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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y transfectar el iris primario y las células epiteliales pigmentarias de la retina de varios mamíferos (ratones, ratas, conejos, cerdos y bovinos). El método es ideal para estudiar los enfoques de terapia génica ocular en varias instalaciones para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos.

Resumen

La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es la causa más frecuente de ceguera en pacientes >60 años, afectando a ~ 30 millones de personas en todo el mundo. La DMAE es una enfermedad multifactorial influenciada por factores ambientales y genéticos, que conducen a un deterioro funcional de la retina debido a la degeneración de las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) seguida de la degradación de los fotorreceptores. Un tratamiento ideal incluiría el trasplante de células RPE sanas que secretan factores neuroprotectores para prevenir la muerte celular RPE y la degeneración de los fotorreceptores. Debido a las similitudes funcionales y genéticas y la posibilidad de una biopsia menos invasiva, se propuso el trasplante de células epiteliales pigmentarias del iris (IPE) como sustituto del EPR degenerado. La secreción de factores neuroprotectores por un bajo número de células trasplantadas subretinalmente se puede lograr mediante la transfección mediada por transposón de la Bella Durmiente (SB100X)con genes que codifican para el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y / o el factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF). Establecimos el aislamiento, el cultivo y la transfección mediada por SB100Xde células RPE e IPE de varias especies, incluidos roedores, cerdos y ganado. Se explantan globos y se extrae la córnea y el cristalino para acceder al iris y la retina. Usando una espátula hecha a medida, las células IPE se eliminan del iris aislado. Para cosechar células RPE, se puede requerir una incubación de tripsina, dependiendo de la especie. Luego, usando espátula personalizada por RPE, las células se suspenden en medio. Después de la siembra, las células son monitoreadas dos veces por semana y, después de llegar a la confluencia, transfectadas por electroporación. La integración génica, la expresión, la secreción de proteínas y la función se confirmaron mediante ensayos qPCR, WB, ELISA, inmunofluorescencia y funcionales. Dependiendo de la especie, se pueden aislar 30.000-5 millones (RPE) y 10.000-1,5 millones de células (IPE) por ojo. Las células modificadas genéticamente muestran una sobreexpresión significativa de PEDF/GM-CSF con la capacidad de reducir el estrés oxidativo y ofrece un sistema flexible para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos para desarrollar enfoques de terapia génica ocular.

Introducción

Nuestro grupo se centra en el desarrollo de enfoques regenerativos para tratar la degeneración neurorretinina, es decir, la DMAE, mediante la terapia génica no viral basada en RPE e IPE. El establecimiento preclínico de tales terapias requiere modelos in vitro transferibles a los seres humanos. Por lo tanto, el objetivo del estudio presentado aquí es entregar protocolos para el aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células primarias de RPE e IPE. La razón para establecer el aislamiento de células de PE de múltiples especies es confirmar sólidamente la seguridad y la eficiencia del enfoque y aumentar su reproducibilidad y transferibilidad. La línea celular de EPR humano disponible ARPE-19 difiere de las células primarias (por ejemplo, están menos pigmentadas) y, por lo tanto, es de valor limitado para los análisis preclínicos1. Además, las células de mamíferos no humanos se pueden comprar a un costo menor y en mayores cantidades; el tejido de donante humano se puede obtener de varios bancos de ojos, pero la disponibilidad es limitada y costosa. Por último, los nuevos medicamentos de terapia avanzada (ATMP, es decir, células, tejidos o medicamentos de terapia génica) deben aplicarse en al menos dos especies diferentes antes de ser probados en pacientes y estos estudios in vivo solicitan la preparación de trasplantes de células alogénicas.

Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son la principal causa de ceguera en los países industrializados, que comprenden enfermedades comunes como la DMAE, así como enfermedades raras como la retinosis pigmentaria, en la que la muerte de las células de la retina finalmente conduce a la ceguera. El daño de las células RPE, los fotorreceptores y las células ganglionares de la retina (RGC) puede en algunos casos disminuirse, pero actualmente no hay terapias curativas disponibles. Los ATMP ofrecen el potencial de corregir defectos genéticos, integrar genes terapéuticos o reemplazar células degeneradas, lo que permite el desarrollo de terapias regenerativas y curativas para enfermedades como la DMAE; 13 terapias génicas ya obtuvieron la aprobación de comercialización, incluida una terapia para tratar la degeneración retiniana asociada a la mutación RPE652,3. Entre los adultos mayores (>60 años), ~ 30 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por la DMAE neovascular (nvAMD) o avascular (aAMD)4. Ambas formas son inducidas por desencadenantes asociados a la edad, incluido el daño oxidativo, el deterioro de la función y la pérdida de células RPE, seguidos de la degradación de los fotorreceptores, entre otros (por ejemplo, alelos de riesgo genético, tabaquismo, hipertensión)5,6. En nvAMD, la patogénesis se ve agravada por un desequilibrio de factores angiogénicos y antiangiogénicos a favor del factor de crecimiento endotelial vascular angiogénico (VEGF) que induce la neovascularización coroidea (CNV). Hasta la fecha, solo la nvAMD es tratable mediante inyecciones intravítreas mensuales de inhibidores de la proteína VEGF para suprimir la CNV; todavía no se dispone de un tratamiento eficaz para laAAMD 6,7.

Varios estudios evaluaron las terapias basadas en células para reemplazar la terapia anti-VEGF: los estudios realizados por Binder et al., en los que se trasplantaron células autólogas de EPR recién cosechadas en pacientes con nAMD8,9,10,mostraron una mejoría visual moderada, pero solo un pequeño grupo de pacientes alcanzó una agudeza visual final lo suficientemente alta como para permitir la lectura. Recientemente, un estudio clínico de fase I utilizó un parche de ERP derivado de células madre embrionarias para tratar la DMAE con resultados prometedores; es decir, eficacia, estabilidad y seguridad del parche RPE hasta 12 meses en 2 de los 10 pacientes tratados11. Además, varios grupos han publicado estudios en los que se recolectaron parches autólogos de RPE-Bruch-coroides de la retina periférica y se trasplantaron a la mácula12,13,14; y se generaron parches de EPR derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para trasplante15. Para la AAMD, los anticuerpos dirigidos a la vía del complemento se han probado en ensayos clínicos6,16 y se completó un estudio de fase I utilizando una única inyección intravítrea de un vector viral adenoaso asociado (AAV) que codifica el gen para el factor CD59 (AAVCAGsCD59) en pacientes con atrofia geográfica (GA)17; el estudio de fase II comenzó recientemente y tiene como objetivo reclutar a 132 pacientes con AAMD avanzada y evaluar el resultado a los 2 años posteriores a la intervención18. Finalmente, el grupo de estudio FocuS ha iniciado un ensayo clínico multicéntrico de fase I/II evaluando la seguridad, dosis-respuesta y eficacia de un vector AAV no replicante recombinante que codifica un factor19del complemento humano.

Principalmente, el objetivo de una terapia de DMAE regenerativa es el trasplante de células RPE funcionales, que se dañaron o perdieron. Sin embargo, las células IPE y RPE comparten muchas similitudes funcionales y genéticas (por ejemplo, fagocitosis y metabolismo del retinol), y debido a que las células IPE se cosechan de manera más factible, se han propuesto como un sustituto de RPE20. A pesar de que se ha demostrado previamente que el trasplante de células IPE retrasa la degeneración del fotorreceptor en modelos animales21,22 y estabiliza la función visual en pacientes con nvAMD en etapa final, no se observó una mejoría significativa en estos pacientes23. La falta de eficacia puede deberse al bajo número de células trasplantadas y/o al desequilibrio de los factores neuroprotectores de la retina. Un enfoque alternativo sería trasplantar células epiteliales pigmentarias transfectadas que sobreexpresan factores neuroprotectores para restaurar la homeostasis retiniana, mantener las células RPE restantes y proteger los fotorreceptores y RGC de la degeneración. En consecuencia, proponemos una nueva terapia que comprende el trasplante de células funcionales de EPR o IPE que han sido sometidas a ingeniería genética para secretar proteínas neuroprotectoras y antiangiogénicas, como PEDF, GM-CSF o factores de crecimiento similares a la insulina (IGF). La ventaja de desarrollar y analizar este enfoque en varias especies en lugar de utilizar una línea celular, una sola especie, o tejido humano es: 1) mayor reproducibilidad y transferibilidad de los resultados como lo demuestran numerosos estudios realizados en laboratorios independientes y diferentes especies1,24,25; 2) las células de cerdo o bovino son factiblemente desechables sin el sacrificio de animales adicionales; 3) la disponibilidad de células especialmente porcinas y bovinas permite que grandes series de ensayos produzcan resultados sólidos; 4) el conocimiento para aislar, cultivar y modificar genéticamente células a partir de los modelos más utilizados permite realizar análisis in vivo en múltiples especies24,25,26 y,por lo tanto, ofrece una mejor relación riesgo-beneficio para los primeros pacientes tratados; 5) la flexibilidad del protocolo presentado permite su uso en diversos modelos y conjuntos experimentales y para todas las terapias basadas en células oculares con y sin ingeniería genética. Por el contrario, las técnicas alternativas como las líneas celulares o el tejido humano son solo de transferibilidad limitada y / o desechabilidad limitada. Las líneas celulares como el ARPE-19 son ideales para experimentos preliminares; sin embargo, la baja pigmentación y la alta proliferación difieren significativamente de las células primarias1. Las células RPE e IPE, que se aíslan del tejido de donantes humanos, ofrecen una fuente valiosa para experimentos in vitro transferibles; sin embargo, obtenemos tejido humano de un banco de ojos estadounidense, lo que significa que el tejido tiene al menos dos días de edad (después de la enucleación) y requiere un transporte largo y costoso, pero el tejido del donante local no está disponible en cantidades suficientes para una investigación productiva. La ventaja del uso de células primarias es confirmada por múltiples estudios de otros grupos27,28.

Para el desarrollo de una terapia génica no viral basada en células utilizando el sistema de transposones SB100X para transfectar células primarias de RPE e IPE con los genes que codifican para PEDF y / o GM-CSF para tratar nvAMD y aAMD, respectivamente29,30,31,32, primero establecimos la transfección de células ARPE-191 . A continuación, se establecieron los protocolos de aislamiento y transfección en células primarias bovinas y porcinas de fácil acceso. Ahora, se ha establecido el aislamiento y la transfección de células primarias de RPE e IPE de cinco especies diferentes, desde pequeños (como ratones) hasta grandes mamíferos (como ganado). Se confirmó en células primarias de RPE e IPE derivadas de ojos de donantes humanos30. La producción del ATMP conforme a las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) se validó utilizando también tejido de donante humano33. Finalmente, tanto la seguridad como la eficiencia del enfoque se evaluaron in vivo en tres especies diferentes para las que se ha adaptado el protocolo: ratón, rata y conejo. En la configuración clínica, se extraerá una biopsia de iris del paciente y las células IPE se aislarán y transfectarán en la sala limpia, antes de que las células se trasplanten subretinalmente al mismo paciente. Todo el proceso se llevará a cabo durante una sola sesión quirúrgica que dura aproximadamente 60 minutos. El desarrollo del enfoque de tratamiento y la evaluación de su eficiencia solicitaron excelentes modelos in vitro y ex vivo para implementar métodos de administración de genes robustos y eficientes, para analizar la eficiencia de la entrega de genes, la producción terapéutica de proteínas y los efectos neuroprotectores, y para producir trasplantes celulares para probar el enfoque in vivo1,24,25,29,30 . Cabe mencionar que la terapia cuenta con la aprobación ética para un ensayo de fase clínica Ib/IIa de la comisión ética para la investigación del Cantón de Ginebra (nº 2019-00250) y actualmente los últimos datos preclínicos solicitados para su autorización por las autoridades reguladoras suizas se recopilan utilizando el protocolo presentado. En este sentido, los datos preclínicos in vivo demostraron una reducción significativa de la NVC y una excelente seguridad24,25,31.

Aquí, se describe el aislamiento y cultivo de células RPE / IPE de bovinos, cerdos, conejos, ratas y ratones, y el uso del sistema integrador de transposones SB100X combinado con electroporación como un método eficiente de administración de genes. En particular, las células primarias de PE se transfectaron para sobreexpresar PEDF y GM-CSF. La recogida de estos protocolos permite realizar los estudios in vitro e in vivo en todas las fases preclínicas del desarrollo de ATMP. Además, la configuración tiene el potencial de adaptarse a otros genes de interés y enfermedades.

Protocolo

Los protocolos en los que participaron los animales fueron llevados a cabo por personal certificado y previa autorización del Departamento cantonal de la seguridad, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale de Ginebra, Suiza, y de acuerdo con la Declaración arVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión (aprobación no. GE/94/17). Las ratas adultas sanas de Brown Norway, los ratones C57BL / 6 y los conejos blancos de Nueva Zelanda fueron sacrificados por una sobredosis de Pentobarbital (150 mg / kg) diluido en NaCl inyectado intraperitoneal al 0.9% y los ojos se enuclearon inmediatamente después del sacrificio. Los ojos porcinos y bovinos se obtuvieron de un matadero local dentro de las 6 horas posteriores al sacrificio y se transportaron al laboratorio en hielo.

1. Antes de la preparación

  1. Preparar medio completo (DMEM/Ham's F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 80 U/mL de penicilina / 80 μg/mL de estreptomicina y 2,5 μg/mL de anfotericina B). Calentar el medio, 1x PBS, y 0.25% de tripsina (si es necesario) en un baño de agua a 37 °C.
  2. Coloque una cortina estéril en la capucha para preparar un lugar de trabajo aséptico. Introduzca todos los instrumentos y materiales estériles necesarios dentro de la campana.
    NOTA: Solo la enucleación de los ojos y la limpieza del tejido muscular y la piel restantes son los procedimientos que se llevan a cabo fuera de la capucha, el resto de los pasos deben realizarse dentro de la capucha.

2. Aislamiento de células de PE de rata/ratón

  1. Use tijeras curvas y pórceps Colibri para enuclear los ojos después de la eutanasia del animal. Limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos con tijeras y fórceps (no estériles).
    NOTA: El tamaño de las tijeras y fórceps utilizados para la enucleación y limpieza de los ojos depende de la especie (por ejemplo, para ratas y ratones los instrumentos van a ser más pequeños que los utilizados para cerdos y bovinos) (ver Figura S1).
    1. Recoja los ojos en un tubo de 50 ml lleno de PBS no estéril y transfiera el tubo a la campana de flujo laminar. Desinfecte los ojos sumergiéndolos durante 2 minutos en una solución a base de yodo, luego transfiéralos a una placa de Petri llena de PBS estéril.
  2. Apertura de la bombilla
    1. Después de transferir los ojos a una placa de Petri estéril, sostenga uno firmemente cerca del nervio óptico con Colibri o forrórceps puntiagudos. Perfora un agujero cerca del límite del iris (entre pars plana y ora serrata) con una aguja de 18 G. Inserte tijeras pequeñas en el orificio y corte alrededor del iris. Retire el segmento anterior (córnea, cristalino e iris) y colórelo en una placa de Petri. Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslan las células RPE.
  3. Aislamiento de células IPE
    1. Retire la lente y con fórceps finos saque delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri, lávelo con PBS estéril y déjelo en PBS hasta que se prepare más iris.
    2. Repita los pasos 2.2.1 a 2.3.1 para que todos los ojos estén preparados ese día.
    3. Añadir 50 μL de tripsina al 0,25% por iris e incubar durante 10 min a 37 °C. Retire la tripsina, agregue 150 μL de medio completo por iris y raspe el IPE delicadamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego; use forrórceps finos para inmovilizar el tejido. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Utilice 10 μL de la suspensión celular diluida 1:3 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer34,35.
    4. Si no se transfecta inmediatamente, sembrar 200.000 células/pozo en una placa de 24 pozos (100.000 células/cm2) en 1 mL de medio completo (10% FBS) (para siembra ver Tabla 1). Coloque la placa en una incubadora y cultnémosla a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: Puede ser necesario agrupar varios ojos para tener suficientes células para la siembra.
  4. Aislamiento de células RPE
    1. Elimine el humor vítreo y la retina del segmento posterior con pórceps delgados. Evite dañar el epitelio pigmentario de la retina.
    2. Corta el segmento por la mitad con un bisturí #10 para tener el globo completamente abierto y lávate con PBS estéril.
    3. Añadir 50 μL de tripsina al 0,25% por ojo e incubar durante 10 min a 37 °C. Retire la tripsina y agregue 150 μL de medio completo por globo y raspe las células RPE delicadamente con un bisturí redondo; use forrórceps finos para inmovilizar el tejido. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Tomar 10 μL de la suspensión celular; diluir 1:4 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
    4. Consulte el paso 2.3.4.
      NOTA: Puede ser necesario agrupar varios ojos para tener suficientes células para la siembra.

3. Aislamiento de células de PE de conejo

  1. Realice la limpieza y desinfección como se describe en los pasos 2.1 a 2.1.1.
  2. Ponga un ojo en una compresa de gasa estéril y manténgala firmemente cerca del nervio óptico. Abre el ojo con el bisturí #11 y tijeras unos 2 mm debajo del limbo. Retire el segmento anterior (córnea, cristalino e iris) y colórelo en una placa de Petri. Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslan las células RPE.
  3. Aislamiento de células IPE
    1. Realice el paso 2.3.1. Retire el cuerpo ciliar del iris cortando con un bisturí # 10.
    2. Después de la preparación de 2 iris, incubar con 1 ml de tripsina al 0,25 % a 37 °C durante 10 min; durante este tiempo, las células RPE se pueden aislar (ver paso 3.4). Retire la tripsina y agregue 1 ml de medio completo al iris y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Resuspenda las células cuidadosamente mediante pipeteo y transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:3 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
    3. Consulte el paso 2.3.4.
  4. Aislamiento de células RPE
    1. Realice el paso 2.4.1.
    2. Coloque una gasa estéril en una placa de 12 pozos y coloque la bombilla sobre la gasa.
    3. Lavar con PBS y realizar el paso 2.4.3.
      NOTA: Utilice una pipeta Pasteur curva pulida al fuego.
    4. Centrifugar las células 10 min a 120 x g.
    5. Consulte el paso 2.3.4.

4. Aislamiento de células de EP de cerdo

  1. Realice la limpieza como se describe en el paso 2.1. Lavar con PBS y desinfectar los ojos sumergiéndonos durante 2 min en solución a base de yodo, enjuague con PBS. Continúe con el paso 3.2.
  2. Aislamiento de células IPE
    1. Realice el paso 3.3.1. Después de la preparación de 2 iris, agregue 1 ml de medio completo y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:4 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
    2. Consulte el paso 2.3.4.
  3. Aislamiento de células RPE
    1. Realice el paso 2.4.1. Coloque la bombilla en una placa de Petri y lávese con PBS. Llene la bombilla con 1 ml de medio completo.
    2. Usando una pipeta Pasteur curva pulida al fuego, retire cuidadosamente las celdas de RPE. Asegúrese de raspar de abajo hacia arriba para evitar deslizarse hacia abajo del complejo de membrana coroideo-Bruch. Recoja la suspensión celular dentro del bulbo con una pipeta de 1.000 μL y transfiérala a un tubo de 1,5 ml para la resuspensión. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:8 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
    3. Consulte el paso 2.3.4.

5. Aislamiento de células de PE bovinas

  1. Realice la limpieza como se describe en el paso 2.1. Lavar con PBS y desinfectar los ojos sumergiéndonos durante 2 min en solución a base de yodo, enjuague con PBS. Continúe con el paso 3.2.
  2. Aislamiento de células IPE
    1. Realice el paso 3.3.1. Después de la preparación de dos iris, incubar con 2 ml de tripsina al 0,25% a 37 °C durante 10 min. Durante este tiempo, las células RPE se pueden aislar (ver paso 5.3).
    2. Retire la tripsina y agregue 2 ml de medio completo al iris y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrifugar las células 10 min a 120 x g. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:4 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
    3. Si no se transfecta inmediatamente, sembrar 320.000 células/pozo en una placa de 6 pozos en 3 mL de medio completo (10% FBS) (para la siembra ver Tabla 1). Coloque la placa en una incubadora y cultnémosla a 37 °C, 5% CO2.
  3. Aislamiento de células RPE
    1. Siga el paso 2.4.1. Coloque la bombilla en una placa de Petri y lávese con PBS. Después de la preparación de 2 ojos, llene el bulbo aproximadamente 3/4 con tripsina e incube durante 25 min a 37 ° C con la tapa de la placa de Petri en la parte superior del bulbi.
    2. Retire la tripsina y agregue 1 ml de medio completo. Realice el paso 4.3.2. Centrifugar las células 10 min a 120 x g.
    3. Consulte el paso 5.2.3.

6. Cultivo - cambio medio

  1. Cultite las células en DMEM/Ham's F12, suplementado con 10% de FBS, 80 U/mL de penicilina / 80 μg/mL de estreptomicina y 2,5 μg/mL de anfotericina B, a 37°C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada. Después de 3-4 días, pipetee hacia arriba y hacia abajo para recolectar células no adherentes y coloque la mitad del volumen en otro pozo. Llene hasta 1 ml con medio completo.
    NOTA: Esto permite tener una superficie lo suficientemente grande como para que todas las celdas aisladas se adhieran y maximicen la salida.
  2. Después de otros 3-4 días, repita la recolección de células, pero esta vez agrupando las células no adherentes de dos pozos en un pozo (por ejemplo, A1 + B1 en C1). Agregue medio a todos los pozos. Observe las células y cambie el medio 2 veces por semana (para placas de 6 y 24 pozos use 3 y 1 ml / pozo, respectivamente). Cuando las células alcancen la confluencia, cambie a un medio completo con 1% de FBS o use las células para experimentos (por ejemplo, transfección).
    NOTA: Las células RPE e IPE son confluentes después de 3-4 y 4-5 semanas después del aislamiento, respectivamente. La pureza del cultivo celular fue corroborada comprobando la morfología celular (células pigmentadas) y marcadores específicos según lo descrito por Johnen y colegas36.

7. Electroporación de células primarias de PE

  1. Realizar electroporación como se describe antes1,37.
  2. Dependiendo del número de células transfectadas, utilice placas de 6, 24 o 48 pozos (ver Tabla 2)para sembrar las células en medio sin antibióticos ni antimicóticos. Durante las siguientes 2 semanas, agregue gotas con medio que contenga penicilina (80 U / ml), estreptomicina (80 μg / ml) y anfotericina B (2.5 μg / ml) dos veces por semana. Cambie el medio completamente 2 semanas después de la transfección.
  3. Para determinar el crecimiento celular, la eficiencia de la transfección y la secreción de proteínas, monitoree las células semanalmente por microscopía y analice el sobrenadante de cultivo celular por western blot. Antes de finalizar el cultivo, tome un sobrenadante de cultivo celular de 24 h para cuantificar la secreción de proteínas por ELISA, contar las células, medir la fluorescencia mediante citometría basada en imágenes (en el caso de células transfectadas por Venus)siguiendo las instrucciones de los fabricantes (ver Tabla de materiales)y recolectar el pellet celular para el análisis de expresión génica basado en RT-qPCR.
    NOTA: Estos métodos no están incluidos en el presente trabajo ya que no es el propósito explicar en detalle el análisis de las células sino más bien su aislamiento. La densidad de siembra celular es la misma para todas las especies (100.000 células/cm2),pero debido a que el número de células aisladas varía, se utilizaron diferentes placas. Además, para ratones, ratas y conejos podría ser necesario agrupar 2-3 ojos para tener suficientes células para la siembra.
EspecieTratamiento con tripsinaN° células IPEN° células RPEPlaca para siembra (100.000 células/cm2)
Ratón/rataSí~50,000~150,000Placas de 24 pozos
ConejoSí~350,000~2,500,000Placas de 24 pozos
CerdoNo~1,000,000~3,000,000Placas de 24 pozos
BovinoSí~1,700,000~5,000,000Placas de 6 pozos

Tabla 1: Número de células primarias de PE aisladas de ojos de diferentes especies.

NombreÁreaVolumen medioTripsinaMedio de volumen para detener la acción de la tripsinaDensidad de siembra
Placa de 6 pozos9,6 cm²3,0 ml0,5 ml1,0 ml3x105
Placa de 24 pozos2,0 cm²1,0 ml0,2 ml0,8 ml5x104
Placa de 48 pozos1,1 cm²0,5 ml0,1 ml0,4 ml0,5-1x104

Tabla 2: Volúmenes de cultivo celular y densidades de siembra.

Resultados

Aislamiento de EP de diferentes especies de mamíferos
Utilizando los protocolos antes mencionados, las células IPE y RPE se aislaron y cultivaron con éxito de cinco especies diferentes. El número de células obtenidas de cada procedimiento depende de la especie y el tamaño del ojo (Tabla 1). Como se muestra en la Figura 1,las células muestran la morfología y pigmentación típica de las células de PE (a excepción de las células de conejo mostrad...

Discusión

Contar con métodos estandarizados para aislar y cultivar células de EP es fundamental en el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para las enfermedades degenerativas de la retina. Con los protocolos presentados aquí, las células de PE pueden aislarse con éxito de diferentes especies y cultivarse durante largos períodos (hasta ahora, el cultivo más largo se mantuvo durante 2 años1,38); se observó morfología, pigmentación y función típicas de las...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Un agradecimiento merece a Gregg Sealy y Alain Conti por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Comisión Europea en el contexto del Séptimo Programa Marco, la Fundación Nacional Suiza de Ciencias y la Fundación Schmieder-Bohrisch. Z.I. recibió financiación del Consejo Europeo de Investigación, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] y B.M.W. de una beca de investigación Fulbright y una beca de excelencia del gobierno suizo.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well platesCorning353043
24-well platesCorning353047
48-well platesThermoFisher Scientific150687
6-well plateGreiner7657160
BetadineMundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity AssayPromegaG9291
DMEM/Ham`s F12Sigma-AldrichD8062
Drape (sterile)Mölnlycke Health Care800530
Electroporation buffer 3P.143P Pharmaceutical
FBSBrunschwigP40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compressPROMEDICAL AG25403
NaCl (0.9%)Laboratorium Dr. Bichsel AG1000090
Needle (18G) TerumoTER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µLThermoFisher ScientificMPK1096
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000S
Neubauer chamberMarienfeld-superior640010
Pasteur pipette (fire-polish)Witeg4100150
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)Ospedalia AG31408025
Petri dishThermoFisher Scientific150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-VenusPastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-VenusJohnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Pastor et al., 2018
scarpel no. 10Swann-Morton501
scarpel no. 11Swann-Morton503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) 
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based CytometerThermoFisher ScientificT10796
Trypsin 0.25% ThermoFisher Scientific25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%Sigma-AldrichT4174
Vannas spring scissors curved (sterile)

Referencias

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