Imágenes 3D De Fibras De Colágeno PDL Durante El Movimiento Dental Ortodoncia En El Modelo Murino Mandibular

Resumen

Presentamos un protocolo para generar movimiento dental ortodóncico en ratones y métodos para la visualización 3D de las fibras de colágeno y vasos sanguíneos del ligamento periodontal sin seccionamiento.

Resumen

El movimiento ortodóncico de los dientes es un proceso biológico complejo de remodelación de tejidos blandos y duros alterados como resultado de fuerzas externas. Con el fin de entender estos complejos procesos de remodelación, es fundamental estudiar los tejidos dentales y periodontales dentro de su contexto 3D y, por lo tanto, minimizar cualquier seccionamiento y artefactos tisulares. Los modelos de ratón se utilizan a menudo en biología estructural y del desarrollo, así como en biomecánica debido a su pequeño tamaño, alta tasa metabólica, genética y facilidad de manejo. En principio esto también los convierte en excelentes modelos para estudios relacionados con la odontología. Sin embargo, un impedimento importante es su pequeño tamaño de diente, los molares en particular. Este papel se dirige proporcionando un protocolo paso a paso para generar el movimiento ortodóntico del diente y dos métodos para la proyección de imagen 3D del componente fibroso del ligamento periodontal de una muela de la mandíbula del ratón. El primer método presentado se basa en una configuración del micro-CT que permite la proyección de imagen del realce de la fase de los tejidos frescos del colágeno. El segundo método es un método del claro del hueso usando el cinnamato de etilo que permite la proyección de imagen a través del hueso sin seccionar y preserva fluorescencia endógena. Combinando este método de limpieza con ratones reporteros como Flk1-Cre; TdTomato proporcionó una primera oportunidad de su tipo para obtener imágenes de la vasculatura 3D en la PDL y el hueso alveolar.

Introducción

El proceso biológico subyacente básico en el movimiento ortodóntico del diente (OTM) es el remodelado del hueso. El desencadenante de este proceso de remodelación se atribuye a los cambios en la estructura del ligamento periodontal (PDL) como el estrés de la matriz extracelular (MEC), la necrosis, así como la destrucción y formación de los vasos sanguíneos^1,2,3. Otros posibles desencadenantes de la remodelación ósea alveolar están relacionados con la detección de fuerza por los osteocitos en el hueso, así como la deformación mecánica del propio hueso alveolar; sin embargo, su papel en OTM todavía no está completamente dilucidado^4,5.

A pesar de muchos estudios dirigidos a revelar las relaciones estructura-función de la PDL durante la OTM, aún no se ha definido un mecanismo funcional claro^6,7. La razón principal de esto es el desafío en la recuperación de datos de un tejido suave (PDL) situado entre dos tejidos duros (cemento y hueso alveolar). Los métodos aceptados para recopilar información estructural generalmente requieren fijación y seccionamiento que interrumpen y modifican la estructura de PDL. Además, la mayoría de estos métodos producen datos 2D que, incluso si no están distorsionados, solo dan información parcial y localizada. Puesto que el PDL no es uniforme en su estructura y función, un acercamiento que aborde la estructura intacta 3D del complejo entero del diente-PDL-hueso se autoriza.

Este trabajo describirá un método para generar un OTM en ratones y dos métodos que permiten la visualización 3D de las fibras de colágeno en la PDL sin ningún seccionamiento de la muestra.

Los modelos murinos son ampliamente utilizados para experimentos in vivo en medicina, biología del desarrollo, administración de fármacos y estudios estructurales. Pueden ser modificados genéticamente para eliminar o mejorar proteínas y funciones específicas; proporcionan un control del desarrollo rápido, repetible y predecible; también son fáciles de imagen debido a su pequeño tamaño^8. A pesar de sus muchas ventajas, los modelos de ratón en la investigación dental no se utilizan con frecuencia, especialmente cuando se justifican manipulaciones clínicas, sobre todo debido a los dientes de pequeño tamaño. Los modelos animales como ratas^9,10,11,perros^12,13,cerdos^14,15,16 y monos¹⁷ se utilizan con más frecuencia que los ratones. Con el reciente desarrollo de técnicas de imagen de alta resolución, las ventajas de utilizar un modelo de ratón para descifrar los procesos enrevesados en OTM son numerosas. Este papel presenta un método para generar un movimiento mesial del diente molar en la mandíbula con los niveles constantes de la fuerza que accionan el remodelado del hueso. La mayoría de los experimentos OTM en roedores se realizan en el maxilar, ya que la movilidad de la mandíbula y la presencia de la lengua añaden otro nivel de complejidad. Sin embargo, la mandíbula tiene muchas ventajas cuando se desea la integridad estructural 3D. Se puede diseccionar fácilmente como un hueso entero; en algunas especies se puede separar en dos hemi-mandíbulas a través de la sínfisis fibrosa; es compacto, plano y contiene sólo los dientes sin espacios sinusales. En cambio, el maxilar es una parte del cráneo y estrechamente relacionado con otros órganos y estructuras, por lo que se necesita un seccionamiento extenso para diseccionar el hueso alveolar con los dientes asociados.

Utilizando una cámara de humedad en la casa acoplada a un sistema de carga dentro de un micro-CT de alta resolución que permite la mejora de fase, desarrollamos un método para visualizar tejidos fibrosos frescos en 3D como se describió anteriormente^{9,18, 19,20,21,22,23.} Los tejidos frescos se escanean inmediatamente después de que el animal es sacrificado sin ninguna mancha o fijación, lo que reduce los artefactos tisulares, así como las alteraciones de las propiedades biomecánicas. Estos datos 3D pueden ser utilizados para análisis de distribución y dirección de las fibras como se describe en otra parte¹⁹.

El segundo método 3D entero de la proyección de imagen del tejido presentado aquí se basa en el claro óptico de la mandíbula que permite la proyección de imagen de las fibras de PDL a través del hueso sin ninguna seccionamiento. Curiosamente también permite la visualización de las fibras de colágeno del hueso en sí, sin embargo, esto no se discutirá aquí. En general, hay dos métodos para la limpieza de tejidos. El primero es el claro a base acuosa donde la muestra se sumerge en una solución acuosa con un índice de refracción superior a 1,4 ya sea mediante una simple inmersión, hiperhidratación o incrustación de hidrogel. Sin embargo, este método está limitado en el nivel de transparencia, así como la preservación estructural del tejido y por lo tanto requiere la fijación del tejido. El segundo método que produce muestras altamente transparentes y no requiere fijación es el método de limpieza a base de^{disolventes 24,25}. Se generó un método modificado de compensación a base de solventes basado en etil-3-fenilprop-2-enoato (cinamato de etilo, ECi) para las muestras de la mandíbula. Este método tiene las ventajas de usar el agente de claro no tóxico del alimento-grado, la contracción mínima del tejido, y la preservación de proteínas fluorescentes.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las Directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Harvard (Protocolo nº 01840).

