Evaluación de la dispersión de biopelículas en heridas murinas

Resumen

Aquí, se describen métodos ex vivo e in vivo para evaluar la dispersión bacteriana de una infección de la herida en ratones. Este protocolo se puede utilizar para probar la eficacia de las terapias antimicrobianas y anti-biofilm tópicas, o para evaluar la capacidad de dispersión de diferentes cepas o especies bacterianas.

Resumen

Las infecciones relacionadas con el biofilm están implicadas en una amplia gama de condiciones crónicas como úlceras del pie diabético no curativas, sinusitis crónica, otitis media recurrente y muchas más. Las células microbianas dentro de estas infecciones están protegidas por una sustancia polimérica extracelular (EPS), que puede evitar que los antibióticos y las células inmunes del huésped despejen la infección. Para superar este obstáculo, los investigadores han comenzado a desarrollar agentes de dispersión como terapia potencial. Estos agentes se dirigen a varios componentes dentro de la EPS de biopelícula, debilitando la estructura e iniciando la dispersión de las bacterias, lo que teóricamente puede mejorar la potencia de los antibióticos y el aclaramiento inmunológico. Para determinar la eficacia de los agentes de dispersión para las infecciones de heridas, hemos desarrollado protocolos que miden la dispersión de biopelículas tanto ex vivo como in vivo. Utilizamos un modelo quirúrgico de la supresión del ratón que se ha descrito bien para crear infecciones crónicas biofilm-asociadas de la herida. Para monitorizar la dispersión in vivo,infectamos las heridas con cepas bacterianas que expresan luciferasa. Una vez establecidas las infecciones maduras, regamos las heridas con una solución que contiene enzimas que degradan los componentes del biofilm EPS. A continuación, supervisamos la ubicación y la intensidad de la señal luminiscente en los órganos de la herida y filtrado para proporcionar información sobre el nivel de dispersión alcanzado. Para el análisis ex vivo de la dispersión de biopelículas, el tejido de la herida infectada se sumerge en una solución enzimática que degrada la biopelícula, después de lo cual se evalúa la carga bacteriana restante en el tejido, frente a la carga bacteriana en solución. Ambos protocolos tienen fortalezas y debilidades y se pueden optimizar para ayudar a determinar con precisión la eficacia de los tratamientos de dispersión.

Introducción

El aumento de la resistencia a los antibióticos en todo el mundo está llevando a la falta de opciones de antibióticos para tratar una variedad de infecciones bacterianas¹. Además de la resistencia a los antibióticos, las bacterias pueden ganar tolerancia a los antibióticos mediante la adopción de un estilo de vida asociado a la^{biopelícula 2}. Una biopelícula es una comunidad de microorganismos que están protegidos por una matriz de polisacáridos, ADN extracelular, lípidos y proteínas^3,denominada colectivamente sustancia polimérica extracelular (EPS). A medida que continúa la crisis de resistencia a los antibióticos, se necesitan urgentemente nuevas estrategias que prolonguen el uso de antibióticos o potencien su eficacia. Los agentes anti-biopelículas son una solución prometedora⁴.

Entre las diferentes estrategias anti-biopelículas que se han propuesto, la utilización de agentes de dispersión, que se dirigen a diferentes componentes de la EPS de la biopelícula, están a la vanguardia del desarrollo terapéutico^5. Las hidrolasas de glucósido (GH) son una de esas clases de agente de dispersión. Gh son una gran clase de enzimas que catalizan la escisión de diferentes enlaces dentro de los polisacáridos que proporcionan integridad estructural a la EPS. Nuestro grupo, así como otros, han demostrado que la GH puede degradar eficazmente las biopelículas, inducir la dispersión y mejorar la eficacia de los antibióticos para una serie de especies bacterianas diferentes, tanto in vitro como in vivo^{6,7,8,9,10,11.}

Con un creciente interés en la dispersión de biopelículas, es importante desarrollar métodos efectivos que evalúen la eficacia de la dispersión. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el tratamiento de las infecciones de heridas asociadas a biopelículas con un agente de dispersión en ratones, y la evaluación de la eficacia de la dispersión, in vivo y ex vivo. El objetivo general es proporcionar métodos efectivos que se puedan utilizar con modelos preclínicos para medir la dispersión de biopelículas de manera efectiva y eficiente.

