Respuesta cardíaca a la estimulación β-adrenérgica determinada por análisis de asa presión-volumen

Resumen

Aquí describimos un análisis de asa presión-volumen cardíaco bajo dosis crecientes de isoproterenol infundido por vía intravenosa para determinar la función cardíaca intrínseca y la reserva β-adrenérgica en ratones. Utilizamos un enfoque de pecho abierto modificado para las mediciones de bucle presión-volumen, en el que incluimos ventilación con presión positiva al final de la espiración.

Resumen

La determinación de la función cardíaca es un análisis de punto final robusto en modelos animales de enfermedades cardiovasculares con el fin de caracterizar los efectos de tratamientos específicos en el corazón. Debido a la viabilidad de las manipulaciones genéticas, el ratón se ha convertido en el modelo animal de mamíferos más común para estudiar la función cardíaca y buscar nuevas dianas terapéuticas potenciales. Aquí describimos un protocolo para determinar la función cardíaca in vivo utilizando mediciones y análisis de asa presión-volumen durante condiciones basales y bajo estimulación β-adrenérgica por infusión intravenosa de concentraciones crecientes de isoproterenol. Proporcionamos un protocolo refinado que incluye soporte de ventilación teniendo en cuenta la presión positiva al final de la espiración para mejorar los efectos negativos durante las mediciones de tórax abierto, y analgesia potente (buprenorfina) para evitar el estrés miocárdico incontrolable evocado por el dolor durante el procedimiento. En conjunto, la descripción detallada del procedimiento y la discusión sobre posibles escollos permite un análisis de bucle presión-volumen altamente estandarizado y reproducible, reduciendo la exclusión de animales de la cohorte experimental al prevenir posibles sesgos metodológicos.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares suelen afectar la función cardíaca. Este número señala la importancia de evaluar in vivo la función cardíaca detallada en modelos de enfermedades animales. La experimentación animal está rodeada por un marco de los tres principios rectores de las Tres R (3R) (Reducir/Refinar/Reemplazar). En caso de comprender patologías complejas que involucran respuestas sistémicas (es decir, enfermedades cardiovasculares) en el nivel de desarrollo actual, la opción principal es refinar los métodos disponibles. El refinamiento también conducirá a una reducción del número de animales requerido debido a una menor variabilidad, lo que mejora el poder del análisis y las conclusiones. Además, la combinación de mediciones de contractilidad cardíaca con modelos animales de enfermedad cardíaca, incluidos los inducidos por estimulación neurohumoral o por sobrecarga de presión como bandas aórticas, que imita, por ejemplo, los niveles alterados de catecolaminas / β-adrenérgicos^1,2,3,4, proporciona un método poderoso para estudios preclínicos. Teniendo en cuenta que el método basado en catéter sigue siendo el enfoque más utilizado para la evaluación en profundidad de la contractilidad cardíaca⁵, nuestro objetivo fue presentar aquí una medición refinada de la función cardíaca in vivo en ratones mediante mediciones de asa de presión-volumen (PVL) durante la estimulación β-adrenérgica basada en la experiencia previa, incluida la evaluación de parámetros específicos de este enfoque^{6, 7}.

