Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS

Resumen

Los ratones expuestos al ozono combinado y a las endotoxinas bacterianas muestran una muerte celular muy extendida, incluida la de los neutrófilos. Observamos adaptaciones celulares tales como interrupción del lamellipodia citoesquelético, expresión celular creciente de la subunidad compleja del synthase del ATP de V β y angiostatin en lavado bronco-alveolar, supresión de la inmunorespuesta del pulmón y reclutamiento retrasado del neutrófilo.

Resumen

Los pulmones se enfrentan continuamente a insultos directos e indirectos en forma de condiciones inflamatorias estériles (partículas o toxinas reactivas) e infecciosas (bacterianas, virales o fúngicas). Una respuesta abrumadora del anfitrión puede dar lugar a la respiración comprometida y a lesión de pulmón aguda, que es caracterizada por el reclutamiento del neutrófilo del pulmón como resultado de la respuesta de remodelación inmune, coagulativa y del tejido pato-lógica del anfitrión. Los métodos microscópicos sensibles para visualizar y cuantificar las adaptaciones celulares pulmonares murinas, en respuesta al ozono de dosis bajas (0,05 ppm), un potente contaminante ambiental en combinación con lipopolisacárido bacteriano, un agonista TLR4, son cruciales para comprender los mecanismos inflamatorios y de reparación del huésped. Describimos un análisis microscópico fluorescente comprensivo del vario pulmón y de los compartimientos sistémicos del cuerpo, a saber el líquido de lavado bronco-alveolar, el perfusate vascular del pulmón, los cryosections izquierdos del pulmón, y el perfusate esternal de la médula. Mostramos daño de macrófagos alveolares, neutrófilos, tejido parenquimatoso pulmonar, así como células de médula ósea en correlación con una respuesta inmune retrasada (hasta 36-72 h) que se caracteriza por gradientes discretos de quimioquinas en los compartimentos analizados. Además, presentamos la matriz extracelular pulmonar y las interacciones citoesqueléticos celulares (actina, tubulina), especies de oxígeno mitocondrial y reactivo, plasminógeno anticoagulante, su fragmento peptídico antiangiogénico angiostatina, las subunidades mitocondriales del complejo V atp sintasa, α y β. Estos marcadores sustitutos, cuando están complementados con análisis célula-basados ines vitro adecuados y técnicas de proyección de imagen animales in vivo tales como microscopia intravital, pueden proporcionar la información vital hacia la comprensión de la respuesta del pulmón a los agentes inmunomoduladores nuevos.

Introducción

La lesión pulmonar aguda (LPA) es una respuesta patológica crucial de los pulmones a estímulos infecciosos u otros estímulos dañinos que se caracteriza por la activación simultánea de los sistemas inmunitario coagulativo, fibrinolítico e innato^1. Los neutrófilos detectan rápidamente patrones de daño microbiano e intracelular a través de la familia de receptores toll-like (TLR)^2,3,4. Los neutrófilos liberan citoquinas preformadas y contenido de gránulos citotóxicos, que luego pueden causar daño tisular colateral. El daño alveolar subsiguiente se empaña con la muerte celular secundaria que lleva al lanzamiento de moléculas tales como trifosfato de adenosina (ATP)^5,así fijando en un círculo vicioso del inmune-dysregulation.

Un problema sin resolver en la comprensión de ALI se relaciona con la cuestión de cómo se inicia la lesión dentro de la membrana alveolar. El complejo de transporte de electrones V, F1F0 ATP sintasa, es una proteína mitocondrial conocida por expresarse ubicuamente, en la membrana plasmática celular (incluyendo endotelial, leucocito, epitelial) durante la inflamación. El citoesqueleto celular que se compone de actina y tubulina, alberga muchas formas celulares y modulación de la función, así como proteínas mitocondriales, respectivamente. Recientemente hemos demostrado que el bloqueo de la ATP sintasa por una molécula endógena, angiostatina, silencia el reclutamiento de neutrófilos, la activación y el lipopolisacárido (LPS) indujo la inflamación pulmonar^6. Así, los mecanismos bioquímicos (synthase del ATP) e inmunes (TLR4) pudieron regular la barrera alveolar durante la inflamación del pulmón.

