuelva a suspender el pellet de gusano en 10 mL de solución de lejía (2% de NaOH 10 N y 5% de lejía doméstica fresca en agua desionizada estéril).
  5. Coloque los tubos en un agitador horizontalmente, balancee a baja velocidad. Asegúrese de que los gusanos no se depositen en el fondo del tubo. La lejía abre la cutícula del gusano, pero no afecta a los embriones, que están protegidos por la cáscara del huevo.
    1. Este paso de blanqueo dura aproximadamente 5 minutos, pero esto varía. Para asegurarse de que no se produzca un blanqueo excesivo, controle el proceso recuperando una muestra cada minuto: pipetee suavemente 10 μL de cada tubo en un portaobjetos de microscopio de vidrio y examine los gusanos con un microscopio de disección.
  6. Una vez que la mayoría de los gusanos grávidos se hayan abierto pero no se hayan disuelto por completo, detenga el paso de blanqueo llenando los tubos cónicos con tampón de huevo.
  7. Para recuperar los óvulos/embriones, centrifugar los tubos a 250x g durante 2,5 min, retirar el sobrenadante y lavar de nuevo con tampón de huevos.
  8. Repite cuatro lavados más.
  9. Vuelva a suspender los huevos pipeteando suavemente el pellet y extiéndalo en cuatro placas NGM/MYOB de 100 mm sembradas. Deje que los embriones eclosionen y crezcan a 20 °C durante 3 días.
    NOTA: Las placas ahora deberían estar llenas de gusanos predominantemente grávidos.
  10. Repita la sincronización de edad repitiendo este protocolo de sincronización de lejía/edad.
  11. Pipetea los huevos en ocho placas NGM/MYOB de 100 mm. Deje que el animal eclosione y crezca a 20 °C hasta que alcance la etapa larvaria deseada.

9. Disociación de células de lombriz entera para FACS

  1. Cultive gusanos sincronizados hasta la etapa de desarrollo deseada. Lave suavemente las placas de 100 mm con tampón M9 y pipetas serológicas de vidrio y transfiéralas a tubos cónicos de 50 ml.
  2. Agregue M9 frío hasta 45 mL. Coloque los tubos en hielo durante 30 minutos para permitir que los gusanos se asienten en el fondo por gravedad, mientras que los desechos bacterianos residuales de las placas flotarán en el sobrenadante.
  3. Retire el sobrenadante y lave los gusanos con M9 fresco.
  4. Repita los 30 minutos de asentamiento por gravedad en el hielo.
  5. Retire el sobrenadante, agregue M9 hasta 45 ml y centrifugue a 250 x g durante 5 minutos.
  6. Transfiera el pellet a un tubo de microcentrífuga y agregue M9 hasta 1 mL.
  7. Centrifugar a 14.000 rpm en una centrífuga de sobremesa durante 1 min y eliminar el sobrenadante.
  8. Para alterar la cutícula, vuelva a suspender el pellet de lombriz con SDS-DTT utilizando (aproximadamente) el doble del volumen del pellet, e incube meciéndose a temperatura ambiente durante 4 minutos para las etapas L2-adultas.
    NOTA: No exceda los 4 minutos de incubación en SDS-DTT porque la señal de proteína fluorescente disminuirá drásticamente con un tratamiento más prolongado con SDS-DTT. Dado que el SDS-TDT es sensible a la luz, no debería tener más de 3 meses de antigüedad porque la solución puede haber perdido potencia con el tiempo; Las disociaciones funcionan mejor con la solución SDS-DTT recientemente preparada.
  9. Añadir 1x tampón de huevo (pH 7,3, 335-345 mOsm) hasta 1 mL para detener el tratamiento SDS-DTT.
  10. Girar a 14.000 rpm en una centrífuga de mesa durante 1 minuto y eliminar el sobrenadante.
  11. Para alterar aún más la cutícula y disociar las células de los animales, vuelva a suspender el pellet con una solución de pronasa a temperatura ambiente, utilizando el triple del volumen del pellet.
  12. Incubar a temperatura ambiente durante 15-30 min.
  13. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 40 veces cada 5 min. con una pipeta P-200 o P-1000, tocando el fondo del tubo con la punta de la pipeta.
    NOTA: La presión creada por la punta que toca el fondo del tubo facilita la disociación del gusano. Utilice una punta de filtro para que los gusanos no entren accidentalmente en el eje de la pipeta durante el pipeteo rápido.
  14. Después de 15 minutos, verifique el progreso de la disociación del gusano pipeteando suavemente 5 μL en un portaobjetos de vidrio y observando el progreso bajo un microscopio de disección. Cuando la mayoría (~90%) de los gusanos intactos han reventado, el proceso se ha completado.
    NOTA: La incubación de Pronase puede prolongarse si muchos gusanos permanecen intactos.
  15. En una campana de cultivo celular, agregue 1 tampón de huevo de hasta 1,5 mL para detener el tratamiento con pronasa.
  16. Transfiera a los tubos FACS, agregue 5 ml de tampón de huevo y gire a 800 x g durante 5 minutos.
  17. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en tampón de huevo de 3 mL de pf.
  18. Coloque una tapa de filtro de celdas de 70 μm en tubos FACS nuevos, pipetee la suspensión de celdas en el colador y gire a 800 x g durante 1 min. Recoja la suspensión de la célula de eflujo.
  19. Coloque una tapa de filtro de celdas de 5 μm en tubos FACS nuevos, la suspensión de celdas de pipeta en el colador y gire a 800 x g durante 1 min.
  20. Añadir DAPI para obtener una concentración final de 0,5 μg/mL en tampón de huevo, colocar sobre hielo con una tapa/cubierta para protegerlo de la luz.
  21. Realice FACS lo antes posible. La señal de la proteína fluorescente disminuye con el tiempo y la exposición a la luz, por lo tanto, es importante realizar el protocolo de disociación lo más rápido posible y realizar FACS inmediatamente después de que se complete la disociación.
    NOTA: El protocolo de disociación de gusanos se adaptó de los protocolos del laboratorio Miller 55,56,57, el laboratorio Murphy 58 y el laboratorio Shaham59.