Para determinar los parámetros hemodinámicos cardíacos se dispone de enfoques que incluyen técnicas basadas en imágenes o catéteres. Ambas opciones van acompañadas de ventajas y desventajas que deben considerarse cuidadosamente para la cuestión científica respectiva. Los enfoques de imágenes incluyen ecocardiografía y resonancia magnética (MRI); ambos se han utilizado con éxito en ratones. Las mediciones ecocardiográficas implican altos costos iniciales de una sonda de alta velocidad requerida para la alta frecuencia cardíaca de los ratones; es un enfoque no invasivo relativamente sencillo, pero es variable entre los operadores que idealmente deberían tener experiencia en el reconocimiento y visualización de estructuras cardíacas. Además, no se pueden realizar mediciones de presión directamente y los cálculos se obtienen a partir de la combinación de magnitudes de tamaño y mediciones de flujo. Por otro lado, tiene la ventaja de que se pueden realizar varias mediciones en el mismo animal y la función cardíaca se puede monitorear, por ejemplo, durante la progresión de la enfermedad. En cuanto a la medición de volumen, la resonancia magnética es el procedimiento estándar de oro, pero similar a la ecocardiografía, no es posible realizar mediciones de presión directa y solo se pueden obtener parámetros dependientes de la precarga⁸. Los factores limitantes son también la disponibilidad, el esfuerzo de análisis y los costos operativos. Aquí los métodos basados en catéteres para medir la función cardíaca son una buena alternativa que además permiten el monitoreo directo de la presión intracardíaca y la determinación de parámetros de contractilidad independientes de la carga, como el trabajo de accidente cerebrovascular reclutable precarga (PRSW)⁹. Sin embargo, los volúmenes ventriculares medidos por un catéter de conductancia de presión (mediante determinación de conductividad) son menores que los de la resonancia magnética, pero las diferencias de grupo se mantienen en el mismo rango¹⁰. Para determinar valores de volumen confiables, se requiere la calibración correspondiente, que es un paso crítico durante las mediciones de PVL. Combina mediciones ex vivo de la conductividad sanguínea en cubetas calibradas por volumen (conversión de conductancia a volumen) con el análisis in vivo para la conductancia paralela del miocardio durante la inyección en bolo de la solución salina hipertónica^11,12. Más allá de eso, el posicionamiento del catéter dentro del ventrículo y la orientación correcta de los electrodos a lo largo del eje longitudinal del ventrículo son críticos para la capacidad de detección del campo eléctrico circundante producido por ellos. Aún con el tamaño reducido del corazón de ratón es posible evitar artefactos producidos por cambios en la orientación intraventricular del catéter, incluso en ventrículos dilatados^5,10,pero los artefactos pueden evolucionar bajo estimulación β-adrenérgica^6,13. Además de los métodos de conductancia, el desarrollo del método basado en la admisión parecía evitar los pasos de calibración, pero aquí los valores de volumen están bastante sobreestimados^14,15.

Dado que el ratón es uno de los modelos preclínicos más importantes en la investigación cardiovascular y la reserva β-adrenérgica del corazón es de interés central en la fisiología y patología cardíaca, aquí presentamos un protocolo refinado para determinar la función cardíaca in vivo en ratones mediante mediciones de PVL durante la estimulación β-adrenérgica.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con las regulaciones del Consejo Regional de Karlsruhe y la Universidad de Heidelberg (AZ 35-9185.82 /A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) se ajustan a las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos. Los datos mostrados en este protocolo se derivan de ratones machos salvajes tipo C57Bl6 / N (17 ± 1,4 semanas de edad). Los ratones se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en la instalación de animales (IBF) de la Facultad de Medicina de Heidelberg. Los ratones fueron alojados en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, con una humedad relativa entre el 56-60%, un cambio de aire de 15 veces por hora y una temperatura ambiente de 22 ° C + / - 2 ° C. Se mantuvieron en jaulas convencionales tipo II o tipo II provistas de ropa de cama para animales y papeles de seda como enriquecimiento. Los alimentos estándar en autoclave y el agua en autoclave estaban disponibles para consumir ad libitum.

1. Preparación de instrumentos y soluciones farmacológicas

1. Catéter venoso central: Corte el microtubo (0,6 mm de diámetro exterior) en tubos de catéter de ~20 cm de largo. Use fórceps para tirar de un extremo del tubo en la punta de una cánula de calibre 23. Corte el otro extremo del tubo en diagonal para crear una punta afilada que pueda perforar la vena femoral.
2. Tubo endotraqueal: Para un tubo de intubación corte una cánula de venopunción de calibre 20 de 3 cm de longitud para quitar la fijación de la jeringa.
   1. Si el tubo de intubación no se ajusta perfectamente a la conexión del ventilador, envuelva la parapelícula sobre el extremo del tubo donde está conectado el dispositivo de ventilación. La conexión debe ser estable y sellada por el espesamiento (Figura 1A). Acorte el pasador guía metálico de la cánula de venopunción de calibre 20 a 2,7 cm y úselo como ayuda para la intubación. Los enfoques refinados para la intubación, incluidas las fibras ligeras para facilitar la visualización de la tráquea, también están bien descritos, por ejemplo, por Das y colaboradores¹⁶.
3. Mezcla anestésica utilizada para la intubación: Mezclar 200 μL de heparina (1000 UI/ml) con 50 μL de NaCl al 0,9% y 750 μL de etomidato de 2 mg/ml de un producto a base de emulsión de aceite en agua. Utilizar 7 μL/g de peso corporal (BW) para cada ratón (0,1 mg/kg de buprenorfina 10 mg/kg de etomidato de peso corporal).
4. Relajante muscular: Disolver 100 mg de bromuro de pancuronio en 100 ml de NaCl al 0,9%. Utilice 1,0 μL/g de peso corporal (1 mg/kg de peso corporal) para cada ratón.
5. Soluciones de isoproterenol: Disolver 100 mg de isoproterenol en 100 mL de NaCl al 0,9% (1 μg/μL). Preparar las siguientes diluciones (Tabla 1) y transferir cada una en una jeringa de 1 ml.
   1. Para obtener la dilución 1, diluya el caldo 1:1.8. Para obtener la dilución 2, diluya el caldo 1:6. Para obtener la dilución 3, diluya la dilución 1 en 1:10. Finalmente, obtener la dilución 4 por una dilución 1:10 de la dilución 2.
6. NaCl hipertónico al 15% (p/v): Disolver 1,5 g de NaCl al 0,9% en 10 ml de H₂O doble destilado. Filtrar la solución con un filtro de jeringa de poro de 0,45 μm.
7. Preparación de solución de albúmina al 12,5% (p/v): Disolver 1,25 g de albúmina sérica bovina en 10 mL de NaCl al 0,9%. Incubar la solución a 37 °C durante 30 min. Enfríe a temperatura ambiente y filtre la solución con un filtro de jeringa de poro de 0,45 μm.
8. Preparación de la configuración: Primero encienda la placa de calentamiento y configúrela a 39-40 ° C. Coloque una jeringa llena de solución salina en la almohadilla térmica y transfiera el catéter de asa de presión-volumen (PVL) a la jeringa. Preincubar el catéter durante al menos 30 minutos antes de usarlo para la estabilización. La configuración que utilizamos consiste en un catéter de conductancia de presión 1.4-F, una unidad de control y el software correspondiente, y se describe gráficamente en la Figura 1B y las referencias del proveedor se enumeran en la Tabla de Materiales.

2. Anestesia

1. Inyecte buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal por vía intraperitoneal) 30 min antes de la intubación.
2. Coloque el ratón en una cámara de vidrio acrílico presaturada con 2,5% de isoflurano y precalentada con una almohadilla térmica colocada en la base de la cámara.
3. Tan pronto como el ratón duerma (falta de reflejo), inyecte la mezcla anestésica (7 ml/kg de peso corporal) que contiene 10 mg/kg de etomidato y heparina (1.200 UI/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal.

3. Ventilación

1. Transfiera al animal a la plataforma de intubación (Figura 1C) 3-4 minutos después de la inyección anestésica. El ratón cuelga de los dientes con la vista dorsal mirando hacia el operador.
2. Levante suavemente la lengua con fórceps. Para identificar la glotis, levante ligeramente la mandíbula inferior del ratón con segundas pinzas.
3. Inserte cuidadosamente el tubo endotraqueal(Figura 1A)en la tráquea y retire la varilla guía.
4. Transfiera el animal a la placa calefactora, colóquelo en la parte posterior y conecte el tubo de intubación al respirador del animal pequeño.
5. Ajustar la frecuencia respiratoria a 53.5 x (Peso corporal en gramos)^-0.26 [min^-1],según lo descrito por otros¹², y los volúmenes corrientes a presiones inspiratorias máximas de 11 ± 1 cmH₂O. Establecer una PEEP de 2 cmH₂O.
6. Fije cuidadosamente las extremidades del ratón en la placa calefactora con tiras adhesivas y aplique ungüento para los ojos en ambos ojos para evitar la sequedad.
7. Inserte una sonda de temperatura rectal y mantenga la temperatura corporal central a 37 ± 0,2 °C.
8. Instale un ECG de 1 derivación y controle la frecuencia cardíaca en línea como indicador de la profundidad y estabilidad de la anestesia.
9. En ausencia de reflejos interdigitales, inyectar 1 mg/kg de peso corporal del relajante muscular pancuronio-bromuro por vía intraperitoneal. Esto evita los artefactos respiratorios durante las mediciones de PVL.