La exposición al ozono (O_3),un contaminante ambiental, deteriora la función pulmonar, aumenta la susceptibilidad a las infecciones pulmonares, y los niveles bajos cortos de exposiciones a O₃ aumentan el riesgo de mortalidad en aquellos con afecciones cardiorrespiratorias subyacentes^{7,8,9,10,11,12,13,14.} Así, la exposición a concentraciones fisiológicamente relevantes de_O3 proporciona un modelo significativo de ALÍ para estudiar los mecanismos fundamentales de la inflamación^7,8. Nuestro laboratorio ha establecido recientemente un modelo murino de dosis bajas de O₃ inducida por ALI^15. Después de realizar una dosis y tiempo-respuesta a bajas concentraciones de_O3, observamos que la exposición a 0,05 ppm_O3 durante 2 h, induce una lesión pulmonar aguda que está marcada por la subunidad de la subunidad β del complejo V de ATP sintasa pulmonar (ATPβ) y la expresión de angiostatina, similar al modelo LPS. Las imágenes pulmonares intravitales revelaron desorganización de los microfilamentos de actina alveolar que indican daño pulmonar, y la ablación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) septal alveolares (que indican la abrogación de la señalización celular basal) y el potencial de membrana mitocondrial (que indica muerte celular aguda) después de la exposición de 2 h a 0,05 ppm O₃¹⁵ que se correlacionaron con un pulmón heterogéneo ¹⁸Retención de FDG^16,reclutamiento de neutrófilos y liberación de citoquinas, sobre todo IL-16 y SDF-1α. El mensaje para llevar a casa de nuestros estudios recientes es que O₃ produce una toxicidad exponencialmente alta cuando se expone a concentraciones por debajo de los límites permitidos de 0,063 ppm durante 8 h (por día) para la exposición humana. Es importante destacar que no existe una comprensión clara sobre si estas exposiciones subclínicas a O₃ pueden modular mecanismos mediados por TLR4, como por la endotoxina bacteriana¹⁷. Por lo tanto, se estudió un doble golpe O₃ y lps modelo de exposición y observó las adaptaciones celulares inmunes y no inmunes.

Describimos un análisis microscópico fluorescente comprensivo de varios compartimientos del pulmón y del cuerpo sistémico, a saber el líquido de lavado bronco-alveolar (es decir, BAL) que muestrea los espacios alveolares, el perfusate vascular del pulmón (es decir, LVP) que muestrea la vasculatura pulmonar y el intersticio septal alveolar en caso de una barrera endotelial comprometida, criosecciones izquierdas del pulmón, para mirar en los leucocitos parenquimales y adherentes residentes dejados en el tejido pulmonar lavado , sangre periférica que representa los leucocitos circulantes y los perfundsatos de médula ósea esternal y fémur que muestrean los sitios proximales y distales de movilización de células hematopoyéticas durante la inflamación, respectivamente.

Protocolo

El diseño del estudio fue aprobado por la Junta de Ética de La Investigación Animal de la Universidad de Saskatchewan y se adhirió a las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal para el uso humano de los animales. Seis-ocho ratones masculinos de la semana C57BL/6J fueron procurados. NOTA: Eutanasiar a cualquier animal que desarrolle letargo severo, dificultad respiratoria u otros signos de angustia grave antes del punto final programado.

NOTA: Prepare lo siguiente: 27-18 G embotados con aguja (dependerá del diámetro traqueal del ratón), tubo de PE de tamaño apropiado para adaptarse a la aguja roma (hacer una cánula de PE para cada ratón), cánula, 2 tijeras afiladas, 2 fórceps romos (pequeños), 1 fórceps afilado (pequeño), 3 jeringas de 1 ml, tubos de microfuge etiquetados (para BAL, sangre, vascular y recolección de perfusato de médula ósea) y viales etiquetados (para fijación de tejidos), bolsas de muestra / crioviales para la recolección de tejidos, rollo de hilo de algodón de carnicero (cortado en ligaduras de tamaño adecuado). Todos los productos químicos utilizados para los experimentos se indican en la Tabla de Materiales.