10. Modificaciones en el funcionamiento de la máquina FACS para la identificación de neuronas de C. elegans

  1. Utilice 4 litros de tampón de huevo refrigerado (4 °C) en lugar de líquido de vaina estándar cuando clasifique las neuronas de C. elegans .
    NOTA: La osmolaridad de las células de C. elegans es mucho mayor que la de las células de mamíferos y el líquido de la vaina estándar reventará las neuronas. Todos los ajustes y calibraciones de la máquina se realizan después de agregar el tampón de huevo, porque la viscosidad del tampón de huevo es diferente a la del fluido de vaina estándar. El técnico de clasificación pasará las perlas de diagnóstico a través de la máquina para asegurarse de que los láseres funcionen correctamente.
  2. Cuando se vayan a utilizar neuronas clasificadas en estudios transcriptómicos posteriores, se deben clasificar un mínimo de 100.000 células GFP+ directamente en 800 μL de Trizol-LS + 10 μL de inhibidor de la RNasa.
  3. Invierta las células en Trizol 15 veces para mezclar.
  4. Congele en un baño de hielo seco/etanol y almacene a -80 °C hasta que esté listo para extraer el ARN de todas las muestras para un experimento de secuenciación de ARN.
    NOTA: Si bien la mayoría de las células clasificadas se recolectan directamente en Trizol para el análisis del transcriptoma, asegúrese de recuperar una pequeña muestra de células clasificadas por GFP+ (de cada cepa) recolectadas en el tampón de huevos, para la validación microscópica de la eficiencia de la clasificación.

11.Estrategia de compuerta FACS

  1. Para identificar la señal positiva de GFP, utilice el láser de 488 nm con el filtro 530/30 y el filtro de paso largo 502 (LP).
  2. Para identificar las células DAPI positivas y negativas, utilice el láser de 405 nm con el filtro 450/50.
  3. Para identificar las células autofluorescentes que podrían confundirse con células GFP positivas, utilice el láser de 488 nm con el filtro 610/20 y 595 LP (comunicación personal, Stanka Semova, Directora de Operaciones, Centro de Recursos de Citometría de Flujo, Universidad Rockefeller).
  4. Realice una estrategia de compuerta estándar y elimine los eventos con un área de dispersión lateral grande (SSC-A) y una área de dispersión directa pequeña (FSC-A), que probablemente representen grupos de celdas y desechos.
  5. Aísle las camisetas de dispersión del prólogo y, a continuación, las camisetas singles de dispersión lateral.
  6. Aísle células con alta señal de GFP y baja señal de autofluorescencia.
    NOTA: Las células con un alto contenido de autofluorescencia y un nivel más bajo de GFP no son verdaderas células positivas para GFP.
  7. El umbral para la puerta GFP+ se determina comparando las celdas GFP- (es decir, N2) con las celdas GFP+55,56.
  8. Eliminar las células muertas con una puerta viva/muerta, en función de la permeabilidad selectiva de DAPI a las células muertas: el umbral para la puerta muerta viva se determina comparando las células no teñidas con las células teñidas con DAPI.
    NOTA: Al clasificar varias muestras, enjuague el flujo entre muestras para asegurarse de que no haya contaminación cruzada.

12. Microscopía de neuronas clasificadas para validar la eficiencia de la estrategia de compuerta FACS

  1. Dibuja un círculo en un portaobjetos de vidrio para microscopio con un bolígrafo repelente de líquidos.
  2. Pipetear 10 μL de células clasificadas en suspensión en tampón de huevo dentro del círculo. Coloque un cubreobjetos sobre la muestra y séllelo con esmalte de uñas alrededor del perímetro del cubreobjetos.
  3. Una vez que el esmalte de uñas se haya secado, verifique con un microscopio fluorescente vertical/invertido que las celdas clasificadas sean principalmente células GFP +.
    NOTA: Realice esta comprobación después de cada sesión de clasificación para validar la estrategia de compuerta FACS57.

13. Extracción de ARN y cuantificación de la calidad del ARN en un sistema de electroforesis automatizado de control de calidad

NOTA: Todo el trabajo de ARN debe ejecutarse con extremo cuidado para evitar la contaminación con ARNasa (incluida la preparación cuidadosa de reactivos, consumibles y las mejores prácticas seguras para la ARNasa).

NOTA: Realice todos los pasos en los que las muestras contengan fenol y/o cloroformo en una campana extractora.

  1. Descongele los viales de celdas de Trizol a temperatura ambiente.
  2. Con una punta de pipeta P200 con punta de filtro, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para homogeneizar la muestra.
  3. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  4. Agregue 0,2 mL de cloroformo por 1 mL de reactivo de Trizol utilizado para la lisis, luego tape firmemente el tubo.
  5. Invierta los tubos 15 veces e incube (a 20-25 °C) durante 2-3 minutos.
  6. Centrifugar la muestra durante 15 minutos a 12.000 × g a 4 °C. La mezcla se separa en una fase acuosa superior de fenol-cloroformo rojo, una interfase y una fase acuosa superior incolora.
  7. Recoger exclusivamente la fase acuosa superior que contiene el ARN y transferirla a un nuevo tubo de 1,5 ml de unión baja de ADN/ARN.
    NOTA: En algunos casos, si la proporción de células en el tampón de huevos que salieron del clasificador de células en Trizol es mayor que una proporción de 1:3 muestra:Trizol-LS, el alto contenido de sal del tampón de huevos puede hacer que las capas se inviertan; si esto ocurre, agregue más Trizol-LS y repita la inversión y la centrifugación. Esto también se puede evitar si toma nota del aumento en el volumen de la muestra después de la clasificación; si no se mantiene la proporción 1:3, agregue suficiente trizol antes de comenzar la extracción de ARN.
  8. Para purificar aún más el ARN, utilice la química de la columna de extracción de ARN.
  9. Utilice el sistema de electroforesis automatizado de control de calidad para medir el número de integridad del ARN (RIN) y confirmar un RIN de ARN de 8,0 o superior para su entrada en experimentos de secuenciación de ARN posteriores.

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Resultados

Modelo de nematodos de excitotoxicidad e identificación de neuronas degeneradoras vacuoladas
Los datos que aquí se muestran son reproducidos de publicaciones anteriores37,38. Para imitar la neurodegeneración inducida por excitotóxicos, se combina un knockout del gen transportador de glutamato (glt-3) con un fondo transgénico sensibilizador neuronal (nuls5

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Discusión

Si bien las controversias y fracasos prevalentes sugieren que la excitotoxicidad presenta un proceso excepcionalmente difícil de descifrar, el análisis de la excitotoxicidad en el nematodo ofrece una estrategia particularmente atractiva para iluminar las vías de muerte de las células neuronales conservadas en esta forma crítica de neurodegeneración. El investigador puede confiar en la rica colección de herramientas de investigación disponibles en este sistema, y en particular en ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio Mano y del laboratorio Li (actuales y recientes) por su ayuda y apoyo. Agradecemos a la Dra. Monica Driscoll (Rutgers Univ.) por ser pionera en el análisis de la neurodegeneración necrótica en nematodos y brindar un apoyo continuo; el Dr. Chris Li (CCNY) para apoyo y asesoramiento; Jeffery Walker (Centro Central de Citometría de Flujo de CCNY), Dr. Bao Voung (CCNY) y Stanka Semova (Centro de la Facultad de Clasificación de la Universidad Rockefeller) por su apoyo práctico y asesoramiento sobre la clasificación de células; Dr. Chris Rongo (Universidad de Rutgers) para reactivos; Dres. David Miller (Universidad de Vanderbilt), Coleen Murphy (Universidad de Princeton), Shai Shaham, Menachem Katz y Katherine Varandas (los tres de la Universidad Rockefeller) para los protocolos de disociación de C. elegans.

El laboratorio de Mano recibió fondos de NIH NINDS (NS096687, NS098350, NS116028) a I.M., y a través de una asociación NIH U54 CCNY-MSKCC (CA132378/CA137788).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarVWRAAA10752-0E
BactopeptoneVWR90000-264
BD FACSAriaIII BD
BleachAny household
CaCl2VWR97062-586
CaCl2·2H2O BioExpress0556-500G
Cell Strainer, PluriStrainer mini 70umPluriSelect43-10070-40
Cell Strainer, PluriStrainer mini 5umPluriSelect43-10005-60
Centrifuge - 15-50 mL Sorval benchtop  LEGENDX1R TC Fisher Sci75618382
Centrifuge - microfuge ; Ependorff 5424VWRMP022629891
ChloroformVWR97064-680
CholesterolSigmaC8667-25G
DAPIFisher SciEN62248
Dry iceUnited City Ice Cube
DTTVWR97061-340
E. coli OP50CGCOP50
Ethanol (100%)VWREM-EX0276-1S
Ethanol (90%)VWRBDH1160-4LP
FACS tubesUSA Sci1450-2810
Filter tips USA Sci1126-7810
Glass 10 mL serological pipettes USA Sci1071-0810
Heating block BioExpressD-2250
Hepes VWR97061-824
Immersion Oil - Carl Zeiss ImmersolFisher Sci12-624-66A
IsopropanolVWREM-PX1830-4
KClVWRBDH9258-2.5KG
KH2PO4VWRBDH9268-2.5KG
Low bind 1.5mL tubesUSA Sci4043-1021
Metamorph Imaging SoftwareMolecular Devices
MgCl2VWR97063-152
MgCl2·6H2OBioExpress0288-500g
MgSO4VWR97061-438 
Microscope, Confocal, for Fluorescence ImagingZeissLSM 880
Microscope, Inverted, for Fluorescence ImagingZeissAxiovert 200 M
Microscope  CameraQ-ImagingRetiga R1
Microscope Light Source for Fluorescence ImagingLumencorSOLA SE Light Engine
Microscope, Nomarski DICZeissAxiovert Observer A1
Microscope, Nomarski DICNikonEclipse Ti-S
Na2HPO4VWR97061-588
NaClVWRBDH9286-2.5KG
NaOHVWR97064-476
Petri dishes, 100mmFisher SciFB0875712
Petri dishes, 60mmTriTechT3308
Pipet ControllerTEquipmentP2002
Pipettor P10 TipsUSA Sci1110-3000
Pipettor P1000 TipsUSA Sci1111-2020
Pipettor P200 TipsUSA Sci1110-1000
PronaseSigmaP8811-1G
RNAse away sprayFisher Sci7000TS1
RNAse free serological pipettesUSA Sci1071-0810
RNAse-free 50 mL tubesUSA Sci5622-7261
RNeasy microQiagen74004
SDSVWR97064-496
Streptomycin sulfateSigmaS6501-100G
SucroseVWRAAJ63662-AP
SUPERase·in RNase inhibitorFisher SciAM2694
Quality Control automated electrophoresis system: Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent5067-5579 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent5067-5581 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent5067-5580
Tapestation - IKA MS3 vortexerAgilent/IKA4674100
Tapestation - IKA vortexer adaptor at 2000 rpm Agilent/IKA3428000
Tapestation - Loading tips Agilent5067- 5152 or 5067- 5153
Tapestation - Optical Cap 8x StripAgilent401425
Tapestation - Optical Tube 8x StripAgilent401428
Quality Control automated electrophoresis system: TapeStation 2200AgilentG2964AA
TetramisoleSigmaL9756-10G
Tris baseFisher SciBP152-500
Tris hydrochlorideFisher SciBP153-500
Trizol-LSFisher Sci10296-010
Wescor Vapro 5520 Vapor Pressure OsmometerFisher SciNC0044806
Wheaton Unispense μP DispenserVWR25485-003

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