Un modelo quirúrgico murine de la infección de la supresión fue utilizado en estos estudios para establecer una infección biofilm-asociada. Hemos utilizado este modelo durante más de 15 años y publicado nuestras observaciones ampliamente^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21.} En general, este es un modelo de infección no letal donde las bacterias permanecen localizadas en el lecho de la herida y están asociadas al biofilm (bacterias que se ven en agregados rodeados de EPS), estableciendo una infección crónica que dura hasta 3 semanas. Sin embargo, si los ratones están inmunodeprimidos (con diabetes tipo 1, por ejemplo), pueden volverse más susceptibles a desarrollar una infección sistémica fatal en este modelo.

En este informe, proporcionamos protocolos para evaluar la dispersión de bacterias de una herida, tanto in vivo como ex vivo. Ambos protocolos se pueden utilizar para examinar la eficacia de un agente de dispersión y tienen sus propias fortalezas y debilidades. Por ejemplo, evaluar la dispersión in vivo puede proporcionar información importante en tiempo real sobre la propagación de bacterias a otras partes del cuerpo después de la dispersión, y cómo responde el huésped. Por otro lado, evaluar la dispersión ex vivo puede ser más deseable para la detección de múltiples agentes, dosis o formulaciones, ya que el tejido se puede dividir en múltiples secciones que se pueden probar por separado, reduciendo así el número de ratones requeridos. Al evaluar múltiples agentes, normalmente medimos la dispersión primero in vitro como se describió anteriormente ^6,9,22. Luego probamos el más efectivo ex vivo y reservamos la prueba in vivo para un número limitado de agentes muy prometedores.

Protocolo

Este protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Texas Tech (número de protocolo 07044). Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Preparación de bacterias para infecciones de ratón

NOTA: Aquí describimos la infección de ratones sólo con Pseudomonas aeruginosa. Sin embargo, otras especies bacterianas se pueden utilizar para causar la infección. Las cepas y materiales bacterianos se detallan en la Tabla de Materiales.

1. Utilizar Pseudomonas aeruginosa cepa de tipo salvaje PAO1 portadora del plásmido de luminiscencia pQF50-lux²³ para estos experimentos como se describió anteriormente^7.
2. Cultivar cepas de P. aeruginosa en matraces Erlenmeyer desconcertados, con agitación a 200 rpm, en caldo Luria-Bertani (LB) a 37 °C durante 16 a 20 h. Añadir una concentración final de 100 μg/mL de ampicilina al cultivo nocturno de PAO1(pQF50-lux) para el mantenimiento del plásmido.
3. Subcultivo P. aeruginosa añadiendo 100 μL del cultivo nocturno a un matraz Erlenmeyer que contiene 10 mL de caldo LB con una concentración final de 100 μg/mL de ampicilina. Luego crecer durante 2-2.5 h a 37 °C con agitación, a un OD_{600 nm} de 0.4, y luego diluir en serie (1:10) tres veces para una dosis infectante de aproximadamente 10⁴ células.

2. Preparación de la enzima de dispersión de biopelículas

NOTA: Para este estudio utilizamos una solución al 10% de partes iguales de amilasa y celulasa (5% de cada una), que se denominará "GH", para el tratamiento de dispersión.

1. Utilice una solución de GH al 10% (p/v) de amilasa (de Bacillus subtilis)y celulasa fúngica (de Aspergillus niger)diluida en solución salina de tampón de fosfato 1x (PBS). Utilice PBS como tratamiento de control del vehículo.
2. Calentar todos los tratamientos a 37 °C durante 30 min para la activación de enzimas.