1. Exposiciones al ozono y a lps para la inducción de lesión pulmonar murina

1. Exposición al ozono
   1. Prepare un cuadro de inducción personalizado de O_3. Agregue alimento para ratones, botellas de agua, juguetes de enriquecimiento y ropa de cama limpia en orden e imite el entorno de la vivienda de los ratones.
      NOTA: Estos pasos garantizarán que los ratones tengan acceso gratuito a alimentos y agua cuando se alojan en la caja de inducción personalizada y ayudarán a aliviar el estrés indebido.
   2. Cambie el calibrador/generador O₃ "ON" (colocado hacia el puerto de entrada) para estabilizar la lámpara UV antes de la mano (alrededor de 15 minutos antes de las exposiciones) y conéctese con el monitor O₃ en línea.
      NOTA: El monitor O₃ debe leer un promedio de 0.05 ppm, según la muestra de la salida a temperatura constante del aire de la cámara (72 ±3 ° F) y humedad relativa (50±15%).
   3. Para exposiciones de O_3, coloque suavemente los ratones en la caja de inducción personalizada y exponga continuamente a los ratones a 0,05 ppm O₃ durante 2 h.
2. Anestesia y administración intranasal de LPS
   1. Prepare 10 mg/mL de existencias para ketamina y xilazina, por separado.
   2. Preparar un cóctel mezclando 20 partes de ketamina y 1 parte de xilazina. Si el ratón pesa X g, inyecte (X/200) mL de cóctel de ketamina/xilazina en la cavidad peritoneal. Para un ratón, prepare 1 mL de cóctel que comprende 1000 μL de la cepa de ketamina de 10 mg/mL y 50 μL de la cepa de xilazina. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo en un tubo de microfuge.
      NOTA: Las existencias de ketamina y xilazina se pueden preparar con una semana de antelación.
   3. Anestesiar a los ratones bajo mezcla ligera de ketamina intraperitoneal (IP) (50 mg/kg)/xilazina (1 mg/kg) (por ejemplo, para un ratón de 25 g, inyecte 0,125 mL del cóctel).
   4. Prepare una solución de 1 mg/mL de LPS, en solución salina, y llene 50 μL de la solución en una pipeta.
   5. Sostenga el ratón en posición vertical con su espalda / lado dorsal en la palma de la mano, sosteniendo las orejas con la misma mano. Ahora, coloque 50 μL de la solución lps¹⁸ suavemente fuera de las fosas nasales (es decir, 25 μL en cada fosa nasal o 50 μL en una fosa nasal; no importa siempre y cuando el procedimiento sea rápido) y permita que los ratones inhalen la solución LPS.
   6. Infundir a los ratones control 50 μL de solución salina estéril.
      Precaución:No exceda más de 100 μL para la instilación, que podría ser fatal. Demasiado menos volumen (es decir, <50 μL) y hay riesgo de solo deposición nasal.
   7. Después de la administración de LPS, coloque suavemente los ratones, ya sea sobre su estómago o su espalda sobre el montículo de ropa de cama con la cabeza ligeramente hacia abajo.
      NOTA: Esta orientación prolonga la retención de la solución en la cavidad nasal¹⁹.
   8. A las 0, 2, 4, 24, 36 y 72 h después de la exposición, anestesiar a los ratones i.p. con dosis completa de mezcla de ketamina (200 mg/kg)/xilazina (4 mg/kg) (es decir, X/50 mL del cóctel, donde X es el peso del ratón en gramos o 0,50 mL para un ratón de 25 g).
   9. Observe el ratón hasta que pierda el conocimiento y el reflejo correcto (es decir, no se vuelve hacia atrás cuando se coloca en posición supina). Ahora, revise el ratón para la profundidad de la anestesia, mediante el seguimiento de la respiración (excursiones rítmicas de pecho) y la frecuencia cardíaca, que debe caer notablemente, después de 1-2 minutos.
   10. A continuación, compruebe si hay reflejos del pedal, es decir, pellizque cualquiera de los dígitos de las extremidades posteriores y observe la retracción de la extremidad, como un reflejo. Si el ratón responde, insótese con inyecciones adicionales de 0,1 mL o más, según sea necesario.
       NOTA: Para lograr la anestesia profunda, tenga en cuenta que ciertas cepas o ratones obesos suelen tener un mayor volumen de distribución y por lo tanto pueden ser fácilmente sobredosificados, si se permite el tiempo suficiente si no se permite para la anestesia completa (que puede ser de alrededor de 10 minutos o más). En consecuencia, algunas cepas pueden ser resistentes a la anestesia y, por lo tanto, requieren más recargas. Este conocimiento se adquiere después de muchas observaciones prácticas y experiencia con ratones de diferentes cepas y edades. Pues algunos experimentos experimentales también fueron realizados inmediatamente después de las exposiciones de O₃ y de los LPS (es decir, en el tiempo-punto de 2 h), también incluimos un cierto análisis muy temprano de la célula del BAL de esos experimentos para destacar los efectos inmediatos de la exposición combinada de O₃^{y de los LPS.}