4. Cirugía

1. Recomendaciones generales
   1. Durante la cirugía, ventile con ~1.5-2% de isoflurano vaporizado con O_2. La concentración de isoflurano también puede depender de variables como la cepa del ratón, el sexo, la edad y el peso de los animales, pero debe determinarse individual y experimentalmente y los valores aquí son referencia para la cepa de ratón C57BL6 / N. Es importante destacar que el ventilador está conectado a un sistema de extracción para evitar que el operador inhale isoflurano.
   2. Use un aumento entre 1.5-4x del microscopio estereoscópico para procedimientos quirúrgicos.
      NOTA: Consulte la guía institucional / local sobre la preparación del animal para cirugías que no son de supervivencia.
2. Canulación femoral
   1. Enjuague la extremidad posterior con etanol al 70%, incise la región inguinal izquierda y exponga la vena femoral izquierda.
   2. Blast de la arteria epigástrica y la vena con una cauterización.
   3. Ligar la vena femoral con una sutura colocada distal al acceso del catéter.
   4. Pase una sutura debajo de la vena femoral y prepare un nudo craneal del sitio de punción. Punción de la vena femoral con el microtubo preparado (ver paso 1.1) conectado a una jeringa de 1 ml.
   5. Ate el nudo para fijar el tubo dentro del recipiente.
   6. Contrarrestar la pérdida de líquido mediante la infusión de NaCl al 0,9% suplementado con albúmina al 12,5% a una velocidad de perfusión de 15 μL/min con una bomba de jeringa automática. Además, mantenga el tejido expuesto húmedo usando NaCl al 0,9% precalentado.
3. Toracotomía
   1. Enjuague el tórax con etanol al 70%.
   2. Incite la piel justo debajo del proceso xifoideo y separe sin rodeos los músculos pectorales de la pared torácica con fórceps o un cauterizado.
   3. Levante el proceso xifoideo con fórceps y luego corte a través de la pared torácica moviéndose lateralmente en ambos lados con una cauterización hasta que el diafragma sea completamente visible desde abajo.
   4. Incise el diafragma desde abajo y exponga el ápice cardíaco. Luego retire cuidadosamente el pericardio con fórceps.
   5. Realizar una costotomía limitada en el lado izquierdo como se describió anteriormente⁶.
   6. Pase una sutura debajo de la vena cava inferior para realizar la reducción de la precarga durante las etapas posteriores.
   7. Puncionar suavemente el ápice cardíaco con una cánula de calibre 25 (máximo 4 mm). Retire la cánula e inserte el catéter fotovoltaico hasta que todos los electrodos estén dentro del ventrículo.
   8. Ajuste la posición del catéter mediante movimientos suaves y giros hasta obtener asas de forma rectangular (Figura 2A).
   9. Mantenga siempre húmedo todo el tejido expuesto usando NaCl al 0,9% precalentado.

5. Medidas

1. Recomendaciones generales
   1. Durante las mediciones, ventile con ~1.5-2% de isoflurano vaporizado con 100% de O_2.
   2. Realice 2 mediciones basales, así como 2 oclusiones de vena cava en cada paso del protocolo de respuesta a la dosis.
      NOTA: Es importante que después de la primera y segunda oclusión de la vena cava, tanto los valores de presión como los de volumen vuelvan a los valores de estado estacionario como antes de la primera oclusión. Esta observación es necesaria para reconocer un cambio en la posición del catéter debido a reducciones seriadas en el volumen intraventricular. Si un cambio en la posición del catéter fuera el caso, especialmente los valores de volumen se desplazarían.
2. Realizar un análisis on-line de parámetros (frecuencia cardíaca, volumen sistólico, dP/dt_max)y esperar hasta que se obtenga la función cardíaca en estado estacionario. Para el rango de parámetros esperado con la configuración aquí utilizada en ratones C57Bl6 / N, consulte los resultados publicados⁶.
3. Detenga el respirador en la posición espiratoria final y registre los parámetros basales. Después de 3 a 5 segundos, reduzca la precarga cardíaca levantando la sutura debajo de la vena cava inferior con fórceps para obtener parámetros independientes de precarga (Figura 2B). Encienda el ventilador. Espere al menos 30 segundos para la segunda oclusión hasta que los parámetros hemodinámicos se estabilicen.
4. Después de obtener las mediciones en condiciones basales, proceda a la dosis-respuesta de isoproterenol cambiando a las jeringas preparadas. Aquí la velocidad de infusión se mantiene sin cambios para evitar modificaciones de la precarga cardíaca. Tenga cuidado de no infundir burbujas de aire al cambiar la jeringa.
   1. Espere al menos 2 minutos hasta que se obtenga una nueva función cardíaca en estado estacionario para detener nuevamente el respirador en la posición espiratoria final y registrar los parámetros basales. Después de 3 a 5 segundos, reduzca la precarga cardíaca levantando la sutura debajo de la vena caval inferior para obtener parámetros independientes de precarga.
   2. Espere al menos 30 segundos para la segunda oclusión. Luego cambie a la jeringa preparada con la siguiente concentración de isoproterenol y repita los registros de los parámetros independientes de línea de base y precarga.
      NOTA: Artefactos como el pico de presión sistólica final (ESPS, Figura 2C)pueden ocurrir durante el aumento en la dosis de isoproterenol, que resulta del atrapamiento del catéter. Los artefactos que ocurren antes del inicio de los parámetros basales se pueden corregir fácilmente mediante el reposicionamiento del catéter.

6. Calibración

NOTA: Los procedimientos de calibración pueden variar según el sistema PVL utilizado.

1. Calibración de conductancia paralela
   1. Conecte una jeringa que contenga una solución de NaCl al 15% a la cánula femoral después de la última medición de la dosis-respuesta de isoproterenol. Infundir cuidadosamente 5 μL de la solución hipertónica que queda en el tubo hasta que la PVL se desplace ligeramente hacia la derecha durante la visualización en línea. Luego espere hasta que los bucles vuelvan al estado estacionario.
   2. Detenga el respirador al final de la espiración e inyecte un bolo de 10 μL de NaCl al 15% en 2 a 3 segundos. Compruebe si los PVL se amplían en gran medida y se desplazan hacia la derecha durante la visualización en línea.
2. Calibración de conductancia a volumen
   1. Espere 5 minutos, nada menos, para que el bolo salino hipertónico se diluya por completo. Posteriormente, retire el catéter y extraiga al menos 600 μL de sangre del ventrículo izquierdo del corazón que late con una jeringa de 1 ml y una cánula de calibre 21. En este punto de tiempo, el animal es sacrificado bajo anestesia profunda y analgesia por sangrado masivo, al detener la ventilación y la extracción del corazón.
   2. Transfiera la sangre a la cubeta de calibración precalentada (en un baño de agua a 37 °C) con cilindros de volumen conocido. Coloque el catéter fotovoltaico centralmente en cada cilindro y registre la conductancia. Al calcular una curva estándar para cada animal, las unidades de conductancia se pueden convertir en valores de volumen absolutos.

7. Análisis

1. Después de mediciones exitosas de PVL en condiciones basales y estimulación de isoproterenol, visualice, digitalice, calcule y extraiga parámetros que caracterizan la función cardíaca (como PRSW, dP / dt, presión y volumen diastólico final, presión y volumen sistólicos finales, tau constante de relajación, entre otros) utilizando un software de análisis PVL apropiado. Se pueden realizar análisis estadísticos adicionales y representaciones gráficas con un software de análisis estándar.
2. Análisis de parámetros independientes de precarga
   NOTA: Para este paso es crucial estandarizar el procedimiento.
   1. Seleccione los primeros 5-6 PVL que muestren una precarga decreciente en todas las mediciones para el análisis de parámetros independientes de precarga(Figura 2D). Un número constante de PVL seleccionados para el análisis durante la reducción de precarga disminuirá la variabilidad entre las mediciones de los parámetros obtenidos.
   2. Calcule el valor medio de las dos mediciones en cada paso del protocolo.

Resultados

La medición del bucle de volumen de presión (PVL) es una herramienta poderosa para analizar la farmacodinámica cardíaca de los medicamentos e investigar el fenotipo cardíaco de los modelos de ratón modificados genéticamente en condiciones normales y patológicas. El protocolo permite la evaluación de la reserva cardíaca β-adrenérgica en el modelo de ratón adulto. Aquí describimos un método de pecho abierto bajo anestesia isoflurano combinado con buprenorfina (analgésico) y pancuronio (relajante muscular), ...

Discusión

Aquí, proporcionamos un protocolo para analizar la función cardíaca in vivo en ratones bajo estimulación β-adrenérgica creciente. El procedimiento se puede utilizar para abordar tanto los parámetros basales de la función cardíaca como la reserva adrenérgica (por ejemplo, inotropía y cronotropía) en ratones modificados genéticamente o en intervenciones. La ventaja más destacada de las mediciones de bucle de presión-volumen (PVL) en comparación con otros medios para determinar la función cardíaca es el an...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4F SPR-839 catheter	Millar Instruments, USA	840-8111
1 ml syringes	Beckton Dickinson, USA	REF303172
Bio Amplifier	ADInstruments, USA	FE231
Bridge-Amplifier	ADInstruments, USA	FE221
Bovine Serum Albumin	Roth, Germany	8076.2
Buprenorphine hydrochloride	Bayer, Germany	4007221026402
Calibration cuvette	Millar, USA	910-1049
Differential pressure transducer MPX	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	Type 39912
Dumont Forceps #5/45	Fine Science tools Inc.	11251-35
Dumont Forceps #7B	Fine Science tools Inc.	11270-20
Graefe Forceps	Fine Science tools Inc.	11051-10
GraphPad Prism	GraphPad Software	Ver. 8.3.0
EcoLab-PE-Micotube	Smiths, USA	004/310/168-1
Etomidate Lipuro	Braun, Germany	2064006
Excel	Microsoft
Heparin	Ratiopharm, Germany	R26881
Hot plate and control unit	Labotec, Germany	Hot Plate 062
Isofluran	Baxter, Germany	HDG9623
Isofluran Vaporizer	Abbot	Vapor 19.3
Isoprenalinhydrochloride	Sigma-Aldrich, USA	I5627
Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID	Smiths Medical International Ltd, UK	Ref. 800/100/100
MiniVent ventilator for mice	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	Type 845
MPVS Ultra PVL System	Millar Instruments, USA
NaCl	AppliChem, Germany	A3597
NaCl 0.9% isotonic	Braun, Germany	2350748
Pancuronium-bromide	Sigma-Aldrich, USA	BCBQ8230V
Perfusor 11 Plus	Harvard Apparatus	Nr. 70-2209
Powerlab 4/35 control unit	ADInstruments, USA	PL3504
Rechargeable cautery-Set	Faromed, Germany	09-605
Scissors	Fine Science tools Inc.	140094-11
Software LabChart 7 Pro	ADInstruments, USA	LabChart 7.3 Pro
Standard mouse food	LASvendi GmbH, Germany	Rod18
Stereo microscope	Zeiss, Germany	Stemi 508
Surgical suture 8/0	Suprama, Germany	Ch.B.03120X
Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge	Beckton Dickinson, USA	393224
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science tools Inc.	00574-11
Water bath	Thermo Fisher Scientific, USA
Syringe filter (Filtropur S 0.45)	Sarstedt, Germany	Ref. 83.1826