3. Animales de experimentación y configuración preoperatoria

1. Ratones domésticos, 5 compañeros de camada por jaula, en condiciones controladas por el ambiente, con ciclos de luz/oscuridad de 12 h y acceso adecuado a alimentos y agua.
2. Preferiblemente, utilice ratones Webster suizos hembra, entre 8 y 10 semanas de edad.
3. Pesar ratones para determinar la cantidad adecuada de anestesia para administrar.
4. Administrar anestesia mediante la inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina 10 mg/kg de xilazina.
5. Aplique crema para los ojos (por ejemplo, Refresh P.M.) cuidadosamente sobre el ojo usando un hisopo de algodón para reducir la sequedad.
6. Controle los parámetros fisiológicos incluyendo ritmo respiratorio, coloración de la piel, y temperatura corporal a través de la cirugía.

4. Cirugía de escisión de espesor completo dorsal

1. Evaluar el plano quirúrgico de la anestesia por pellizco en el dedo del dedo deldo del sistema y la supervisión de la frecuencia respiratoria y del esfuerzo. Afeitarse la superficie dorsal y aplicar una crema depilatoria durante 10 minutos (o según las instrucciones del producto), después de lo cual retirar suavemente, asegurando que la piel estaba seca.
2. Para el manejo del dolor, administre 0,05 mL de lidocaína por vía subcutánea en el área a extirpar e inyecte 0,02 mL de buprenorfina por vía subcutánea en el cuello. Espere 10 minutos para asegurarse de que se alcanzó el manejo del dolor.
3. Antes de la escisión, desinfecte la superficie dorsal con un hisopo de alcohol y dibuje un círculo de 1,5 cm de diámetro hacia la parte posterior de la espalda. Mantenga un campo quirúrgico estéril durante todo el procedimiento y use instrumentos en autoclave y guantes estériles. Para limitar la contaminación, realice la cirugía con un quemador Bunsen encendido y use herramientas limpias para cada animal.
4. Administre una herida de piel de espesor completo y escisión al nivel del músculo panniculus con tijeras quirúrgicas.
5. Después de la supresión, cubra inmediatamente las heridas con un apósito de poliuretano semipermeable.
6. Inyecte aproximadamente 10⁴ UFC de bacterias en 100 μL de PBS debajo del apósito, en el lecho de la herida, para establecer una infección.
   NOTA: Las heridas también pueden infectarse con múltiples especies de bacterias y/u hongos simultáneamente, o colocando biopelículas pre-formadas^12,o incluso tejido de desbridamiento extraído de pacientes^19,en el lecho de la herida.
7. Después de la infección, coloque a los ratones en jaulas con almohadillas de calefacción y vigile hasta que recuperen su reflejo derecho.
   NOTA: Asegúrese de que los ratones no se enfríen, ya que esto puede llevar a la muerte.
8. Establecer infecciones de heridas durante 48 h.
9. Inspeccione los apósitos adhesivos diariamente para los rasgones y las áreas de la no-adherencia y substituido si es necesario.

5. Tratamiento de dispersión in vivo

NOTA: Aquí describimos la administración de los agentes dispersantes mediante la aplicación de una serie de 3 soluciones tópicas de irrigación de heridas(Figura 1). Sin embargo, el protocolo se puede adaptar para otros tipos de parto como la aplicación de geles, cremas o aderezos.

1. Coloque ratones bajo anestesia con isoflurano (al 3% y 1 L por minuto de oxígeno) mientras administra los tratamientos.
2. Preparar tres jeringas de 1 ml, con agujas de 25 G, que contengan 200 μL de tratamiento para cada ratón.
3. Inyecte 200 μL de solución enzimática o control de PBS sobre la herida levantando y pellizcando cuidadosamente la piel con pinzas, ligeramente por encima de la herida hacia la cabeza del animal. Perfore cuidadosamente la jeringa a través de la piel levantada e inyecte lentamente la solución entre el apósito y el lecho de la herida. El apósito utilizado en este estudio a menudo se adhiere tanto al lecho de la herida como al tejido circundante.
   1. Para asegurarse de que todo el lecho de la herida esté cubierto por una solución, levante suavemente el apósito con las fuerzas, alejándolo del lecho de la herida, mientras inyecta lentamente la solución.
4. Después del tratamiento, coloque a los ratones de nuevo en sus jaulas durante 30 minutos.
5. Después de 30 minutos de exposición al tratamiento, vuelva a anestesiar a los ratones con isoflurano y aspire la solución con una jeringa, asegurándose de perforar en la misma área que antes.
   NOTA: Esta solución aspirada contiene células bacterianas dispersas, que pueden guardarse para varios análisis aguas abajo.
6. Administrar el segundo y tercer tratamiento de riego como el primero, utilizando una jeringa nueva cada vez.