2. Recogida de muestras

1. Coloque el ratón en la bandeja quirúrgica. Ahora, coloque suavemente ungüento lubricante para los ojos en ambos ojos para evitar la pérdida de líquido y desinfecte el ratón con un aerosol de etanol al 70%.
   1. Haga pequeños cortes a través de las membranas superiores e inferiores de la piel con tijeras, para exponer la tráquea y el tórax.
   2. Haga un corte justo debajo del esternón y exponga el corazón.
2. Punción cardíaca
   1. Coloque una aguja 25G unida a la jeringa heparinizada en el ventrículo derecho y extraiga sangre mediante punción cardíaca.
      NOTA: La sangre generalmente se extrae con un mínimo de extracción del émbolo, si el tiempo desde la exposición del corazón a la punción cardíaca es inferior a un minuto. Después de recolectar alrededor de 0.4-0.5 mL, es posible que deba hacer una pausa durante unos segundos antes de recolectar la sangre restante. Esto se hace para dejar que el corazón bombee cualquier volumen restante en la cámara ventricular derecha. Al final de la recolección de sangre, el corazón se detiene para bombear.
   2. Recoja la sangre y guárdelo en tubos de microfugos para su posterior procesamiento.
3. traqueostomía
   1. Use cuidadosamente pinzas/fórceps contundentes para eliminar la región traqueal del tejido sobre la sobreaforma. Use las manos enguantadas más que los instrumentos quirúrgicos para evitar el sangrado. Si una gran cantidad de sangre está rezumando, hay riesgo de contaminar las muestras de BAL. Use hisopos de algodón, si es necesario, aunque no sea preferible. Kimwipes son mejores alternativas.
   2. Ahora, corte a través de la caja torácica para exponer los pulmones. Una vez más, tenga cuidado de no cortar el esternón y las arterias intercostales o la aorta ascendente; hacer cortes más pequeños mientras avanza a través de la caja torácica)
   3. Pase una ligadura de algodón por debajo del recorte traqueal y déjelo como tal por el momento.
   4. Snip la tráquea en una localización conveniente en la porción distal 1/3^rd, señalando hacia los pulmones, para permitir el acceso para una cánula traqueal de 28 G.
   5. Inserte una cánula de PE de 28 G (una longitud mínima de 3-5 mm y un extremo distal recortado para facilitar la inserción) en la tráquea. Tenga cuidado con el extremo de la tráquea antes de la bifurcación y luego tire de aproximadamente un mm hacia atrás para evitar el muestreo de un solo lóbulo.
   6. Firmemente, ate la ligadura de algodón para mantener la cánula en su lugar. No colapse la cánula.
4. Lavado bronco-alveolar (BAL)
   1. Llene 0,5 ml de PBS en una jeringa de 1 mL.
   2. Ahora inyecte gradualmente 0.5 mL de PBS en la cánula con la ayuda de 1 mL de jeringa.
   3. Después de inyectar PBS, aspire la jeringa siempre y cuando no resista la succión.
      NOTA: Si hay resistencia mientras se aspira el líquido BAL hacia fuera, eso indica el colapso del tejido alveolar o bronquial. En ese caso, tire hacia atrás de la cánula por un minúsculo para separar la cánula de las paredes del tejido.
   4. Recoja el líquido aspirado en un tubo de microfugo marcado y colóquelos sobre hielo.
   5. Realizar dos lavados más de manera similar recogiendo en el mismo vial (es decir, un total de 0.5 X 3 = 1.5 mL lavado).
   6. Mida el volumen de líquido BAL recogido. La recuperación del lavado debe ser cercana al 90%.
5. Perfusato vascular pulmonar (LVP)
   1. Corte la aorta torácica descendente en una ubicación entre las mitades torácica y abdominal, para evitar cualquier respaldo de perfusato en los pulmones mientras se perfunde a través del ventrículo derecho.
   2. Limpie la cavidad cerca del extremo de la aorta cortada, libre de sangre.
   3. A continuación, perfunda los pulmones con 0,5 mL de solución salina heparinizada a temperatura ambiente inyectada a través del ventrículo derecho.
   4. Recoger el perfusato vascular de la cavidad en el extremo de corte de la aorta torácica descendente, en un tubo de microfugio, colocado sobre hielo y medir su volumen.
   5. Ligar el bronquio derecho proximal a su ramificación de la tráquea (con hilo de algodón).
6. Fijación pulmonar izquierda in situ
   1. Conecte una jeringa de 1 ml a la cánula traqueal, que es lo suficientemente larga como para insertarla a través de la incisión traqueal anterior.
   2. Extraiga aire en la jeringa hasta 0.6 mL de marca.
   3. Luego, llene la jeringa restante (hasta el final) con paraformadehído al 2% a temperatura ambiente. Asegúrese de que el émbolo esté listo para salir sin succionar el aire de la cánula.
   4. Ahora, coloque la jeringa con una cinta escocesa, a un recipiente vertical, medido hasta 20 cm de altura.
   5. Suavemente, saque el émbolo para dejar que el fijador fluya hacia la tráquea. En caso de que haya algunas burbujas de aire en la cánula, coloque suavemente el émbolo en la parte superior de la jeringa y el líquido comenzará a fluir después de unos segundos.
   6. Dejar que el pulmón izquierdo se infla a su capacidad total insitu, durante 5 minutos, desde una altura de 20 cm formando una columna de agua de 20 cm.
   7. Durante este procedimiento, asegúrese de proteger los lóbulos del pulmón derecho de entrar en contacto con el paraformaformadehído, ya que esto afectará los ensayos aguas abajo.
   8. Coloque tejidos de laboratorio plegados para absorber cualquier paraformacionaldehído que pueda entrar en contacto con los lóbulos pulmonares derechos.
      PRECAUCIÓN: El paraformacionaldehído es altamente tóxico. Por lo tanto, no inhale ni ponga contacto con ninguna parte expuesta del cuerpo. Tenga mucho cuidado al manipular.
   9. Durante el tiempo de instilación de paraformaformadehído, desinfecte el abdomen.
   10. Corte los lóbulos del pulmón derecho de la tráquea asegurándose de eliminar cualquier hilo y coloque inmediatamente los lóbulos en un cryovial etiquetado y déjelo caer en nitrógeno líquido para el análisis molecular/bioquímico rio abajo del análisis de citoquinas/RT-PCR/western blot del homogeneato pulmonar.
   11. Recorte cuidadosamente el pulmón izquierdo para cualquier tejido conectivo o membrana pleural y sumérjalo en paraformadehído al 2% durante 24 h a 4 °C.
   12. Incruste el pulmón fijo en la parafina según el protocolo de incrustación estándar.
       Precaución:No sobrecale las muestras pulmonares.
   13. Corte la parte abdominal y descorte la piel del hueso pélvico (cadera).
   14. Separe los huesos del fémur izquierdo y derecho de la porción pélvica, en una placa de Petri llena de solución salina mantenida sobre hielo.
7. Colección aspirada de médula ósea esternal y fémur
   1. Limpie el tejido y los músculos de los huesos mediante el uso de tejidos de laboratorio.
   2. Recoger la caja torácica ventral y el esternón en una placa de Petri llena de solución salina mantenida en el hielo.
   3. Corte las puntas distales y proximales de los huesos esternal y del fémur.
   4. Perfundir los huesos 4 veces con 0,5 ml de solución salina, utilizando agujas bien ajustadas (24 a 28 G) en jeringas de 1 ml, y recoger las fracciones de cada hueso en tubos etiquetados equipados con filtros y colocados en hielo.
      NOTA: El calibre de la aguja varía entre el tamaño del animal. Después del enrojecimiento, el hueso del fémur debe mostrarse transparente.
   5. Una vez que se hayan recogido las muestras, meter el ratón en una bolsa de plástico y colocarlo en un congelador de cadáveres de animales para su correcta eliminación, de acuerdo con las directrices de la instalación animal institucional.

3. Procesamiento de muestras

1. Recuentos totales (TLC) y diferenciales (DLC) de leucocitos
   1. Centrífuga sangre periférica, BAL, perfusato vascular pulmonar y muestras de médula ósea (esternal y fémur) durante 10 min a 500 g.
   2. Recoger los sobrenadantes, flash congelarlos y almacenarlos a -80 °C hasta su posterior análisis.
   3. Reconstituir las células en un mínimo de 200 μL de PBS.
   4. Realice tlc contando BAL, sangre, perfusato vascular pulmonar y células de médula ósea en un hemocitómetro.
   5. Manche otra alícuota de 9 μL de BAL con una mezcla de 1 μL de calqueína verde y rojo etidio homodímero-1 para cuantificar las células vivas (verdes) debido a la actividad intracelular de la esterasa y cualquier célula BAL dañada (en rojo) debido a la pérdida de integridad de la membrana plasmática.
   6. Agregue el ácido acético del 2% a lyse RBCs, en un ratio del 1:10 para el TLC de la sangre y el ratio 1:2 para el TLC vascularperfusate del pulmón.
      PRECAUCIÓN: Ajuste las concentraciones celulares diluyendo en PBS si la concentración es superior a 1x10⁶ células por mL (muy importante para las muestras de médula ósea).
   7. Centrifugar las células para preparar citospins en diapositivas y manchar como se explica a continuación para dlcs. Contar un mínimo de 100 células para recuentos de células leucocitarias diferenciales (DLCs).
      NOTA: Típicamente, uno puede preparar dos cytospins en una diapositiva. Y después de 10-15 minutos de secado al aire, proceda con el paso de tinción.
   8. Parta el BAL recogido a partir de tres ratones experimentales por grupo en dos cytospins cada uno y manche para la actinia/la tubulina y las mitocondrias con la fosforilación oxidativa activa (mitotracker reducido). Utilice el BAL de tres ratones más para dividir en dos citoespinos cada uno, para NK1.1/Gr1/CX3CR1 y ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin diapositivas teñidas. Dividir el BAL de tres ratones más en dos citoespinos cada uno para teñir para ATPα /Ly6G y CX3CR1 / Siglec-F.
2. Cuantificación de proteínas totales de lavado broncoalveolar (BAL) y perfusato vascular pulmonar (LVP)
   1. Para cuantificar O₃ y lps indujeron perturbaciones de la barrera vascular o de la presión oncótica relativa en los dos compartimientos pulmonares (es decir, los compartimientos septales (intersticiales) y vasculares alveolares del perfusate (vascular) ), mida el contenido total de la proteína en los líquidos recogidos.
   2. Analice las fracciones sobrenadantes descongeladas para su concentración total de proteínas utilizando un ensayo colorimétrico estándar resistente al detergente.
   3. Análisis de quimioquinas de lavado broncoalveolar (BAL) y perfusato vascular pulmonar (LVP)
      1. Después, analice las quimiocinas en el BAL y los sobrenadantes vasculares del perfusate del pulmón (LVP) usando un immunoensayo perla-basado magnético de 33 plex. Esto informará sobre la direccionalidad de las vías respiratorias / intersticio frente a los gradientes de quimioquinas vasculares establecidos después de exposiciones combinadas.
      2. Analice el siguiente panel de quimiocinas: CXCL13 (quimioatrayente de linfocitos B), CCL27 (quimioquina IL-11 R-alfa-locus (ILC)), CXCL5 (péptido activador de neutrófilos derivado de epiteliales 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxina-1), eotaxina-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalquina), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferón gamma), IL-10 (interleucina-10), IL-16 (interleucina-16), IL-1β (interleucina-1 beta), IL-2 (interleucina-2), IL-4 (interleucina-4), IL-6 (interleucina-6), CXCL-10 (proteína inducida por interferón gamma 10 (IP-10)), CXCL11 (proteína inducible por interferón gamma 9 (IP-9)), KC (quimioatrayactocitos queratinocitos MCP-1 (proteína quimioatrayente monocitos-1), MCP-3 (proteína quimioatrayente monocitos-3), MCP-5 (proteína quimioatrayente monocitos-5), MDC (quimioquina derivada de macrófagos (CCL22)), MIP-1α (proteína inflamatoria de macrófagos-1 alfa), MIP-1β (proteína inflamatoria de macrófagos-1 beta), MIP-2 (proteína inflamatoria de macrófagos-2), MIP-3α (proteína inflamatoria de macrófagos-3 alfa), MIP-3β (inflamatorio macrófago protein-3 beta), RANTES (regulado en la activación, célula T normal expresada y secretada (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (factor derivado de células del estroma 1), TARC (quimioquina regulada por timo y activación (TARC)), TECK (Chemokine expresada en timo (CCL25)) y TNFα (factor de necrosis tumoral alfa).

4. Tinción de citoespino e histología pulmonar

1. Tinción bioquímica de cytospin
   1. Rodee las citospinas con una pluma hidrofóbica para contener los productos químicos para la incubación durante el procedimiento.
   2. Rehidrate los cytospins en PBS por 5 minutos.
   3. Fije las muestras de citoespino en paraformaformadehído al 2% durante 10 minutos, lave tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.
   4. Permeabilizar con acetona helada al 70% durante 7 minutos y volver a lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.
   5. Tinción para actina y tubulina o Mitotracker reducido (incubar con una mezcla de 2 μg/50 μL de alexa 488 faloidina conjugada mostrada en verde, y 2 μg/μL de alexa 555 conjugado ratón anti-α tubulina o Mitotracker reducido mostrado en rojo, respectivamente) durante 15 minutos.
      NOTA: Utilice el anticuerpo de control del isotipo IgG1 del ratón, en un cytospin separado, para validar el protocolo de la coloración de la tubulina. Realice los mismos pasos que se explican de 4.1.1 a 4.1.8, pero para los controles de isotipo.
   6. Retire las manchas inclinando suavemente la mezcla de la diapositiva. Incubar los portaobjetos con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) durante 5-10 min para teñir núcleos.
   7. Lave las citospinas 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una, cubre con medios de montaje anti-desvanecimiento y guárdelos durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente antes de tomar la imagen.
   8. Adquiera imágenes bajo un microscopio vertical de campo amplio equipado con una cámara científica. Asegúrese de que los tiempos de exposición de la cámara sean constantes para los diferentes canales fluorescentes al obtener imágenes de las diapositivas.
2. Tinción inmuno-fluorescente de cytospin:
   1. Rodee las citospinas con una pluma hidrofóbica para contener los productos químicos para la incubación durante el procedimiento. Rehidrate los cytospins en PBS por 5 minutos.
   2. Fije las muestras de citoespino incubando en paraformadehído al 2% durante 10 minutos, lave tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.
   3. Permeabilizar con tritón X-100 al 0,1% frío durante 2 minutos, lavar tres veces con PBS durante 5 min cada una.
   4. A continuación, el bloque Fc durante 15 minutos incubando el citoespino con la dilución 1:50 del stock de anticuerpos del bloque Fc (para asegurarse de que el anticuerpo primario del ratón no reaccione de forma cruzada no específicamente con los anticuerpos Fc del ratón).
   5. Incline las diapositivas para eliminar el bloqueo Fc y cambiar a BSA al 1% e incubar el citoespino con una mezcla de 3 anticuerpos primarios de interés (consulte la Tabla 1 para las diversas combinaciones) durante 30 minutos.
      NOTA: Asegúrese de ejecutar anticuerpos de control de isotipo (incubar con una mezcla de ratón IgG1 y rata IgG2b kappa anticuerpos primarios mediante la realización de los pasos 4.2.1 a 4.2.9 y la sustitución de los anticuerpos con controles de isotipo) en paralelo con los anticuerpos secundarios correspondientes como se discutió en nuestro reciente estudio²⁰.
   6. Lavar 3 veces con PBS durante 5 min cada uno. Incube los citoespinos con una mezcla de anticuerpos secundarios adecuadamente diseñados (consulte la Tabla 1 para obtener más detalles).
   7. Retire las manchas inclinando suavemente la mezcla de la diapositiva, incubar con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) durante 5-10 min para manchar los núcleos. Lavar 3 veces con PBS durante 5 min cada uno.
   8. Cubrebocas con medios de montaje anti-desvanecimiento y almacenar durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente antes de la toma de imágenes.
   9. Adquiera imágenes bajo un microscopio vertical de campo amplio equipado con una cámara científica. Asegúrese de que los tiempos de exposición de la cámara sean consistentes para todos los canales de fluoróforo al obtener imágenes de las diapositivas.
3. Hematoxilina e histología de eosina (H&E)
   1. Realice la tinción modificada de H&E³ en las criosecciones del pulmón para todos los grupos.
4. análisis de imágenes
   1. Procesar y analizar archivos de datos de imagen (.tiff) en Fiji ImageJ software abierto (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   2. Compruebe los parámetros requeridos (Área, Perímetro, Densidad integrada, Descriptores de forma, Diámetro de Feret, Circularidad, Etiqueta de visualización) que se registrarán en la pestaña Analizar y Establecer medidas.
   3. Utilizando el gestor de ROI,delinee manualmente alrededor de 50-200 celdas en el panel de imágenes fusionadas utilizando la herramienta "selecciones a mano alzada". Guarde las regiones de interés (ROI) con el comando Ctrl+T y copie los ROI guardados para cada celda en todos los canales de fluoróforo.
   4. A continuación, pulse Ctrl+M para medir los parámetros preestablecidos para todos los canales fluorescentes (por ejemplo, 405 nm (DAPI o ATPβ en azul), 488 nm (actina o NK1,1 o Ki-67 en verde), 568 nm (tubulina o Gr1 o CD61 en rojo) y 633 nm (CX3CR1 o angiostatina en magenta)).
   5. Guarde los resultados como .csv archivo con un nombre adecuado que represente su análisis. Copie los resultados del archivo de .csv en una hoja de cálculo y divida la intensidad de fluorescencia (FI) (que es la columna de densidad integrada sin procesar del archivo de resultados) de la molécula teñida por la de DAPI o CD61 FI, según el diseño de tinción. Estas relaciones se denominan "relaciones FI normalizadas DAPI o CD61".
   6. A continuación, trace estas relaciones normalizadas, circularidad, perímetro de celda y diámetro de Feret, para evaluar cualquier cambio en el tamaño de la celda después de la exposición combinada de O₃ y LPS.
   7. Utilice el software estadístico apropiado para comprobar la normalidad de los datos recopilados y para probar la hipótesis nula (consulte la sección de análisis estadístico a continuación).
5. análisis estadístico
   1. Resultados expresos como sem medio ±. Un mínimo de tres ratones fueron utilizados por el grupo.
   2. Para el análisis de datos de quimioquinas, ajuste los valores p de ANOVA unidireccionales para la tasa de descubrimiento falso de acuerdo con la corrección de Benjamini y Hoshberg.
   3. Analizar los parámetros de la imagen, la celularidad, el diámetro de Feret, el perímetro, las relaciones de intensidad de fluorescencia normalizadas DAPI o CD61 mediante la prueba U de Mann-Whitney (para comparar dos grupos) o la prueba de Kruskal Wallis (para comparar múltiples grupos) ya que estos datos no estaban distribuidos normalmente.
   4. Para el resto de los experimentos de imágenes, analice los resultados utilizando un análisis unidireccional de varianza seguido de comparaciones múltiples de Sidak. Los valores p <0,05 se consideraron significativos.

Resultados

La exposición combinada de O₃ y de los LPS lleva a la movilización sistémica de la inflamación y de la médula en 72 h: Las cuentas de célula en diversos compartimientos revelaron cambios significativos en sangre periférica y las cuentas totales de la célula de la médula del fémur sobre exposiciones combinadas de O₃ y de los LPS. Aunque las exposiciones combinadas de_O3 y LPS no indujeron ningún cambio en los recuentos ...

Discusión

Los métodos presentados en el estudio actual destacan la utilidad del análisis del compartimiento múltiple para estudiar eventos celulares múltiples durante la inflamación del pulmón. Hemos resumido los resultados en el Cuadro 2. Nosotros y muchos laboratorios hemos estudiado extensivamente la respuesta murine a la instilación intranasal de los LPS, que es marcada por el reclutamiento rápido de neutrófilos del pulmón, que alcanza un máximo entre 6-24 h después de los cuales, la resolución pa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
33-plex Bioplex chemokine panel	Biorad	12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives	Leica	HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin	Invitrogen	A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A	Millipore	05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)	Invitrogen	A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa	BD Pharmingen	553343
C57BL/6 J Mice	Jackson Laboratories	64
Confocal laser scanning microscope	Leica	Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	D1306	aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope	Olympus	Olympus IX83
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	100 mg/ml	Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit	Invitrogen	L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)	Invitrogen	459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)	Invitrogen	A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)	Invitrogen	16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay	Thermoscientific	22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG	Abcam	ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)	Invitrogen	14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa	Invitrogen	14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)	Invitrogen	16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)	Invitrogen	53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)	BD Pharmingen	553142
Reduced mitotracker orange	Invitrogen	M7511
Xylazine (Rompun)	Bayer	20 mg/ml	Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock