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  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe un análisis del reportero para estudiar la regulación de la traducción del mRNA en solos ovocitos durante la maduración in vitro.

Resumen

Los eventos asociados con la maduración nuclear de ovocitos han sido bien descritos. Sin embargo, se sabe mucho menos acerca de las vías moleculares y procesos que tienen lugar en el citoplasma en preparación para la fertilización y adquisición de totipotency. Durante la maduración de los ovocitos, los cambios en la expresión génica dependen exclusivamente de la traducción y degradación de los ARN mensajeros maternos (ARNm) en lugar de la transcripción. La ejecución del programa traslacional, por lo tanto, juega un papel clave en el establecimiento de la competencia de desarrollo de ovocitos para sostener el desarrollo embrionario. Este papel es parte de un foco en la definición del programa de la traducción maternal del mRNA que ocurre durante la maduración meiótica y en la transición del oocyte-a-cigoto. En este trabajo de método, se presenta una estrategia para estudiar la regulación de la traducción de arns diana durante la maduración in vitro de los ovocitos. Aquí, un reportero de Ypet se fusiona a la región sin traducir 3' (UTR) del gen de interés y luego se microinyecta en ovocitos junto con la codificación de ARNm poliadenilada para que mCherry controle el volumen inyectado. Mediante el uso de microscopía de lapso de tiempo para medir la acumulación de reporteros, las tasas de traducción se calculan en diferentes transiciones durante la maduración meiótica de los ovocitos. Aquí, los protocolos para el aislamiento y la inyección del oocyte, la grabación del lapso de tiempo, y el análisis de datos se han descrito, usando el Ypet/interleukin-7 (IL-7) - 3' UTR reportero como ejemplo.

Introducción

Un ovocito mamífero completamente crecido sufre cambios rápidos en la preparación para la fertilización y la adquisición de totipotency. Estos cambios son esenciales para sostener el desarrollo embrionario después de la fertilización. Aunque los eventos asociados con la maduración nuclear están relativamente bien descritos, se sabe mucho menos sobre los procesos moleculares y las vías en el citoplasma de los ovocitos. Durante las etapas finales de la maduración de los ovocitos, los ovocitos son transcripcionalmente silenciosos, y la expresión génica depende totalmente de la traducción y degradación delARNm 1,2. La síntesis de proteínas críticas para la competencia en el desarrollo, por lo tanto, se basa en un programa de traducción cronometiva de ARNm de larga vida que se han sintetizado antes durante el crecimientode los ovocitos 1,3. Como parte de un foco en la definición de este programa de la traducción maternal del mRNA ejecutada durante la maduración meiótica y en la transición del oocyte-a-cigoto, este papel presenta una estrategia para estudiar la activación y la represión de la traducción de los mRNAs maternales de la blanco en solos ovocitos durante la maduración meiotic in vitro.

En este método, el marco de lectura abierto YPet se clona aguas arriba de la 3' UTR de la transcripción de interés. A continuación, los ARNm que codifican este reportero se microinyectan en los ovocitos junto con los ARNm poliadenilados que codifican mCherry para controlar el volumen inyectado. La acumulación del reportero se mide durante la maduración meiótica in vitro del oocyte usando microscopia del lapso de tiempo. La acumulación de proteína fluorescente amarilla (YFP) y mCherry se registra en ovocitos individuales, y las señales de YFP se corrigen por el nivel estancado de la mCherry co-inyectada. Después de la adquisición de datos, las tasas de traducción se calculan para diferentes intervalos de tiempo durante la maduración meiótica de ovocitos in vitro calculando la pendiente de la curva obtenida por el ajuste de la curva.

Este enfoque proporciona una herramienta para confirmar experimentalmente los cambios en la traducción de ARNm endógenos seleccionados. Además, este método facilita la caracterización de los elementos reguladores que controlan la traslación durante la maduración meiótica de los ovocitos mediante la manipulación de elementos cis-reguladores de la UTR 3' de los ARNm diana4,5,6. La manipulación de la longitud de la cola de poli(A) también permite comprender la actividad de la adenilasa/deadenilasa enlos ovocitos 5. La mutagénesis de elementos de acción cis o inmunoprecipitación de ARN puede utilizarse para estudiar las interacciones con proteínas de unión a ARN cognado6,7. Además, este método se puede utilizar para identificar los componentes esenciales del programa de traducción que son críticos para la competencia en el desarrollo de los ovocitos mediante la medición de la traducción de utr objetivo 3' en modelos asociados con la disminución de la calidad de los ovocitos 8,9,10. Este papel del método presenta un experimento representativo donde los ovocitos denudados de 21 días de ratones C57/BL6 se han micro-inyectado con un reportero de Ypet fundido al 3' UTR de IL-7. La configuración y el protocolo para la inyección del oocyte, la grabación del lapso de tiempo, y el análisis de datos se han descrito.

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Protocolo

Los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Francisco (protocolo AN182026).

1. Preparación de medios

  1. Añadir todos los componentes, como se describe en la Tabla 1,para hacer el medio básico de recolección de ovocitos y el medio de maduración de ovocitos. Para el medio de recolección básico, establezca el pH en 7.4. Tanto para el medio de recolección como para el de maduración, añadir 3 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) y 1 μM de cilostamida el día de su uso.

2. Preparación de la codificación del mRNA para Ypet-3' UTR y mCherry

  1. Obtenga las secuencias 3′ UTR de los ARNm de interés.
    NOTA: Para este estudio, las secuencias fueron obtenidas previamente del cDNA del oocyte del ratón.
  2. Diseñe cebadores para amplificar el objetivo 3' UTRs de cDNA de ovocitos y porciones del vector pcDNA 3.1 que contiene una secuencia de codificación Ypet, etiqueta V5-epítopo y un promotor T7.
  3. Amplificar utilizando un kit de ADN polimerasa de alta fidelidad. Ejecute los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un gel para verificar si los fragmentos tienen el tamaño correcto, corte las bandas y extraiga el ADN del gel usando un kit de extracción de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Fusione los fragmentos de PCR a un vector utilizando un kit de clonación de PCR.
    NOTA: Los fragmentos de PCR se incubaron en hielo durante 4 h para facilitar un proceso de recombinación más eficiente. Esto es contrario a las instrucciones del fabricante, que recomiendan un tiempo de incubación de sólo 45 min.
  5. Transfect PCR fragments into competent 5-α Escherichia coli bacteria.
    1. Añadir la mezcla y el plásmido a las bacterias, e incubar sobre hielo durante 30 min.
    2. Choque térmico de la mezcla y el plásmido colocando la mezcla en un baño de agua a 42 °C durante 45 s, y enfriar inmediatamente sobre hielo durante 3 min.
    3. Añadir 500 μL de caldo Super Optimal con medio de represión catabolita (SOC) e incubar durante 1 h a 37 °C.
    4. Gire hacia abajo a 7000 × g durante 2 minutos y retire la mayor parte del sobrenadante. Resuspend y plato en una placa de agar caldo de Luria (LB) con el antibiótico de selección apropiado.
      NOTA: La carbenicilina fue utilizada en este estudio.
    5. Incubar durante la noche a 37 °C. Aísle las colonias presionando ligeramente una punta de pipeta sobre una de las colonias y colocándola en 3 mL de medio LB con 100 μg/mL de carbenicilina. Incubar durante 12-24 h a 37 °C.
    6. Extraiga el ADN de los plásmidos utilizando el kit de aislamiento de ADN de plásmido de acuerdo con las instrucciones del fabricante y confirme las secuencias mediante secuenciación de ADN.
  6. Para Ypet/3' UTR:
    1. Producir una plantilla de PCR lineal para la transcripción in vitro. Utilice un cebador delantero aguas arriba de la secuencia de Ypet y un cebador inverso con 20 residuos adicionales de timina. Véase la Tabla 2 para la secuencia de Ypet/IL-7 3' UTR y las secuencias de los cebadores delanteros y inversos.
      NOTA: Estos residuos adicionales de timina añadirán oligo(A) al ARNm lineal después de la transcripción in vitro.
    2. Transcriba in vitro el producto de PCR utilizando un kit de transcripción T7 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    3. Purifique el ARN complementario resultante (cRNA) utilizando un kit de limpieza de transcripción de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Elute el cRNA purificado en agua RNAse-libre, mida la concentración y evalúe integridad por electroforesis de la agarosa. Conservar a −80 °C.
  7. Para mCherry:
    1. Producir una plantilla de PCR lineal para la transcripción in vitro mediante el uso de una enzima de restricción de alta fidelidad; utilice la enzima de restricción mfEI-HF si replica este ejemplo. Digest en un tampón de digestión durante la noche a 37 °C.
    2. Ejecute un gel para purificar la muestra y extraiga el ADN lineal usando un kit de extracción de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    3. Transcriba in vitro el producto de PCR utilizando un kit de transcripción T7 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Poliadenilato el ARNc (150-200 nucleótidos) utilizando un kit de relaves de poli(A) según las instrucciones del fabricante.
    5. Purifique el ARNc resultante utilizando un kit de limpieza de transcripción de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    6. Elute el cRNA purificado en agua RNAse-libre, mida concentraciones del mRNA, y evalúe la integridad del mensaje por electroforesis del gel. Conservar a −80 °C.