6. Imágenes y análisis de dispersión in vivo

NOTA: Si se utiliza una cepa luminiscente de bacterias para iniciar la infección, se puede utilizar un sistema de imágenes in vivo (IVIS) para visualizar la dispersión desde el lecho de la herida.

1. Imagen de ratones inmediatamente antes y después del tratamiento y a las 10 y 20 h después del tratamiento (Figura 2 y Figura Suplementaria 1).
2. Realice la proyección de imagen mientras que los ratones están bajo anestesia colocándolos individualmente en el IVIS y proyección de imagen cada uno para 5 s en una longitud de onda de 560 nanómetro. Guarde las imágenes para su posterior análisis.
   NOTA: La longitud de onda y el tiempo de exposición óptimos dependerán del reportero utilizado y del instrumento IVIS y del software de imágenes.
3. Para el análisis, abra las imágenes en el software IVIS y seleccione el área a analizar en la Paleta de herramientas.
4. Para tener en cuenta el fondo, coloque un círculo en el fondo de una foto y luego coloque el mismo círculo del tamaño en la parte superior de la cama de la herida para cada ratón.
5. Para cargar valores de medición, seleccione Ver -> medidas de región de interés (ROI) y cargue la tabla de mediciones en una hoja de cálculo. Reste la lectura del círculo de fondo de cada una de las mediciones del lecho de la herida para calcular la luminiscencia de cada muestra. Calcular el porcentaje de luminiscencia cambiado por:
   ROI pre-tratamiento-ROI post-tratamiento/ ROI pre-tratamiento) x 100.
   NOTA: Los ratones de control y tratados deben analizarse simultáneamente para normalizar las variables que pueden afectar la adquisición de la imagen o la luminosidad.

7. Evaluación de la dispersión mediante la determinación de la UFC

1. Eutanasia humanamente ratones mediante la inyección intraperitoneal de 0,2 mL de pentobarbital sódico (p. ej., Fatal Plus) bajo anestesia con 100 mg/kg de ketamina 10 mg/kg de xilazina.
2. Coseche el tejido del lecho de la herida quitando primero suavemente el apósito con fórceps estériles, y después corte alrededor del perímetro de la cama de la herida con las tijeras quirúrgicas estériles. Levante suavemente un extremo del lecho de la herida con las lórceps mientras usa tijeras para cortar / burlarse de la muestra lejos de la capa muscular.
3. Coloque el tejido del lecho de la herida en un tubo de homogeneización de 2 mL premarcado y prepesado que contenga 1 mL de PBS. Pesar los tubos de nuevo después de insertar las muestras, y luego invertir suavemente 3-5 veces para enjuagar cualquier bacteria dispersa o poco adherida, y retire el PBS. Añadir 1 mL de PBS fresco.
4. Con el fin de cosechar los bazos, coloque a los ratones en una posición anatómica supina y asegurar fijando sus extremidades a una superficie de disección. Remoje el área a diseccionar con etanol al 70% para desinfectar el área y evitar que el pelaje contamine la muestra.
5. Haga cuidadosamente una pequeña incisión perpendicular a la línea media con tijeras quirúrgicas en la dermis de la parte inferior del abdomen, asegurándose de levantar y alejar la piel de los órganos internos. Continúe la incisión interiormente, a lo largo de la línea media, hasta que se alcance el esternón. Una vez que la cavidad peritoneal fue expuesta y los órganos internos eran visibles, separe suavemente el bazo del tejido conectivo y colóquese en un tubo separado de la homogeneización.
6. Pesar el bazo y enjuagar con PBS, como se describe para el tejido de la cama de la herida.
   NOTA: Otros órganos de interés pueden ser cosechados de manera similar.
   1. Al hacer la incisión inicial, tenga cuidado de evitar perforar los intestinos u otros órganos.
7. Homogeneizar muestras en tubos de molino de perlas precargados de 2 mL utilizando un homogeneizador de sobremesa a 5 m/s durante 60 s, dos veces.
8. Para enumerar la UFC, diluya en serie las muestras y la placa puntual en agar selectivo. Para la dilución en serie, pipetee 100 μL de la muestra en 900 μL de PBS en un tubo de 1,5 mL, vórtice, y repita 5 veces. Pipeta 10 μL de cada dilución sobre una placa de agar como se muestra en la Figura 3.
   NOTA: Si se requiere una cuantificación de UFC más precisa, esparcir 100 μL de cada dilución de la muestra a través de placas de agar separadas.

8. Evaluación ex vivo de la dispersión ( Figura4)

1. Hiere ratones e infecta con aproximadamente 10⁴ PAO1 como se describió anteriormente, y luego eutanasia 48 h después de la infección.
2. Retire cuidadosamente el apósito con pinzas, utilizando técnica estéril y sin perturbar el lecho de la herida.
3. Use tijeras quirúrgicas estériles para cortar el perímetro del lecho de la herida lejos de la piel no infectada mediante el uso de fórceps para levantar un extremo del lecho de la herida y tijeras para extirpar el tejido infectado de la herida de la capa muscular debajo y el tejido no infectado circundante. Divida las muestras del lecho de la herida en partes iguales o use entero.
4. Coloque el tejido de la herida en tubos de homogeneización de molinos de perlas vacíos y prepesados de 2 mL. Luego, vuelva a pesar los tubos después de agregar la muestra. Calcule el peso de la muestra por:
   peso después de agregar la muestra - peso antes de agregar la muestra.
5. Agregue 1 mL de PBS e invierta suavemente el tubo 3-5 veces para enjuagar la muestra y eliminar cualquier célula planctónica. Quite y descarte el PBS.
6. Añadir 1 mL de tratamiento con GH (o PBS como control negativo) a la muestra e incubar durante 2 h a 37 °C con agitación a 80 rpm.
7. Retire la solución de dispersión de biopelículas y colóquela en un tubo separado de 1,5 mL. Esto contiene las celdas dispersas.
8. Agregue 1 mL de PBS a la muestra de tejido restante e invierta suavemente 3-5 veces para enjuagar las células dispersas restantes. Quite y descarte el PBS.
9. Añadir 1 mL de PBS al tejido restante y homogeneizar a 5 m/s durante 60 s utilizando un homogeneizador de sobremesa.
10. Diluir en serie la solución de células dispersas y la muestra de tejido homogeneizado colocando 100 μL de muestra en 900 μL de PBS en un tubo de 1,5 mL, y repitiendo cinco veces para un total de 6 diluciones.
11. Placa puntual de 10 μL de cada dilución en agar selectivo de medios (por ejemplo, Agar aislamiento de Pseudomonas para P. aeruginosa)e incubar las placas a 37 °C durante la noche.
12. Cuente la UFC y calcule el "porcentaje disperso" como (UFC en sobrenadante/ (UFC en sobrenadante + UFC en el tejido de biopelícula)) x 100.

Resultados

En este experimento, 8-10 ratones suizos suizos hembra de la semana de edad Webster fueron infectados con^{10 4} UFC de PAO1 que lleva el plásmido de luminiscencia pQF50-lux. Según lo descrito arriba, una infección fue permitida establecer para 48 h antes de administrar 3 x 30 tratamientos mínimos de PBS (control del vehículo) o del 10% GH (tratamiento) para digerir el biofilm EPS. Los ratones fueron fototratado pretratamiento, directamente después del tratamiento (0 h) y en 10 h y 20 h post-tratamiento.

Discusión

Aquí se describen los protocolos que se pueden utilizar para estudiar la eficacia de los agentes de dispersión de biopelículas. Estos protocolos se pueden adaptar fácilmente para su uso con diferentes tipos de agentes de dispersión, especies bacterianas o muestras ex vivo, incluidas las muestras de desbridamiento clínico. Este protocolo también proporciona un modelo clínicamente relevante para recolectar y estudiar células bacterianas dispersas. Se ha demostrado que los fenotipos de las células bacteri...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment