Estudio de la terapia mejorada de cavitación

Resumen

El protocolo experimental presentado se puede utilizar para realizar medidas en tiempo real de la actividad de cavitación en un dispositivo de cultivo celular con el objetivo de permitir la investigación de las condiciones requeridas para la administración exitosa de fármacos y / u otros bioefectos.

Resumen

El interés en las aplicaciones terapéuticas del ultrasonido es significativo y creciente, con potenciales dianas clínicas que van desde el cáncer hasta la enfermedad de Alzheimer. La cavitación - la formación y el movimiento posterior de burbujas dentro de un campo del ultrasonido - representa un fenómeno dominante que sostiene muchos de estos tratamientos. Sigue habiendo, sin embargo, la considerable incertidumbre con respecto a los mecanismos detallados de la acción por los cuales la cavitación promueve efectos terapéuticos y hay una necesidad de desarrollar las técnicas confiables de la supervisión que se puedan poner en práctica clínico. En particular, existe una variación significativa entre los estudios en los parámetros de exposición notificados como que han producido con éxito efectos terapéuticos y las emisiones acústicas correspondientes. El objetivo de este trabajo es proporcionar directrices de diseño y un protocolo experimental utilizando componentes ampliamente disponibles para realizar estudios de bioefectos mediados por cavitación, e incluir monitoreo acústico en tiempo real. Se espera que el protocolo permita una incorporación más generalizada de la monitorización acústica en los experimentos de ultrasonido terapéutico y facilite la comparación entre los estudios de las condiciones de exposición y su correlación con los efectos bioeseguros relevantes.

Introducción

La ecografía (US) ha sido ampliamente utilizada como técnica diagnóstica de imagen debido a su carácter seguro y no invasivo, su facilidad de implementación al lado de la cama de un paciente y su rentabilidad^1. Junto a sus capacidades de diagnóstico y monitoreo, EE.UU. tiene un potencial considerable para aplicaciones terapéuticas. Los primeros trabajos exploraron su uso en la trombólisis, la transfección del ADN y la administración de fármacos^2,3,4 y la us terapéutica ahora representa un área muy activa de investigación, con aplicaciones que incluyen el tratamiento tumoral^5,6,7,inmunoterapia^8,9,la interrupción de la barrera hematoencefálica (BBB)^10,11,12,la trombólisis^13,14,15y el tratamiento de infecciones^{bacterianas 16,17.} Un fenómeno clave que sustenta estas aplicaciones es la cavitación: la nucleación, el crecimiento y la oscilación de las cavidades gaseosas debido a cambios en la presión del fluido^18,19.

Hay una gama de mecanismos por los cuales la cavitación produce efectos biológicos. Por ejemplo, la naturaleza altamente no lineal de las oscilaciones de burbujas bajo la influencia de un campo estadounidense aplicado puede generar microfluyen en el líquido circundante que puede mejorar la convección de fármacos²⁰ y ejercer tensiones de cizallamiento en el tejido en las proximidades de las burbujas. Esto es particularmente frecuente cuando las burbujas están en las proximidades de un límite, haciendo que las burbujas oscilen no esféricamente, y potencialmente pueden promover la absorción de drogas a través de la permeabilización inducida por cizallamiento^21,22,23,24. A presiones más altas, se observan oscilaciones de mayor amplitud y rápido colapso de burbujas, impartiendo tensión mecánica directa²⁵ y generando con frecuencia ondas de choque, y consecuentes grandes gradientes de presión que pueden interrumpir y permeabilizar los tejidos^26,27. El colapso de burbujas cerca de una superficie también puede resultar en la formación de microjets líquidos de alta velocidad^28,29,30. Estos microjets pueden penetrar en el tejido, creando potencialmente poros o induciendo ondas de tensión secundarias^31,32. La permeabilización de las membranas biológicas tanto a nivel tisular como celular se conoce como sonoforesis, utilizada principalmente en el contexto de la mejora inducida por los Estados Unidos en la permeabilidad de la piel^33,34,y la sonoporación, utilizada principalmente para describir la permeabilización reversible de la membrana celular debido a la formación de poros de membrana^35,36.

La absorción viscosa en el líquido que rodea inmediatamente la burbuja oscilante puede producir un efecto de calentamiento sustancial³⁷. Además, las oscilaciones altamente no lineales producen radiación acústica a frecuencias más altas que el campo de conducción de EE. UU. Esto conduce a una mayor absorción en el tejido circundante y a un mayor calentamiento³⁸. El colapso de burbujas también puede ir acompañado de efectos químicos debido a las altas temperaturas y presiones transitorias en el núcleo de la burbuja, como la generación de especies altamente reactivas y la radiación electromagnética, conocida como sonoluminiscencia^32. Estos efectos han sido investigados para evaluar el daño potencial y/o la activación de las vías celulares relevantes para el parto³⁹ y explotados en la activación local de fármacos sensibles a la luz en un enfoque conocido como terapia sonodinámica^40,41,42,43.

Muchos bioefectos mediados por los Estados Unidos pueden iniciarse únicamente a través del control de los parámetros del campo estadounidense (amplitud de la presión, frecuencia, longitud del pulso y frecuencia de repetición, y duración de la exposición), pero la generación confiable de cavitación en el tejido biológico a menudo requiere altas energías de entrada y, por lo tanto, conlleva un riesgo elevado de daño. La introducción de núcleos de cavitación exógenos o artificiales puede reducir sustancialmente la energía de entrada necesaria para producir la amplia gama de efectos discutidos anteriormente e introduce además efectos adicionales que pueden no ser posibles solo con los Estados Unidos. Los núcleos de cavitación incluyen burbujas de gas^26,44,gotitas líquidas^45,46,47 y partículas sólidas^48,49,50,siendo los núcleos de cavitación a nanoescala un área emergente de investigación por sus beneficios en términos de tiempo de circulación prolongado, extravasación mejorada y actividad de cavitación prolongada^49,51,52,53.

Los núcleos más comúnmente utilizados son las microburbujas de gas (MB), utilizadas originalmente como agentes de contraste en imágenes de diagnóstico. Son típicamente 1-2 micrómetros de diámetro y contienen un núcleo de un gas de alto peso molecular con baja solubilidad acuosa en el medio circundante. El núcleo está rodeado por una capa protectora de lípidos, proteínas o polímeros que comúnmente consiste en fosfolípidos⁵⁴. Cuando se exponen a un campo estadounidense, la compresibilidad de los MB hace que sufran oscilaciones volumétricas, produciendo en consecuencia una fuerte dispersión acústica, que es responsable del éxito de los MB como agente de contraste. Como se mencionó, estas oscilaciones también conducen a los efectos mecánicos, térmicos y químicos antes mencionados que se pueden aprovechar en aplicaciones terapéuticas. El proceso de recubrimiento de MB también ofrece un mecanismo para encapsular fármacos dentro de la estructura de MB y para unir fármacos y/o especies objetivo a la superficie de MB. Esta técnica facilita la liberación desencadenada de fármacos para reducir la toxicidad sistémica⁵⁵. También se ha demostrado recientemente que el material de la superficie mb puede ser transferido a estructuras biológicas, mejorando la administración de drogas a través de la llamada "sonoimpresión"^56,57,58.

La supervisión de la actividad de cavitación mediada por los Estados Unidos puede proporcionar información sobre los efectos biológicos resultantes tanto in vitro como in vivo y potencialmente permite el ajuste y la optimización de estos efectos. Los dos métodos más ampliamente aplicados para monitorear la actividad de cavitación son i) óptico, que utiliza microscopía de video de ultra alta velocidad y generalmente no son factibles invivo; y ii) acústico, que registran los campos sonoros re-irradiados producidos por burbujas oscilantes y /o colapsantes. Tanto los componentes de amplitud como de frecuencia de la señal acústica contienen información sobre el comportamiento de las burbujas. Se ha demostrado que las bajas concentraciones de burbujas a bajas amplitudes incidentes en los Estados Unidos producen emisiones predominantemente armónicas (múltiplos enteros de la frecuencia de conducción)⁵⁹. A medida que aumentan las presiones de conducción, el espectro de emisión de burbujas también puede contener componentes fraccionarios conocidos como subharmonics y ultraharmonics⁶⁰ que indican un comportamiento no lineal más fuerte, así como ruido de banda ancha, que es indicativo de cavitación inercial. Los armónicos enteros son un indicador primario de la oscilación de burbujas, pero también pueden ser causados por no linealidades en cualquier parte de un sistema experimental, por ejemplo, debido a la propagación no lineal. Por el contrario, los armónicos fraccionarios y el ruido de banda ancha están muy fuertemente correlacionados con la dinámica de burbujas.

La relación entre el comportamiento de las burbujas y las emisiones acústicas detectadas puede complicarse por factores como el campo estadounidense incidente, el entorno de nucleación y las características de la vía de detección⁶⁰. Sin embargo, se puede obtener información importante sobre el comportamiento de las burbujas y sus interacciones con las células al discernir las tendencias en frecuencia y energía en el espectro acústico. Estos datos también pueden proporcionar información valiosa que se puede utilizar para formar la base de las técnicas de monitorización del tratamiento clínico. Para explotar plenamente esta información, se requiere el desarrollo de métodos experimentales robustos, traducibles y reproducibles.

Actualmente hay una variación sustancial en los protocolos reportados para diseñar sistemas y realizar estudios para apoyar el desarrollo de terapias asistidas por cavitación. En cuanto al aparato, se ha adoptado una serie de enfoques de diseño. Varios grupos han hecho uso de cámaras de placa paralela^56,61,62,63,ya sea construidas a medida o disponibles comercialmente (por ejemplo, OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et al. (2013) desarrollaron una cámara celular junto con un módulo de sonicación estadounidense e imágenes confocales en tiempo real⁶⁴, Carugo et al. (2015) utilizaron un sistema que comprende un plato de cultivo celular disponible comercialmente con una tapa PDMS hecha a medida para permitir la inmersión en un baño de agua durante la exposición estadounidense⁶⁵, y Pereno et al. (2018) utilizaron un dispositivo que consiste en resonadores acoustofluídicos en capas que permiten la caracterización óptica y acústica simultánea de la dinámica de burbujas y las interacciones burbuja-célula⁶⁶. El uso de diseños fabricados a medida y específicos de la aplicación complica la caracterización del campo estadounidense y otras condiciones de exposición ambiental, lo que hace que las comparaciones de estudios cruzados sean difíciles. Por ejemplo, hay una variación considerable en los parámetros estadounidenses identificados para lograr una sonoporación exitosa, que incluyen frecuencias centrales que van de 0,02 a 15 MHz, ciclos de trabajo que varían del 1% a la onda continua, y presiones de fabricación raras que van de 0,1 a 20 MPa^{23,64,67,68,69,70} (Tabla 1). Hay una variación igualmente considerable en los componentes espectrales (armónicos, sub-armónicos, etc.) que se han identificado como asociados con bioefectos particulares.

El objetivo de este trabajo, por lo tanto, es proporcionar un marco de diseño e implementación de sistemas fácilmente reproducible para el estudio in vitro de bioefectos celulares inducidos por cavitación con la inclusión específica de una capacidad de monitoreo de cavitación.

Protocolo

1. Principios de diseño del sistema

NOTA: Esta sección presenta los principios de diseño utilizados para crear sistemas para la exposición de EE. UU. y la supervisión de cavitación. Estos principios se ilustran con dos sistemas existentes para la transfección acústica (SAT) (que se muestran en la Figura 1). Cada sistema consta de un compartimiento de exposición celular, una fuente estadounidense y un transductor de un solo elemento que funciona como un detector de cavitación pasiva (PCD), todos los cuales están integrados en una cámara de prueba de sobremesa. Estos diseños se basan en el desarrollo previo del sistema descrito en Carugo et al. (2015)⁶⁵.

1. Maximice la facilidad de uso.
   1. Hacer que el compartimiento de exposición celular sea compatible con las técnicas de cultivo y los sistemas de imágenes existentes utilizando los dispositivos comerciales de cultivo celular existentes como sustratos de siembra / crecimiento.
      1. Para SAT2, utilice un plato de cultivo (35 mm de diámetro, de los cuales un área de 21 mm de diámetro es observable, ver Tabla de Materiales).
      2. Para SAT3, utilice un inserto Transwell (6,5 mm de diámetro, consulte Tabla de materiales). Los Transwells tienen una membrana permeable y por lo tanto necesitan ser colocados en medios celulares en lugar de agua.
2. Permita la carga rápida y el sellado del compartimiento de exposición celular.
   1. Forme el compartimiento de exposición de células SAT2 presionando la colocación de una tapa de polímero flexible sobre el plato de cultivo (Carugo et al. 2015⁶⁵). Como se ve en la Figura 1C,la tapa tiene un par de orificios de 1,2 mm de diámetro que permiten llenar el compartimento con una jeringa de aguja roma de 18 G. Después del llenado, selle estos puertos de llenado con varillas de plástico cortas(Tabla de Materiales).
   2. Llene el compartimento SAT3 con una jeringa o pipeta y selle presionando un tapón/tapón de goma.
   3. Permita la carga rápida del compartimiento de exposición de celda sellada en la cámara de prueba. Los soportes para los compartimentos de exposición celular se integraron en las tapas de la cámara, donde un ajuste de prensa ligero es suficiente para garantizar una alineación adecuada. Con los sistemas que se muestran en la Figura 1,el tiempo para los cambios de muestra puede ser tan corto como 20 segundos cuando se han preparado múltiples compartimentos de exposición celular de antemano.
   4. Minimice el volumen interno de la cámara para que el sistema sea portátil y se pueda minimizar la cantidad de agua /medio requerido. Al hacerlo, también se acelera la recuperación de derrames accidentales o fugas de agentes de cavitación fuera del compartimiento de exposición celular.
      NOTA: El volumen interno sat2 es aproximadamente 0,8 L. El volumen interno sat3 es de aproximadamente 7,6 L – hecho más grande para adaptarse a la fácil carga y el cambio de la fuente de transductor o su configuración. Se añadió una cámara interna de 0,3 L para minimizar el volumen desechable y permitir el uso de fluidos biológicamente relevantes distintos del agua de llenado del tanque (por ejemplo, medios de cultivo celular). El fondo de la cámara interna está hecho de lámina de mylar de 30 μm de espesor para permitir la máxima transmisión acústica.
   5. Haga que la cámara y los componentes internos estén fuera de materiales ópticamente claros cuando sea posible, para que cualquier problema (por ejemplo, fugas, macroburbujas atrapadas) pueda observarse y remediarse rápidamente.
3. Maximizar la transmisibilidad acústica del compartimento de exposición.
   1. Maximice la transmisibilidad a través de las opciones de materiales y espesores de la pared del compartimento. Bajo el supuesto de que los líquidos a cada lado de una pared son esencialmente los mismos (por ejemplo, agua), la magnitud del coeficiente de transmisión de presión de incidencia normal⁷¹ es:
      , donde λ es la longitud de onda en la pared de espesor L, , y z _L y z_o son las impedancias características (productos de densidad y velocidad del sonido) para el material de la pared y el líquido, respectivamente. T = 1 indica una transmisión perfecta.
   2. Para el monitoreo de amplio espectro de cavitación (por ejemplo, 1-8 MHz), la mayoría de los polímeros de laboratorio (por ejemplo, PDMS, PTFE, poliestireno) alterarán la presión transmitida en no más del 10% si el espesor del material es inferior a 1/10^de una longitud de onda en el material. Esta condición puede ser difícil de cumplir con los suministros estándar a altas frecuencias (por ejemplo, #1,5 cubrebocas a 8 MHz), por lo que es una buena práctica predecir o calibrar directamente la respuesta de frecuencia de transmisión.
   3. Para la transmisión en banda estrecha de la señal de origen de EE. UU. en el compartimiento de exposición de la célula, permita una capa más gruesa si es aproximadamente un múltiplo entero de media longitud de onda en el material de la capa. Por ejemplo, la tapa pdms en SAT2 se utiliza a un espesor de 2,0 mm (~ 2 longitud de onda a 1 MHz, c_PDMS ~ 1000 m / s).
4. Maximice la región de exposición mediante la selección de la fuente y el entorno celular.
   1. Para maximizar el número de células expuestas, haga que el área de fijación celular sea lo más amplia posible mientras se mantiene la compatibilidad con el equipo de cultivo e imágenes disponible.
   2. Utilice una fuente de EE. UU. con un campo que abarque el área de conexión de celda con una variabilidad espacial mínima mediante la región prefocal de una fuente enfocada grande (SAT2) o una fuente enfocada o con lentes con un ancho de lóbulo principal que coincida con el diámetro del área de conexión de celda (SAT3). Consulte la Tabla de materiales para obtener fuentes específicas.
   3. Minimice la complejidad del campo introducida por el soporte del compartimiento de la célula apoyando mecánicamente el compartimiento de la célula bien lejos de la parte más fuerte del campo incidente, minimizando la sección transversal de dispersión del soporte o colocando el material absorbente en el soporte. Los ejemplos se muestran en la Figura 1A y 1D.
5. Garantizar condiciones de exposición repetibles.
   1. Termine el campo acústico en un límite fijo para eliminar la variabilidad que puede surgir de las interfaces aire-agua en cámaras parcialmente llenas. En SAT2 y 3, esto se logra mediante la instalación de un absorbedor acústico (ver Tabla de Materiales)en la tapa de la cámara con un beneficio adicional de reducir la complejidad del campo que puede surgir de las reflexiones de límite.
   2. Monitoree y registre el voltaje de la unidad de origen en la salida/entrada de la fuente del amplificador para que se pueda detectar rápidamente una variabilidad menor o un mal funcionamiento importante. Utilice una sonda de voltaje u otro dispositivo que sea seguro de usar en el rango de voltaje de la unidad de interés. Compruebe periódicamente la calibración de la sonda de voltaje utilizando una fuente bien conocida, como un generador de forma de onda.
   3. Controle, monitoree y registre la temperatura de la cámara y su contenido. Las respuestas de las células, transductores y medios de propagación pueden ser sensibles a la temperatura. En SAT2, el monitoreo y el control se realizan con un par de puertos de circulación conectados a un sistema de acondicionamiento de agua, mientras que SAT3 emplea un calentador de acuario (no se muestra). Establezca la temperatura del agua según sea necesario para imitar las condiciones fisiológicas relevantes para la aplicación terapéutica.
      NOTA: Las temperaturas internas pueden cambiar tanto como resultado de factores externos como del calentamiento generado por los Estados Unidos del transductor y el medio.
   4. Desgasifique cuidadosamente el(los) líquido(s) de la cámara para minimizar la probabilidad de cavitación no intencionada y/o dispersión de burbujas preexistentes en el trayecto de propagación.
      NOTA: si no se lleva a cabo la desgasificación, por ejemplo, debido al impacto negativo en las células, entonces habrá un nivel de fondo mejorado de actividad de burbujas, para lo cual será adecuado.
6. Calibrar el sistema completamente montado.
   1. Incluya un medio para medir el incidente del campo de presión sobre las células expuestas cuando todos los componentes del sistema estén en su lugar, incluido el compartimiento de exposición de la célula. En SAT2 y 3, esto se logra con una abertura en la tapa de la cámara a través de la cual se podría insertar una aguja o hidrófono de fibra óptica sin perturbar el campo a medir. Realice las mediciones lo más cerca posible de donde se encuentran las celdas.
   2. Elija un hidrófono con un radio sensible (un_rcv)es lo suficientemente pequeño como para que no informe erróneamente el campo de presión que se está midiendo. El tamaño aceptable es una función de la frecuencia de la fuente(f)y el radio_{(a src),}así como la distancia entre la fuente y el escaneo de campo(z_rcv). Un criterio general para la selección del tamaño del hidrófono es: , que conduce a: , donde c es la velocidad del sonido⁷².
   3. Asegúrese de que el hidrófono esté calibrado en las condiciones utilizadas en la caracterización del sistema, incluida la temperatura especificada en el punto 1.6. Específicamente, si el hidrófono se mantiene en un ángulo con respecto al plano de escaneo, el hidrófono debe calibrarse en ese ángulo, ya que los efectos de directividad pueden diferir significativamente de los esperados basados puramente en la geometría. El cambio en la sensibilidad del hidrófono con respecto a la temperatura debe estar disponible en el fabricante.
   4. Escanee toda la región en la que las células pueden estar expuestas. Para capturar un nivel adecuado de detalle de campo, utilice un espaciado de escaneo no más grueso que 1/5 de una longitud de onda a la frecuencia más alta de interés. Si se observa una complejidad de campo inesperada, considere la posibilidad de utilizar señales de ráfaga corta (por ejemplo, 1-3 ciclos) para permitir la identificación y cuantificación de contribuciones de campo directas y dispersas.
7. Incorpore una capacidad de monitoreo de cavitación.
   1. Determine el tipo de transductor de monitoreo y la colocación como parte del diseño del sistema general, en lugar de como una adaptación. En la práctica, esto conduce a un sistema que es lo más compacto posible sin sacrificar la capacidad de alinear de forma fiable los componentes críticos del sistema.
   2. Coloque un dispositivo de monitoreo de cavitación en el sistema de tal manera que se pueda colocar de forma repetitiva con un tiempo de configuración adicional mínimo o una perturbación del flujo de trabajo. En SAT2, esto se logra con un transductor piezoeléctrico de un solo elemento que actúa como un PCD instalado en la tapa de la cámara, mientras que SAT3 integra el PCD en la base de la fuente utilizando un reflector de 90 °.
   3. Seleccione la forma de PCD de acuerdo con los objetivos de los experimentos. En la Figura 2,los cálculos de los contornos de media amplitud de los dispositivos no enfocados (izquierda) y enfocados (derecha) muestran las profundas diferencias en la sensibilidad espacial con respecto a la frecuencia. El dispositivo desenfocado es más adecuado para el monitoreo de gran volumen con una variación espacial modesta con respecto a la frecuencia, mientras que el dispositivo enfocado es más adecuado para mediciones más compactas radialmente en las frecuencias de interés.
   4. Seleccione la frecuencia central y el ancho de banda de PCD para que se ajusten a las necesidades del experimento. La frecuencia central se elige típicamente para ser por lo menos cinco veces la de la fuente de los E.E.U.U. para minimizar sensibilidad a las emisiones directas de la fuente. El ancho de banda se maximiza típicamente para observar una amplia gama de comportamientos de burbujas (ruido armónico y de banda ancha).
   5. Seleccione los métodos de acondicionamiento, registro y procesamiento para permitir el análisis de los datos de cavitación, como se describe en la siguiente sección.

2. Instrumentación y procesamiento para el monitoreo de cavitación

NOTA: Esta sección presenta los componentes y funciones de flujo de señal recomendados para la recopilación de datos de monitoreo de cavitación, y el procesamiento de datos que conduce a evaluaciones cualitativas y cuantitativas de la actividad de cavitación.

1. Instrumentación (Véase también la Figura 3).
   1. A menos que la aplicación requiera un dispositivo personalizado, seleccione un PCD de la amplia gama de transductores de un solo elemento disponibles comercialmente, normalmente comercializados para pruebas no destructivas de objetivos sumergidos. Estos proveedores también tienen cableado y accesorios (por ejemplo, el reflector de espejo en SAT3).
   2. Minimice la respuesta pcd a la fuente de los E.E.U.U. Esto se puede hacer tanto a través de la selección de la PCD (frecuencia central y ancho de banda) y mediante el uso de una muesca o filtro de paso alto. Este último es implementable como un módulo independiente o como parte de un dispositivo de acondicionamiento de señal.
   3. Utilice un digitalizador con un rango dinámico grande (al menos 12 bits) para capturar la mayor cantidad de datos posible con una probabilidad mínima de recorte de señal alta y una relación señal/ruido (SNR) máxima de las señales más pequeñas. Al comparar dispositivos, revise las especificaciones de señal a ruido y distorsión y/o el número efectivo de bits, ya que se trata de descripciones más completas del rango dinámico alcanzable. Considere también si el tamaño del búfer de memoria es suficiente para la longitud y la velocidad de captura de datos deseadas.
   4. Optimizar el uso del rango dinámico del digitalizador. Las señales PCD pueden cubrir varios órdenes de magnitud, tanto debido a una larga exposición (a medida que se eliminan las burbujas) como si se ejecutan experimentos a diferentes niveles de unidad de EE. UU. Por lo tanto, es necesario comprobar que la cadena de acondicionamiento de señales escala todas las señales para que puedan registrarse correctamente.
   5. Incluya un preamplificador en la cadena de señales, para que las señales esperadas más pequeñas puedan ser capturadas adecuadamente. En nuestra experiencia, el auto-ruido pcd está muy por debajo del de la mayoría de los digitalizadores, por lo que un grado modesto de preamplificación (por ejemplo, <100x) todavía puede mejorar la SNR del resultado final.
   6. Filtre la frecuencia de la fuente estadounidense antes de la preamplificación para evitar saturar el amplificador.
   7. Si se utiliza un pulsador/receptor estadounidense para proporcionar capacidades de ganancia y/o filtrado, utilícel en modo de pulsador para confirmar la longitud/alineación del trayecto o comprobar si hay dispersores inesperados en el trayecto de propagación entre la PCD y el compartimento de exposición celular.
   8. Habilitar la transmisión de datos en tiempo real al almacenamiento. Los sistemas SAT2 y SAT3 emplean osciloscopios USB de transmisión de 12 bits (consulte la Tabla de materiales),que tienen las comodidades de la portabilidad y las interfaces de usuario bien construidas.
   9. Confirme la coincidencia de impedancia adecuada en la cadena de señal para evitar errores de ganancia o ancho de banda. Los dispositivos PCD típicamente tienen impedancias de salida cercanas a 50 ohmios, por lo que un proceso adecuado es reemplazar el PCD con una señal conocida de un generador de forma de onda (con impedancia de salida de 50 ohmios) y confirmar que el tamaño de la señal que aparece en el digitalizador coincide con las expectativas, escala linealmente cuando se cambia la señal inyectada y no se observa ningún recorte para la señal de interés más grande.
2. Preprocesamiento
   1. Corrija las señales de voltaje sin procesar para todas las ganancias y sensibilidades conocidas en el trayecto de la señal que se relacionan con el procesamiento de datos en la gama de frecuencias de interés.
   2. Si los datos se registraron con el acoplamiento de entrada de CC o de lo contrario muestran un desplazamiento de CC, elimine este desplazamiento por resta directa o con un filtro de paso alto.
3. Calcule el espectro de potencia P de cada señal grabada.
   1. Establezca la longitud de la transformada de Fourier N_ft para que la frecuencia fundamental de la fuente estadounidense f₀ sea un múltiplo entero grande del ancho del bin de transformación: N_ft =   nf_s/f₀, donde n es un entero y f_s es la frecuencia de muestra de los datos digitalizados. Establezca n ≥ 50 para una captura clara de las entidades espectrales. Para el ejemplo de un fundamental de 1 MHz muestreado a 50 MHz, N_ft es 2500 y el ancho de bin es 0.02 MHz.
   2. Como la longitud de transformación N_ft suele ser menor que la duración de la señal grabada, utilice un estimador de densidad espectral de potencia(PSD)como el método⁷³de Welch. La potencia en una banda de frecuencias que abarca f₁-f₂ es , donde dF es el ancho del bin de transformación.
   3. Para caracterizar la actividad de la burbuja durante cada exposición, estime las contribuciones al espectro de potencia a partir de múltiplos enteros de f₀ (armónicos), múltiplos enteros impares de f₀/2 (ultraarmónicos) y ruido de banda ancha (cavitación inercial).
   4. El contenido armónico y ultraarmónico se estima más simplemente seleccionando los valores del espectro de potencia a frecuencias específicas. Sin embargo, las respuestas tonales de gran amplitud pueden extenderse a un pequeño número de bins de frecuencia contiguos (por ejemplo, f0 ± 2-3), por lo que deben incluirse en los cálculos de potencia de banda estrecha y excluirse de los cálculos de banda ancha.
   5. Estimar la potencia de cavitación de banda ancha restando las contribuciones armónicas y ultraarmónicas del espectro de potencia total. Alternativamente, estas contribuciones pueden estimarse utilizando un preprocesamiento más sofisticado⁷⁴.
   6. Estimar la energía acumulada de la señal de cavitación a lo largo de la duración de la exposición, preferiblemente de acuerdo con la característica del espectro / tipo de actividad de burbuja.
   7. Suponiendo que todos los registros de datos tuvieran la misma duración T_r, la energía acumulada en los datos registrados es , donde M indica el número de registros.
   8. Si hay huecos entre los registros, como puede ocurrir cuando la exposición es continua, y los archivos guardados capturan una fracción de la duración total de la exposición T_e, la energía acumulada puede estimarse como
   9. Estimar la SNR de medición comparando los niveles de espectro con los de ruido de fondo registrados en ausencia de US.

3. Protocolo Experimental

1. Preparación del SAT
   1. Minimice la probabilidad de cavitación en el trayecto de propagación desgastando el líquido de llenado (normalmente agua filtrada) bajo una presión de -10⁵ Pa durante al menos dos horas. Se recomienda la confirmación con una sonda de oxígeno disuelto de que la presión parcial de oxígeno está por debajo de 10 kPa.
   2. Llene la cámara de prueba lentamente para minimizar la reintroducción de aire en el líquido desgastado. Continúe desgasificación de la cámara llena si es necesario.
   3. Elimine todas las burbujas residuales de las superficies del transductor y del contenedor de medios inmediatamente después del llenado y de nuevo justo antes de iniciar los experimentos de exposición.
   4. Asegúrese de que la temperatura de la cámara y su contenido se hayan estabilizado antes de que se ingban los experimentos de exposición.
   5. Permita que el amplificador de potencia de la fuente de EE. UU. se caliente (según la recomendación del fabricante) para que la ganancia y la salida sean estables con respecto al tiempo.
2. Preparación del compartimento de exposición
   1. Suspensión del agente de cavitación
      1. Al diluir el agente de cavitación, revuelva suave y continuamente para hacer una suspensión uniforme sin atrapar macroburbujas o destruir el agente (especialmente si son burbujas descascaradas).
      2. Cuando trabaje con MB, retire y dispense lentamente utilizando la aguja de calibre más grande disponible para minimizar la destrucción durante el proceso de carga⁷⁵. Una aguja de relleno romo de 18 G se ha utilizado regularmente con los sistemas SAT.
3. Preparación del SAT2
   1. Esterilice la tapa de PDMS antes de su uso en experimentos con células vivas.
   2. Forme el compartimiento de exposición celular presionando el ajuste de la tapa de PDMS al plato de cultivo.
   3. Prepare una jeringa con una aguja roma de 18 G y llénese con aproximadamente 10 ml de líquido (por ejemplo, suspensión de MB o control de agua).
   4. Inserte la aguja a través de uno de los orificios de relleno de PDMS y llene lentamente la cámara, inclinándose para que las macroburbujas puedan escapar a través del orificio de relleno abierto. Para obtener los mejores resultados, incline la cámara para que el agujero abierto esté por encima del orificio de relleno.
   5. Cuando esté lleno, cierre el orificio abierto insertando una varilla de polímero corta (4-5 mm). Aboca el conjunto para que ambos taladros sean horizontales.
   6. Retire la aguja de llenado contundente mientras inyecta líquido adicional para que no se extraiga aire. Cierre el agujero con otra varilla de polímero. Este proceso completa el sellado del compartimiento de exposición celular.
   7. Compruebe visualmente el compartimento en busca de evidencia de macroburbujas atrapadas y, si se encuentra alguna, repita 3.3.3.-3.3.6.
   8. Pulse ajustar el compartimiento de exposición celular en el soporte del compartimiento. Instale la tapa de la cámara en su lugar encima de la cámara. Bajar la tapa con un ángulo a horizontal desalienta las macroburbujas de descansar sobre las partes sumergidas (absorbedor, soporte).
   9. Considere la flotabilidad de las partículas en suspensión al decidir la orientación del compartimiento de exposición celular (por ejemplo, burbujas flotantes o nanopartículas que se hunden) y cómo esto afectará su contacto con las células.
   10. En todas las operaciones, utilice la menor fuerza posible para minimizar la flexión de la superficie de crecimiento celular y el desprendimiento de células.
4. Preparación sat3
   1. Llene el Transwell con aproximadamente 150 μL de líquido (por ejemplo, suspensión MB o control de agua).
   2. Forme el compartimiento de exposición celular sellando cuidadosamente el transwell con un tapón de goma, eliminando cualquier líquido de desbordamiento con una toalla de papel limpia o una toallita. Antes de su uso en experimentos con células vivas, esterilizar el tapón de goma.
   3. Compruebe visualmente el compartimento en busca de evidencia de macroburbujas atrapadas y, si se encuentra alguna, retire el tapón, retire las macroburbujas y repita la versión 4.4.2.
   4. Pulse ajustar el compartimiento de exposición celular en el soporte del compartimiento. Instale la tapa de la cámara en su lugar encima de la cámara. Bajar la tapa con un ángulo a horizontal desalienta las macroburbujas de descansar sobre las partes sumergidas (absorbedor, soporte).
      NOTA: Como se señaló anteriormente, las macroburbujas pueden causar una variedad de efectos no repetibles y potencialmente perjudiciales en los experimentos de exposición a los Estados Unidos. Lo más importante es que las macroburbujas atrapadas en el compartimiento de exposición celular pueden causar respuestas de PCD y bioefectos celulares locales que no son representativos del tratamiento previsto. Inspeccione siempre visualmente todos los componentes del sistema para encontrar y eliminar macroburbujas antes de iniciar experimentos estadounidenses.

4. Recopilación de datos

1. Establecer niveles de respuesta de PCD de fondo mediante la realización de experimentos iniciales con un compartimento de exposición celular lleno de líquido de control (por ejemplo, agua desgastada o medios celulares).
2. Registre los datos de PCD sin conducir a la fuente estadounidense para establecer niveles de ruido electrónico de fondo.
3. Registre los datos pcd mientras conduce la fuente de EE. UU. en toda la gama de niveles de unidad planificados. Estos datos indicarán qué partes de la respuesta acústica no están relacionadas con los agentes de cavitación que se probarán posteriormente.
   NOTA: Los líquidos de laboratorio comunes (por ejemplo, PBS o medios celulares) exhibirán cavitación a presiones moderadas (por ejemplo, 0,5 MPa a 0,5 MHz) si no se desgasan.
4. Antes de iniciar las mediciones, dé tiempo para que la suspensión se equilibre térmicamente con la temperatura de la cámara. Un termopar de aguja fina puede ser útil para este propósito.
5. Monitoree los experimentos en tiempo real tanto en el dominio del tiempo como en el de la frecuencia.
   1. La supervisión del dominio del tiempo del PCD revela si las señales tienen el tamaño adecuado para la configuración de instrumentación actual. Específicamente, se debe evitar el recorte de señal, ya que aparecerá en el dominio de la frecuencia como respuesta armónica multitonal.
   2. La supervisión del dominio del tiempo de la PCD también muestra si las señales de cavitación se observan antes de lo esperado en función del tiempo de propagación desde la fuente estadounidense hasta el compartimento de exposición a la PCD. Si se observan tales señales, esto puede indicar una fuga del agente de cavitación en la cámara de prueba.
   3. La monitorización del dominio de frecuencia del PCD indica el tipo de comportamiento de la burbuja y se puede utilizar para ajustar los niveles de accionamiento según sea necesario para lograr el estímulo celular deseado (por ejemplo, niveles de accionamiento más bajos para la excitación armónica).
6. Para asegurarse de que no se pierdan las primeras exposiciones, inicie el proceso de recopilación de datos antes de encender la señal de la unidad de origen de EE. UU.
7. Monitoree la señal de salida del amplificador que impulsa la fuente estadounidense (a diferencia de la salida del generador de forma de onda) durante todo el experimento para asegurarse de que la exposición está procediendo según lo esperado. Utilice una sonda de alto voltaje para esta medición y asegúrese de que el osciloscopio esté configurado para compensar la atenuación de la sonda.
8. Después de exponer una muestra, retírela cuidadosamente de la cámara de prueba.
   1. Retire y limpie la tapa pdms (SAT2)/tapón de goma (SAT3) en preparación para cualquier uso posterior.
   2. Transfiera el plato de cultivo (SAT2)/Transwell (SAT3) según sea necesario para el análisis posterior (por ejemplo, microscopía, imágenes de fluorescencia).
   3. Después de un pequeño número de exposiciones (por ejemplo, 3-5), es una buena práctica volver a adquirir señales de cavitación basal (en ausencia de agente de cavitación) y compararlas con el conjunto de datos original para asegurarse de que los medios de la cámara no se han contaminado.

Resultados

La Figura 4 muestra ejemplos de respuestas pcd del dominio del tiempo y la frecuencia, ilustrando tres comportamientos de cavitación distintos. Todos los datos fueron recolectados en SAT3 usando SonoVue MBs diluido 5x en PBS, con una concentración final de ~2*10⁷ MBs/ml. La temperatura para todos los ejemplos en esta sección fue de 19 ± 1 °C. La fuente estadounidense fue conducida con un pulso de 2,0 ms a 0,5 MHz para alcanzar presiones negativas de cresta incidente de 0,20(Figura 4A y 4B),0,30(Figura 4C y 4D),y 0,70 MPa(Figura 4E y 4F). Las grabaciones de la señal comenzaron el ms 1,4 antes del comienzo t = 0 del pulso de los E.E.U.U. Las trazas insertadas muestran la señal como grabada (rojo) y con un filtro de paso alto de 2 MHz (azul) para una ventana de tiempo centrada en el momento del vuelo desde la fuente hasta el compartimiento de exposición celular a PCD. La respuesta de bajo nivel antes de este tiempo se debe a la radiación recibida directamente de la fuente, que es común en configuraciones donde el PCD está detrás de la fuente de EE. UU.

A la presión incidente más baja, la respuesta PCD consiste enteramente en armónicos enteros de la frecuencia fundamental estadounidense de 0,5 MHz. El aumento de 0,20 a 0,30 MPa da como resultado ultraarmónicos pronunciados en el espectro, además de armónicos enteros más elevados. Las formas de onda del dominio del tiempo en estas dos presiones parecen similares, aunque los resultados de 0,30 MPa muestran más variabilidad a lo largo de la duración del pulso. A la presión más alta, la amplitud de la forma de onda del dominio del tiempo ha crecido de forma no lineal en relación con las presiones más bajas como resultado del ruido de banda ancha claramente elevado visible en el espectro. Este ruido se considera comúnmente como resultado de la cavitación inercial y, en este ejemplo, corresponde a la destrucción de los MB.

Para ver esto más claramente, las respuestas de PCD en función del tiempo se muestran en la Figura 5. En el panel izquierdo(Figura 5A),los espectros completos se muestran durante un tiempo de exposición de 50 segundos, durante el cual la fuente emite pulsos de 2,0 ms cada 0,20 segundos. Las potencias totales, armónicas y de banda ancha correspondientes se muestran en el panel derecho (Figura 5B). Los E.E.U.U. fueron encendidos en t =3 .0 s, en cuyo momento las respuestas de banda ancha de la grande-amplitud fueron consideradas. Se cree que el pico inicial corresponde a la destrucción de las burbujas más grandes de la suspensión (SonoVue es polidisperse) y es una observación común en experimentos de cavitación con burbujas descascaradas e incluso con medios no desgasados (por ejemplo, PBS).

Después de unos segundos, la respuesta de banda ancha disminuyó rápidamente, aparentemente debido a la destrucción de la burbuja, y la señal se compone predominantemente de armónicos. Esto sugiere que el gas liberado y los MB restantes están vibrando de forma estable y no inercial. En t ~ 50s, el componente de banda ancha ha caído al nivel del ruido de fondo original. Por lo tanto, las pruebas de exposición como esta son importantes cuando se trata de comprender las escalas de tiempo durante las cuales diferentes efectos de burbujas pueden estar actuando sobre las células de la cámara.

Es probable que las burbujas se traduzcan en respuesta a las fuerzas de radiación generadas durante la exposición a los Estados Unidos y el movimiento de los MB dentro y fuera del campo de visión de pcd puede conducir a una mayor variabilidad en la señal de cavitación monitoreada, especialmente cuando se trata de suspensiones diluidas. Por lo tanto, la región sensible de la PCD debe abarcar la mayor parte posible de la superficie de exposición celular. Una comparación de las respuestas enfocadas y desenfocadas pcds con frecuencias centrales idénticas (ver Figura 2)se muestra en la Figura 6,utilizando una dilución 20:1 de MBs en PBS normal es SAT2. El tiempo y los espectros promediados por la muestra en el panel Figura 6A muestran que el PCD desenfocado contiene una respuesta de banda ancha más fuerte, acompañada de una variabilidad reducida de muestra a muestra tanto en potencias armónicas (Figura 6B) como ultraarmónicas (Figura 6C).

Es importante reconocer que los medios usados para el trabajo in vitro de la célula no se desgastan y pueden presentar un nivel de fondo aumentado de actividad de la burbuja. La Figura 7 muestra la respuesta en SAT2 del PBS utilizado en su forma proporcionada por el proveedor y después de dos horas de desgasificación al vacío, después de lo cual la saturación del aire se redujo del 92% al 46% según lo determinado con un sensor óptico (PreSens, Alemania). Los espectros de la Figura 7A se promediaron a lo largo del tiempo de exposición y las repeticiones con cinco muestras independientes, y muestran claramente que muestran ultraarmoníacos claramente elevados en PBS normal. Las potencias sumadas en tres armónicos(Figura 7B)están bien dentro de la desviación estándar de cada salida experimental. Por el contrario, las sumas ultraarmónicas de la Figura 7C muestran que el PBS normal tiene un nivel casi un orden de magnitud más alto y una variabilidad sustancialmente mayor entre las muestras. Estos ejemplos indican que un medio común compatible con células puede exhibir comportamientos que podrían atribuirse (incorrectamente) a la presencia de MB. Puesto que es generalmente poco práctico desgasificar el medio de cultivo debido al impacto negativo sobre las células y/o la estabilidad del agente de cavitación, es crítico realizar controles adecuados en cualquier estudio relacionado con la cavitación.

Figura 1: Ilustraciones de dos diseños de sistemas de exposición estadounidenses que incorporan monitoreo de cavitación: SAT3 (D-F). (A)Conjunto anotado SAT2 con pared lateral removida para mayor claridad. (B) SAT2 con pared lateral intacta. (C) Compartimiento de exposición a celdas SAT2, desmontado. (D) Sat3 montaje anotado. (E) SAT3 en configuraciones normales (izquierda) y con lentes (derecha) para la coincidencia de ancho de haz a diferentes frecuencias. (F)Compartimento de exposición a células SAT3, desmontado. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2: Cálculos de contornos de campo de presión de media amplitud para transductores desenfocados (izquierda) y enfocados esféricamente (derecha) de 12,7 mm de diámetro. Las frecuencias de 2, 4 y 8 MHz se muestran como contornos rojo, azul y verde, respectivamente, para un elemento PCD en el origen de coordenadas (0,0). Los contornos más exteriores del dispositivo desenfocado son relativamente insensibles a la frecuencia, pero la estructura interior depende de la frecuencia. El campo enfocado esféricamente se contrae a medida que aumenta la frecuencia, pero dentro de los contornos, los campos varían suavemente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3: Instrumentación para el acondicionamiento y registro de señales de cavitación (flechas azules), excitación de la fuente estadounidense (líneas rojas) y activación de la adquisición de datos. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 4: Respuestas pcd de dominio de tiempo (izquierda) y frecuencia (derecha) registradas con MB diluidas 5x en PBS. Las presiones negativas máximas incidentes fueron (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, todas a 0,5 MHz. Las grabaciones de señales comienzan 1,4 ms antes del inicio t=0 del pulso de ultrasonido de duración de 2,0 ms. (A, C, E) Las señales del dominio del tiempo (rojo) se muestran en una escala vertical fija, que indica cómo cambia el nivel de respuesta con la presión incidente. Las trazas insertadas muestran la señal como grabada (rojo) y con un filtro de paso alto de 2 MHz (azul) para una ventana de tiempo centrada en el momento del vuelo desde la fuente hasta el compartimiento de exposición celular a PCD. (B, D, F) Las densidades espectrales de ruido y potencia de la señal se calculan para t<0 y t>0, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5: Historiales del espectro durante una exposición de 50 segundos de una suspensión de MB diluida 5 veces en PBS. (A) Espectros completos y (B) potencias totales, armónicas y de señal de banda ancha, todo en función del tiempo. Las condiciones de accionamiento fueron de 0,5 MHz, 0,7 MPa de presión negativa de pico, 2,0 ms de duración del impulso, 200 ms de período de repetición de impulsos. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6: Efecto de la geometría de enfoque PCD registrada con una dilución 20:1 de microburbujas en PBS normal. Las condiciones de accionamiento fueron: 1,0 MHz, 0,50 MPa de presión negativa de pico, 3,0 ms de duración del pulso, 10 ms de período de repetición de impulsos. (A) Espectros completos promediados durante el tiempo de exposición y tres repeticiones de muestra independientes. (B)Potencia en armónicos de 3, 4 y 5 MHz, y(C)potencia en ultraarmoníacos de 2,5, 3,5 y 4,5 MHz. Las líneas gruesas son medias de muestra, las áreas sombreadas indican +/- 1 desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 7: Efecto de los medios desgasteados grabados con PBS. (A) Espectros completos promediados a lo largo del tiempo de exposición y cinco repeticiones de muestra independientes. (B)Potencia en armónicos de 3, 4 y 5 MHz, y(C)potencia en ultraarmoníacos de 2,5, 3,5 y 4,5 MHz. Las líneas gruesas son medias de muestra, las áreas sombreadas indican +/- 1 desviación estándar. Las condiciones de accionamiento fueron 1,0 MHz, presión negativa de pico de 0,50 MPa, duración del pulso de 1,0 ms, período de repetición de pulsos de 200 ms. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

parámetro	unidad	mínimo	máximo
frecuencia	MHz	0.02	15
presión (pico negativo)	Mpa	0.1	20
longitud del pulso	Ciclos	1	Cw
ciclo de trabajo	%	1	Cw
tiempo de exposición	S	10	1000

Tabla 1: Resumen de la gama de parámetros notificados que facilitan la sonoporación in vitro.

Discusión

Los pasos críticos para cualquier medición acústica fueron encapsulados por Apfel en 1981⁷⁶ como "conoce tu líquido, conoce tu campo sonoro, sabe cuándo sucede algo". En el contexto de este protocolo, estos abarcan la calibración y alineación del transductor y los pasos de preparación de agua y manejo de burbujas. En primer lugar, es esencial que el hidrófono utilizado para calibrar el transductor de conducción y/o el PCD se calibre con precisión mediante el mantenimiento externo regular o la comparación interna con una norma de referencia. Del mismo modo, la respuesta tanto del transductor de conducción como de la PCD debe caracterizarse regularmente para comprobar si hay algún cambio en la salida y/o pérdida de sensibilidad. Si se desconocen las condiciones de conducción y la sensibilidad de recepción del sistema, entonces será imposible inferir ninguna relación significativa entre las condiciones de exposición, los bioefectos y las emisiones acústicas. Directamente relacionado con esto, la alineación de los transductores entre sí y la cámara de muestra debe verificarse cuidadosamente para garantizar que las condiciones de exposición dentro de la cámara son las esperadas y que el volumen de muestreo para el PCD corresponde a la región de interés. Como se ha indicado, la temperatura y el contenido de gas del medio suspendiendo pueden afectar significativamente a los resultados finales y la consistencia es extremadamente importante a este respecto^77,78. Del mismo modo, la preparación, caracterización y manipulación de la suspensión del agente de cavitación requieren una atención muy estrecha para garantizar que la distribución del tamaño esperado y la concentración de partículas esté presente dentro de la muestra. Por ejemplo, si la concentración de burbujas es demasiado alta, habrá un blindaje efectivo del volumen de la muestra del campo estadounidense incidente. Los agentes MB son particularmente susceptibles a la destrucción y coalescencia y se puede encontrar más orientación sobre su manejo en Mulvana et al. al. (2012)⁷⁹.

Un problema muy común con la detección de señales de cavitación es lograr una SNR adecuada. Esto se debe en parte a la naturaleza de la señal en sí, como se describe, pero también puede deberse a fuentes de ruido eléctrico dentro de la configuración experimental. La comprobación de las conexiones entre los componentes del sistema, en particular las que implican cables coaxiales, puede ayudar a eliminar algunos de ellos. Puede ser necesario reemplazar o reparar los cables coaxiales. Identificar y retirar o desactivar otros equipos en el laboratorio, como bombas que pueden causar ruido eléctrico, también puede ayudar. La mala coincidencia de impedancia eléctrica entre los componentes del sistema puede ser otra causa de la mala relación señal/ruido y también potencialmente de daños en el equipo, y debe verificarse cuidadosamente. Los ajustes de activación en el generador de señales y el osciloscopio deben comprobarse de forma similar para confirmar que están configurados adecuadamente para el experimento y no han vuelto a la configuración predeterminada del fabricante. Si hay una destrucción significativa de las burbujas durante la manipulación, en el caso del SAT2, puede ser útil conectar una segunda jeringa al puerto de salida y usarla para extraer suavemente el líquido de la cámara, dibujando así la suspensión. Esto también puede ayudar a eliminar las macroburbujas o habilitar el flujo durante la exposición a los EE. UU., Si se desea.

No es posible eliminar completamente las reflexiones acústicas dentro de la cámara de muestras y, por lo tanto, el campo incidente no será completamente uniforme en todo el volumen de la muestra. Como se menciona en los pasos 1.3.2 y 1.3.3, la transmisibilidad de las ventanas acústicas dependerá de la frecuencia y, por lo tanto, la anchura de banda deseada para las mediciones de emisiones acústicas debe considerarse cuidadosamente. En particular, puede haber reflexiones múltiples significativas de componentes de frecuencia más alta. Esta es otra razón por la que la calibración del campo dentro del sistema completamente ensamblado es tan importante para minimizar la incertidumbre en la presión incidente. También debe considerarse la posibilidad de utilizar adecuadamente las señales grabadas para reducir al mínimo los efectos de múltiples reflexiones. El uso de dispositivos comerciales por comodidad y la necesidad de transparencia acústica significa que se debe sacrificar cierta transparencia óptica. Esto puede afectar la calidad de las imágenes posteriores, por ejemplo, para evaluar la viabilidad celular o la absorción de fármacos. Algunas de las membranas utilizadas en dispositivos comerciales también son porosas y, por lo tanto, se produce un aislamiento imperfecto entre la cámara de muestra y el baño de agua circundante. Como se indicó anteriormente, el riesgo correspondiente de contaminación puede mitigarse mediante el uso de una subcámara más pequeña, cuyo contenido puede reemplazarse regularmente. Los dispositivos de cultivo celular indicados en la Tabla de Materiales son adecuados principalmente para monocapas celulares que pueden no ser representativas de los tejidos en términos de todos los bioefectos mediados por us/cavitación. La proximidad de las células a una superficie sólida también afectará a la dinámica de MB de una manera que puede no reflejar las condiciones in vivo, por ejemplo, promover la microstreaming y el microjetting como se describe en la introducción. Estas limitaciones se pueden abordar, sin embargo, a través de una simple sustitución de modelos de tejido alternativos.

El objetivo al proponer los SATs es proporcionar un medio para mejorar la reproducibilidad de las condiciones de exposición acústica y las emisiones acústicas entre los estudios de bioefectos mediados por los Estados Unidos, con lo que se espera que facilite una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de técnicas de monitoreo del tratamiento para mejorar la seguridad y la eficacia. Los sistemas están diseñados para ser compatibles con los dispositivos de cultivo celular disponibles en el comercio, lo que permite realizar una amplia gama de ensayos biológicos de acuerdo con la aplicación de interés y permite la realización de experimentos de alto rendimiento, eliminando la necesidad de procedimientos de alineación que consumen mucho tiempo entre las corridas. Mediante la estandarización de protocolos para la caracterización de las condiciones de exposición y la captura de emisiones acústicas, se espera que se pueda reducir la variabilidad dependiente del sistema. La gama de parámetros que deben explorarse para un experimento en particular dependerá de la aplicación (bioe efecto deseado, tipo de célula, profundidad del tejido diana si está in vivo, etc.) y de la naturaleza de cualquier agente de cavitación que se utilice. Dado el gran número de variables (frecuencia estadounidense, amplitud de presión, longitud de pulso, frecuencia de repetición de impulsos, etc.) es poco probable que sea factible explorar completamente todo el espacio de parámetros. Una ventaja del protocolo propuesto es que permite establecer rápidamente algunos límites en este espacio de parámetros. Por ejemplo, permite determinar la presión mínima a la que se genera una señal de cavitación, la presión máxima o la longitud de pulso que se puede utilizar antes de que se produzca el desprendimiento/muerte de la célula, y la presión a la que se producen armónicos fraccionarios o ruido de banda ancha. Se recomienda que este conjunto de mediciones de alcance se lleve a cabo como primer paso en cualquier estudio.

Como se presentó, los SATs están diseñados para el monitoreo en tiempo real de las emisiones acústicas, con ensayos biológicos que se realizan fuera del experimento. Sería relativamente sencillo, sin embargo, modificar el SAT para permitir la observación óptica directa de la cámara de muestra a través de un objetivo de microscopio. Esto podría a su vez acoplarse a un sistema de fluorescencia y/o microscopía de alta velocidad para permitir la observación de la absorción de fármacos y la dinámica de burbujas, por ejemplo. La salida de PCD tal como se presenta actualmente en términos de voltaje indica: i) los tipos de comportamiento de cavitación y sus proporciones relativas; ii) cuánto tiempo persisten estos comportamientos de cavitación; iii) si las características de exposición acumulativa de tiempo observadas están correlacionadas con un bioefecto particular; y iv) si los niveles relativos y los comportamientos dependientes del tiempo son consistentes con experimentos anteriores en el sistema de exposición. Si bien se puede cuantificar la sensibilidad de recepción de la PCD, para caracterizar de forma fiable las emisiones acústicas en términos de energía absoluta, se requiere información espacial adicional. Esto podría lograrse reemplazando el PCD con una sonda de matriz para implementar el mapeo acústico pasivo (PAM)^80. Sin embargo, esto aumentaría la complejidad del procesamiento de la señal y el tiempo computacional y la potencia requeridos.

También podrían incorporarse otros instrumentos para la medición de la resistencia eléctrica de las membranas o la aplicación de métodos de focalización física, por ejemplo, campos magnéticos. También sería posible utilizar estructuras tridimensionales de tejido como esferoides tumorales, organoides o incluso muestras de tejido ex vivo en sustratos de gel acústicamente "blandos" en lugar de las monocapas celulares para estudiar los efectos estadounidenses y mediados por cavitación en entornos tisulares más realistas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorber	Precision Acoustics	APTFlex F28 panel	1.0 cm standard thickness
Amplifier (power)	E&I Ltd.	1040L	400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre)	Stanford Research Systems	SR445A	Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater	Aquael	Ultra 50W	Different models for different tank sizes.
Digitizer	TiePie Engineering	HS5-110-XM	Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone	Precision Acoustics	FOH	0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles	Bracco	SonoVue	FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3)	Olympus NDT	F-102	90 degree beam reflection
PCD transducer	Olympus NDT	V320-SU	Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable	Olympus NDT	BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid)	Corning	Sylgard 184	See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal)	Zeus	PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal)	VWR	391-2101	6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator	Agilent	33250	Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2	Ibidi	µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3	Corning	Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3)	Sonic Concepts	H107 with central hole	Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage