Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

Resumen

Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Resumen

La comprensión de los mecanismos que son la base de la diferenciación y de la función del adipocyte se ha beneficiado grandemente del uso de las variedades de células blancas inmortalizadas del preadipocyte. Estas variedades de células cultivadas, sin embargo, tienen limitaciones. No capturan completamente el espectro funcional diverso de las poblaciones heterogéneas del adipocyte que ahora se saben para existir dentro de depósitos adiposos blancos. Para proporcionar un modelo más fisiológicamente relevante para estudiar la complejidad del tejido adiposo blanco, se ha desarrollado y optimizado un protocolo para permitir el aislamiento simultáneo de progenitores primarios de adipocitos blancos y marrones de ratones recién nacidos, su rápida expansión en cultivo y su diferenciación in vitro en adipocitos maduros y completamente funcionales. La principal ventaja de aislar las células primarias de los recién nacidos, en lugar de ratones adultos, es que los depósitos adiposos se están desarrollando activamente y son, por lo tanto, una rica fuente de preadipocitos proliferantes. Los preadipocitos primarios aislados mediante este protocolo se diferencian rápidamente al alcanzar la confluencia y se vuelven completamente maduros en 4-5 días, una ventana temporal que refleja con precisión la aparición de almohadillas de grasa desarrolladas en ratones recién nacidos. Los cultivos primarios preparados con esta estrategia pueden ampliarse y estudiarse con alta reproducibilidad, lo que los hace adecuados para pantallas genéticas y fenotípicas y permite el estudio de los fenotipos de adipocitos autónomos celulares de los modelos genéticos de ratón. Este protocolo ofrece un acercamiento simple, rápido, y barato para estudiar la complejidad del tejido adiposo in vitro.

Introducción

La obesidad resulta de un desequilibrio crónico entre la toma de energía y el gasto energético. A medida que se desarrolla la obesidad, los adipocitos blancos experimentan una expansión masiva en el tamaño celular que resulta en hipoxia en el microambiente, muerte celular, inflamación y resistencia a la insulina^1. Los adipocitos hipertrofiados disfuncionales no pueden almacenar adecuadamente el exceso de lípidos, que se acumulan en cambio en otros tejidos donde amortiguan la acción de la insulina^2,3. Los agentes que mejoran la función del adipocyte y restauran el lípido normal que repiq....

Protocolo

Este protocolo sigue todas las directrices de la IACUC del Instituto de Investigación Scripps y la Facultad de Medicina y Salud Pública de la Universidad de Wisconsin – Madison.

1. Recolección y digestión de depósitos adiposos (día 1)

1. Prepare dos tubos de 1,5 mL para cada cachorro: uno para el tejido adiposo marrón (BAT) y otro para el tejido adiposo blanco (WAT). Agregue 250 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 200 μL de tampón de aislamiento 2x (123 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,3 mM de CaCl_2,5 mM de glucosa, 100 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatanosulfónico (HEPES), penicilina-estreptomicina y a....

Resultados

La sección 1 del protocolo producirá una suspensión heterogénea de células que son visibles bajo un microscopio de luz estándar. El filtrado de tejidos digeridos con un colador celular (sección 2) eliminará el tejido no digerido. Sin embargo, algunos desechos celulares, células sanguíneas y adipocitos maduros pasarán a través de (Figura 1C). Los lavados suaves 1 h después del revestimiento eliminarán las células no relevantes, ya que los preadi.......

Discusión

El tejido adiposo es crítico para la sensibilidad sistémica a la insulina y la homeostasis de la glucosa²⁰. la disfunción obesidad-ligada del adipocyte se asocia firmemente al inicio del tipo - diabetes 2. Por lo tanto, una mayor comprensión de la biología y de la fisiología básicas del tejido adiposo puede permitir el diseño de nuevos tratamientos para los desordenes metabólicos. Como complemento al análisis funcional y transcripcional directo de adipocitos maduros aislados de depósito.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich	I7018
6-well plates	Corning	353046
AdipoRed (Nile Red)	Lonza	PT-7009
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
BenchMark Fetal Bovine Serum	Gemini Bioproducts LLC	100-106
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Cell strainer	Fisher Scientific	22363549
Collagenase, Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
ddH2O	Sigma-Aldrich	6442
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
DMEM	Sigma-Aldrich	D5030	For Bioenergetics studies
DMEM, High Glucose, Glutamax	Gibco	10569010
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fatty Acid-Free BSA	Sigma-Aldrich	A8806
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Norepinephrine	Cayman Chemical	16673
Oligomycin	Sigma-Aldrich	75351
Pen/Strep	Gibco	15140122
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Rotenone	Sigma-Aldrich	557368
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent Technologies	102416-100	For Bioenergetics studies
Surgical forceps	ROBOZ Surgical Instrument Co	RS-5158
Surgical Scissors	ROBOZ Surgical Instrument Co	RS-5880
ThermoMixer	Eppendorf	T1317
triiodothyronine (T3)	Sigma-Aldrich	642511