1. Movimiento dental ortodóncico

1. Para generar una cama de ratón, utilice una plataforma de plástico plana con un reposacabezas en forma de cuña, 45 ° en ángulo. El reposacabezas se puede generar cortando una caja de plástico.
   1. Eleve el extremo de la cabeza de la plataforma para generar un ángulo de aproximadamente 30° entre el reposacabezas y el plano de la mesa. Coloque un clip de papel grueso doblado (0,036 " de diámetro) al extremo del lado de la cabeza para sostener los incisivos superiores.
   2. En el extremo de la cola, genere una superficie elevada a la que se pueda unir una cadena de potencia de ortodoncia para sostener los incisivos inferiores. Consulte la figura 1 para obtener un ejemplo de plataforma.
2. Anestesiar ratón mediante inyección intraperitoneal de xilazina a 10 mg/kg y ketamina a 100 mg/kg utilizando jeringa de 1 mL y una aguja calibre 27.
3. Coloque el ratón anestesiado en una plataforma hecha a medida e inmovilice la mandíbula superior enganchando los incisivos superiores en el bucle del clip. Abra la mandíbula inferior del ratón con la cadena de potencia de ortodoncia enganchada a los incisivos inferiores. Mantenga las mejillas retraídas con el retractor bucal mini-colibri.
4. Coloque la plataforma bajo un microscopio quirúrgico o cualquier otro estereoscopio que pueda alcanzar un aumento de 5-6x.
5. Aplique 50 μL de solución salina (aproximadamente 1 gota) en los ojos del ratón para prevenir la deshidratación corneal. Reponer solución salina cada 20 min.
6. Cortar una pieza de un alambre de aluminio (0,08 mm de diámetro) de 1 cm de longitud. Deslice el alambre desde el lado bucal lingualmente en el área interproximal debajo del punto de contacto entre el primer y segundo molar usando un porta agujas microquirúrgicas. Dejar 2 mm de borde libre delante del primer molar para ser roscado en el extremo del resorte.
7. Corte un pedazo de bobina de titanio de níquel (NiTi), alrededor de 7 a 9 hilos de longitud.
   NOTA: Las propiedades elásticas de la bobina proporcionarán una fuerza constante para el movimiento de ortodoncia. La longitud total no reñida de la bobina debe ser más corta que el espacio entre el incisivo y el molar. Tenga en cuenta que se necesitan 2 hilos adicionales en cada extremo para anclar la bobina al diente. El alambre de aluminio se selecciona para reducir los artefactos de exploración tales como endurecimiento del haz durante la exploración del micro-CT.
8. Inserte el resorte helicoidal NiTi (0,15 mm de diámetro de alambre, 0,9 mm de diámetro de bobina interior; entrega una fuerza de 10 g) entre el primer molar inferior y el incisivo inferior. Utilice la ligadura del alambre insertada alrededor del primer molar en el paso 1.6, gire el alambre firmemente alrededor de 2 hilos del resorte helicoidal para fijar la bobina en el lado molar.
9. Para asegurar un nivel de fuerza uniforme, utilice exactamente 3 hilos activos entre el primer molar y el incisivo. Retire temporalmente la cadena de alimentación del incisivo y coloque de 2 a 3 hilos no ajustados sobre el incisivo para anclar la bobina. Deslice los hilos hacia abajo hasta el margen gingival libre de incisivos.
10. Coloque una capa de resina compuesta fluible en el borde incisal de la bobina y cúrtela con luz de curado dental. Substituya la cadena de alimentación después de curar la resina.
11. Usando la misma luz de curado, caliente la bobina de NiTi durante 20 s. Esto apretará la bobina de NiTi. La colocación terminada se muestra en la Figura 1C.
12. Deje intacto el lado contralateral o inserte una farsa como el alambre entre el primer y segundo molar.
13. Coloque el ratón anestesiado bajo una luz calentada para mantenerlo caliente hasta la recuperación.
14. Coloque el ratón de nuevo en una jaula individual y monitoree diariamente. No es necesario ningún cambio en la dieta durante el movimiento de ortodoncia.
    NOTA: El dispositivo OTM en un lado causa algunas molestias, pero no perjudica la alimentación. Sin embargo, no se recomienda insertar dispositivos en ambos lados debido a la cantidad adicional de molestias. La medicación para el dolor no es necesaria a menos que se vean signos externos de dolor.

2. Exploración micro-CT de fibras pdl en hemi-mandíbulas frescas

1. Montaje de la mandíbula hemi (Figura 2)
   1. Después de la duración deseada del movimiento de ortodoncia, sacrificar el ratón a través de la dislocación cervical. Retire la mandíbula y separe en hemi-mandíbulas.
      NOTA: Dado que la muestra no se fijará, es fundamental realizar la disección de la mandíbula y el montaje lo antes posible, idealmente dentro de los 30 min.
   2. Retire suavemente el tejido blando circundante con una toallita limpia sin pelusas.
   3. Retire el dispositivo de ortodoncia usando tijeras microquirúrgicas y pinzas bajo un microscopio estéreo con al menos 4x de aumento.
   4. Mantenga la muestra húmeda en un tubo de microcentrifuga de volumen de 1,5 mL junto con una pieza de toallita sin pelusa humedecida con agua.
   5. Coloque la resina compuesta dental empaquetable en la ranura de muestra en el escenario, luego coloque la mandíbula hemi fresca en el compuesto. Antes de montar, asegúrese de que la superficie ósea en contacto con el compuesto dental esté libre de cualquier tejido blando y seca, de lo contrario el compuesto dental no se curará correctamente.
   6. Ajuste la posición de la mandíbula hemi hasta que el primer molar esté centrado en el surco de la línea media del escenario. Asegúrese de que la superficie oclusal sea horizontal. Cure el compuesto cuando esté satisfecho con el posicionamiento.
      NOTA: Se pueden colocar pequeñas cantidades adicionales de compuestos dentales en los lados de la mandíbula hemi y / o a través del incisivo para ayudar a estabilizar la muestra.
   7. Coloque la toallita húmeda sin pelusas dentro de las piscinas de humedad en la etapa de muestra. Coloque el compuesto dental en la superficie oclusal del primer molar. Antes de cerrar la cámara, asegúrese de que nada bloquee la trayectoria de rayos X a nivel de la muestra.
   8. Coloque la cámara en el micro-CT. Atornille la cámara en la etapa de muestra de micro-TC para que se minimice el movimiento durante la toma de imágenes.
   9. Encienda los rayos X y tome imágenes 2D mientras baja el yunque verticalmente, hasta que la punta del yunque esté rodeada por el compuesto pero no se detecte ningún aumento en la fuerza.
   10. Una vez que el yunque está incrustado en el compuesto, cierre la fuente de rayos X. Luego, abra la cámara micro-CT y cure el compuesto a través de la ventana de plexiglás transparente.
2. Configuración de micro-TC
   1. Ajuste el voltaje de la fuente a 40 kV y la corriente a 200 μA. Utilizando un detector de aumento de 10x, coloque la muestra dentro del marco de visión. Utilice la agrupación de 2 para las imágenes capturadas.
      NOTA: Dado que la PDL es significativamente menos densa que el hueso y el diente, la visualización de la PDL requiere mayor potencia y tiempo de exposición. Este protocolo proporcionará la configuración para visualizar la PDL.
   2. Establezca el tiempo de exposición de una sola imagen en 25 s. Establezca la rotación de la etapa de muestra en un rango de 183 grados o más. Establezca el escaneo para 2500 proyecciones. No utilice ningún filtro de fuente de rayos X, las exploraciones resultantes tienen un tamaño de vóxel de 0,76 μm en cada lado.
   3. Recoja una exploración de la referencia para la reconstrucción apropiada según las pautas del micro-CT. Utilice 1/3 número de imágenes de referencia como proyecciones totales. Reconstruya el volumen sin binning adicional, utilizando un algoritmo filtrado de retroproyección.

3. Método de compensación (Figura 3)

1. Prepare cinco tubos de microcentrifugadoras de 1,5 mL.
2. Preparar 1,4 mL de las siguientes soluciones en tubos microcentrifugadores de 1,5 mL: paraformadehído al 4% (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), etanol al 50% (EtOH) en agua desionizada (DI), EtOH al 70% en agua DI y dos tubos de EtOH al 100%.
   Nota : PFA se utiliza para la fijación de la muestra. La limpieza de ECi también funcionará en muestras no fijadas. Para borrar muestras no fijadas, simplemente omita el paso PFA.
3. Coloque la hemi-mandíbula disecada en el 4% PFA. Cubrir con papel de aluminio y colocar sobre el balancín en un ajuste suave a temperatura ambiente durante 6 h.
4. Mueva la mandíbula hemi al 50% de EtOH. Colóctelo sobre el balancín cubierto de luz durante 16 h.
5. Mueva la mandíbula hemi al 70% de EtOH. Colóctelo sobre el balancín cubierto de luz durante 16 h.
6. Mueva la mandíbula hemi a 100% EtOH. Colóctelo sobre el balancín cubierto de luz durante 16 h.
7. Repetir 3.6. en el segundo tubo 100% EtOH.
8. Preparar 5 mL de ECi en un tubo de vidrio o polipropileno.
   NOTA: ECi disuelve el poliestireno, pero no el polipropileno. Además, si no se utiliza un tejido con proteínas fluorescentes, la muestra puede exponerse a la luz durante el procedimiento de limpieza.
9. Mueva la mandíbula hemi al tubo ECi. Cubra el tubo con papel de aluminio y colóquelo sobre el balancín en un ajuste suave durante un mínimo de 12 h.
   Nota : el protocolo puede pausarse aquí. La muestra deshidratada se puede almacenar en ECi a temperatura ambiente. El punto de congelación o fusión de ECi es de 6,5 a 8,0 °C. No almacenar a 4 °C.
10. La mandíbula hemi está lista para la obtención de imágenes con microscopio de fluorescencia.
    NOTA: Durante la toma de imágenes, la muestra debe estar sumergida en el ECi para que permanezca ópticamente transparente.

Resultados

Este papel presenta un método para producir OTM así como dos métodos para la proyección de imagen 3D de las fibras del colágeno dentro del PDL sin ninguna seccionamiento. Para fines de investigación animal, cuando la alineación de los dientes no es necesaria, un movimiento dental se considera ortodoncia si genera la remodelación del hueso alveolar en todos los niveles de la raíz. Se requiere un nivel de fuerza constante aplicado en los dientes para generar un OTM confiable. Aquí, una bobina de NiTi de memoria d...

Discusión

La generación de OTM en ratones es muy deseada debido al tamaño, la genética y las ventajas de manejo. El uso de la mandíbula proporciona un fácil manejo tanto en términos de disección de tejidos como de preparación de muestras e imágenes. Aquí presentamos un método para generar OTM con el movimiento de traslación del diente dentro del hueso en el plazo de 7 días de OTM. Usando este protocolo, la duración total del movimiento del diente se puede extender, ya que la bobina activada entrega un nivel de fuerza...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2