3. Procedimiento experimental

NOTA: En la Figura 1se ofrece una descripción esquemática de la microinyección de ovocitos y la posterior microscopía de lapso de tiempo.

  1. Día 1
    1. Inyecte por vía intraperitoneal ratones de 21 días de edad con 5 UI de gonadotropina sérica de yegua embarazada para promover el crecimiento del folículo a la etapa antral11.
  2. Día 3
    1. Colección de ovocitos
      1. Sacrificar ratones 44-48 h después de cebar para recoger los ovarios, y colocarlos en una placa de Petri de plástico con medio básico de recolección de ovocitos.
      2. Abra cuidadosamente los folículos antrales haciendo un pequeño corte en la pared del folículo con una aguja de 26 G. Aísle los ovocitos cúmulo-incluidos intactos (COCs) con varias capas de células del cúmulo usando una pipeta de cristal boca-funcionada.
      3. Use una pipeta más pequeña (ligeramente más grande que el diámetro del ovocito) y denude mecánicamente los AOC mediante pipeteo repetido.
        NOTA: Alternativamente, realice la microinyección en AOC intactos.
      4. Utilizando una pipeta más grande, aspirar los ovocitos denudados y colocarlos en una placa de Petri con medio de maduración suplementado con 1 μM del inhibidor de la fosfodiesterasa, cilostamida, para evitar la reanudación de la maduración meiótica12. Colocar el plato en la incubadora durante 2 h para dejar que los ovocitos se recuperen del estrés inducido por el aislamiento de los ovocitos de los folículos.
    2. Microinyección de ovocitos
      1. Prepare las agujas de inyección colocando un tubo capilar de vidrio de borosilicato de 10 cm de largo en un tirador mecánico. Para una inyección óptima, doble la punta de la aguja en un ángulo de 45° usando un filamento calentado.
      2. Prepare platos de poliestireno con gotitas de 20 μL de medio básico de recolección de ovocitos, y cubra las gotitas con aceite mineral ligero.
      3. Prepare una mezcla de reportero añadiendo 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR y 12,5 μg/μL mCherry. Prepare un volumen más grande y haga las alícuotas para los experimentos futuros para asegurar concentraciones similares del reportero. Guarde estas alícuotas a -80 °C. Al descongelarse, primero centrífuga la alícuota durante 2 min a 20.000 x g,y transferir a un nuevo tubo de microcentrífuga.
        NOTA: Esta centrifugación evitará que la aguja de inyección se obstruyera por los agregados potenciales en la mezcla del reportero.
      4. Cargue la aguja de inyección por capilaridad con aproximadamente 0,5 μL de mezcla de reportero.
      5. Coloque la pipeta de sujeción y la aguja de inyección cargada en los soportes, y colóquela en la gota del medio de recolección de ovocitos. Aspirar parte del medio en la pipeta de sutención.
      6. Abra la aguja de inyección tocándola suavemente contra la pipeta de sujeción.
      7. Coloque los ovocitos en una gotita de medio de recolección básico, e inyecte 5-10 pL de la mezcla del reportero.
      8. Incubar los ovocitos en el medio de maduración con 1 μM de cilostamida durante 16 h para permitir que la señal de mCherry se estabilice.
      9. Prepare una placa de Petri que se utilizará para la microscopía de lapso de tiempo con al menos dos gotitas de 20 μL de medio de maduración para cada reportero inyectado: una gotita con cilostamida de 1 μM para el control de ovocitos detenidos por la profase I y una gotita sin cilostamida para ovocitos maduros. Cubra las gotitas con aceite mineral ligero y colóquelo en la incubadora.
    3. Microscopía de lapso de tiempo
      1. Después de la preincubación, retire los ovocitos inyectados de la incubadora y lávelos cuatro veces en medio de maduración sin cilostamida. Mantenga algunos ovocitos en medio de maduración con 1 μM de cilostamida como grupo de control de ovocitos detenido por la profase I.
      2. Transfiera los ovocitos inyectados a sus respectivas gotitas en el plato de microscopio de lapso de tiempo previamente preparado. Agrupe los ovocitos usando una pipeta de vidrio cerrada (se puede preparar una pipeta cerrada sosteniendo la punta en una llama durante unos segundos).
        NOTA: Agrupar los ovocitos ayuda a prevenir su movimiento durante el registro.
      3. Coloque la antena bajo el microscopio equipado con un sistema de iluminación de diodos emisores de luz y una etapa motorizada equipada con una cámara ambiental mantenida a 37 °C y 5% de CO2. Para replicar este estudio, utilice los siguientes parámetros: conjunto de filtros: espejo dicroico YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canal YFP (Excitación (Ex): S500/20 × 49057; Emisión (EM): D535/30 m 47281), mCanal de la masa (ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
      4. Introduzca la configuración adecuada para el experimento de lapso de tiempo (consulte la Tabla de materiales para el software utilizado en este estudio): Haga clic en Aplicaciones | Adquisición Multidimensional. Seleccione la primera pestaña Principal y seleccione timelapse, múltiples posiciones de etapay múltiples longitudes de onda.
      5. Seleccione la pestaña Guardar para entrar en la ubicación donde se debe guardar el experimento.
      6. Seleccione la pestaña Timelapse para introducir el número de puntos de tiempo, la duración y el intervalo de tiempo.
        NOTA: La duración del experimento de lapso de tiempo depende de la especie animal estudiada, ya que el momento de la maduración meiótica de los ovocitos difiere entre las especies. En este experimento con los ovocitos del ratón, los ovocitos fueron registrados cada minuto 15 para 16 H.
      7. Seleccione la pestaña Escenario. Encienda brightfield y localice la posición de los ovocitos abriendo una nueva ventana seleccionando Adquirir | Adquirir | Mostrar en vivo. Una vez que los ovocitos están ubicados, vuelva a la ventana adquisición multidimensional y presione + para establecer la ubicación de los ovocitos.
      8. Seleccione la pestaña Longitudes de onday establezca 3 longitudes de onda diferentes para brightfield (exposición 15 ms), YFP (exposición 150 ms para Ypet/IL7 3' UTR) y mCherry (exposición 75 ms para Ypet/IL7 3' UTR).
        NOTA: Ajuste la exposición para cada reportero UTR Ypet/3' basado en el nivel de acumulación del reportero y el volumen inyectado. Asegúrese de que la señal YFP cae en el centro del rango de detección al inicio del experimento para evitar la subestimación o saturación en caso de activación de la traducción. Para mCherry, ajuste la exposición para cada lote de mCherry ya que la señal depende del número de nucleótidos de adenina que se agregaron durante el procedimiento de poliadenilación. Debido a la variación en la eficiencia de poliadenilación, utilice el mismo lote de mCherry en diferentes experimentos para una mejor comparación entre experimentos.
      9. Inicie el experimento de lapso de tiempo haciendo clic en Adquirir. Consulte la Figura 2 y el Archivo Suplementario para obtener un ejemplo de un registro de lapso de tiempo en un solo ovocito.
    4. Análisis de la traducción de Ypet-3' UTR
      1. Para este análisis (ver Tabla de Materiales para el software utilizado en este estudio), realizar dos mediciones de región para cada ovocito: el propio ovocito -haga clic en la región de la elipse y rodee el ovocito- y una pequeña región cerca del ovocito que se utilizará para la sustracción de fondo-haga clic en la región rectangular.
        NOTA: Asegúrese de que los ovocitos no se muevan fuera de la región seleccionada durante el registro de lapso de tiempo. Preste especial atención a la colocación de la medición de la región alrededor de la extrusión del cuerpo polar, ya que esto causa el movimiento en el ovocito y puede distorsionar el registro.
      2. Exporte los datos de medición de la región a una hoja de cálculo haciendo clic primero en Abrir registro y luego en Datos de registro para exportar el software de análisis de datos.
      3. Para cada ovocito individual y para todos los puntos de tiempo medidos, reste la medición de la región de fondo de la medición de la región del ovocito. Haga esto para las longitudes de onda YFP y mCherry por separado.
      4. Registre el momento de la descomposición de la vesícula germinal (GVBD) y la extrusión del cuerpo polar (PBE) para referencia posterior.
        NOTA: Excluya los ovocitos de ratón maduros cuando la GVBD supere las 2 h.
      5. Trazar la expresión de YFP y mCherry a lo largo del tiempo para cada ovocito para comprobar si hay valores atípicos.
        NOTA: Esta debe ser una curva suave, si no lo es esto puede indicar que el ovocito se movió durante el registro.
      6. Para cada ovocito individual, calcule la expresión promedio de mCherry para los últimos diez puntos de tiempo de la grabación. Para cada punto de tiempo, divida la expresión YFP por la expresión de mCherry promediada para corregir el volumen inyectado para obtener una relación YFP/mCherry en cada punto de tiempo para cada ovocito individual.
      7. Calcule las tasas de traslación para un intervalo de tiempo específico ajustando la pendiente de la curva mediante regresión lineal. Evaluar las diferencias en las tasas de traducción mediante inferencia estadística.

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Resultados

Los ovocitos I-arrestados de la profase denudada de 21 ratones de un día C57/BL6 fueron inyectados con una mezcla del reportero que contenía el mRNA que codificaba el reportero de Ypet fundido al 3' UTR de IL-7 y del mRNA que codificaba mCherry. La expresión de YFP y de mCherry fue registrada en 39 ovocitos, cuyo 30 fueron madurados, y 9 fueron arrestados en la profase I como control negativo. Tres ovocitos maduros fueron excluidos para el análisis porque tenían un GVBD retrasado (N=2) o movidos en el plato durante ...

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Discusión

El actual método describe una estrategia para estudiar la activación y la represión de la traducción del mRNA de la blanco en diversas transiciones durante la maduración meiótica in vitro del oocyte. IL-7, un cytokine lanzado por el oocyte que se puede implicar en la comunicación8de la célula del oocyte-cumulus,13,fue elegido con el fin de describir este método. Il-7 se sabe para ser traducido cada vez más durante la maduración

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por NIH R01 GM097165, GM116926 y Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 a Marco Conti. Enrico M. Daldello recibió el apoyo de una beca de la Fundación Lalor y Natasja G. J. Costermans recibió el apoyo de una beca Rubicon de la Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (NWO).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Preparation of media
Bovine Serum Albumin Powder BioxtraSigma-AldrichSIAL-A3311
CilostamideEMD Millipore231085
MEM alphaGibco12561-056
Minimum Essential Medium Eagle Sigma-AldrichM2645
Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile FilteredGenesee Scientific Corporation (GenClone)25-512
Sodium Bicarbonate JT-Baker3506-1
Sodium PyruvateGibco 11360-070
Ultrapure distilled waterInvitrogen10977-015
Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry
AgaroseApex Biomedical 20-102QD
Carbenicillin disodium saltSigma-AldrichC1389-1G
Choo-Choo Cloning KitMcLabCCK-20
CutSmart Buffer (10x)New England BiolabsB7204
DNA loading dye (6x)Thermo ScientificR0611
dNTP SolutionNew England BiolabsN0447S
DpnINew England BiolabsR0176
GeneRuler 1 kb DNA ladderThermo FisherSM1333
LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova TeknovaL1010
LB Medium (Capsules)MP Biomedicals3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up KitLife TechnologiesAM1908
MfeI-HF restriction enzymeNew England BiolabsR3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitInvitrogenAM1344
Phusion High Fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530
Poly(A) Tailing kitInvitrogenAM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
S.O.C. mediumThermo Fisher15544034
TAE buffer Apex Biomedical 20-193
Ultrapure Ethidium Bromide SolutionLife Technologies15585011
Oocyte collection
Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettesSigma-AldrichA5177-5EA
Calibrated micro-pipettesDrummond Scientific Company2-000-025 
PMSG- 5000MybiosourceMBS142665
PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2BD305111
Syringe 1 mlBD309659
Oocyte micro-injection
35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-0-20-CFor time-lapse microscopy
Borosilicate glass with filamentSutter InstrumentBF100-78-10
Oil for Embryo CultureIrvine Scientific9305
Petri DishFalcon351006For micro-injection
Tissue Culture DishFalcon353001For oocyte incubation
VacuTip Holding CapillaryEppendorf5195000036
Software
BiorenderBioRenderPreparation of Figure 1S
MetaMorph, version 7.8.13.0 Molecular Devices For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation 

Referencias

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