Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Resumen

Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.

Resumen

Comprender los cambios efímeros que ocurren durante el desarrollo y la maduración del cerebro requiere imágenes detalladas de alta resolución en el espacio y el tiempo a resolución celular y subcelular. Los avances en las tecnologías moleculares y de imágenes nos han permitido obtener numerosos conocimientos detallados sobre los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo cerebral en el embrión transparente de pez cebra. Recientemente, los procesos de refinamiento de la conectividad neuronal que ocurren en etapas larvales posteriores varias semanas después de la fertilización, que son, por ejemplo, el control del comportamiento social, la toma de decisiones o el comportamiento impulsado por la motivación, se han trasladado al foco de la investigación. En estas etapas, la pigmentación de la piel del pez cebra interfiere con la penetración de la luz en el tejido cerebral, y las soluciones para las etapas embrionarias, por ejemplo, la inhibición farmacológica de la pigmentación, ya no son factibles.

Por lo tanto, se proporciona una solución quirúrgica mínimamente invasiva para el acceso de microscopía al cerebro del pez cebra despierto que se deriva de enfoques electrofisiológicos. En los teleóstos, la piel y el cartílago blando del cráneo se pueden eliminar cuidadosamente mediante la micro-peeling de estas capas, exponiendo las neuronas subyacentes y los tractos axonales sin daño. Esto permite registrar la morfología neuronal, incluidas las estructuras sinápticas y su contenido molecular, y la observación de cambios fisiológicos como transitorios de Ca²⁺ o eventos de transporte intracelular. Además, es factible el interrogatorio de estos procesos mediante inhibición farmacológica o manipulación optogenética. Este enfoque de exposición cerebral proporciona información sobre los cambios estructurales y fisiológicos en las neuronas, así como la correlación e interdependencia de estos eventos en el tejido cerebral vivo en el rango de minutos u horas. La técnica es adecuada para imágenes cerebrales in vivo de larvas de pez cebra hasta 30 días después de la fertilización, la última etapa de desarrollo probada hasta ahora. Por lo tanto, proporciona acceso a cuestiones tan importantes como el refinamiento sináptico y la escala, el transporte axonal y dendrítico, la orientación sináptica de la carga citoesquelética o la expresión dependiente de la actividad local. Por lo tanto, se puede anticipar un amplio uso para este enfoque de montaje e imágenes.

Introducción

En las últimas décadas, el pez cebra(Danio rerio)ha evolucionado como uno de los organismos modelo de vertebrados más populares para estudios de desarrollo embrionario y larvario. La gran fecundidad de las hembras de pez cebra junto con el rápido desarrollo ex utero del embrión y su transparencia durante las primeras etapas del desarrollo embrionario son solo algunos factores clave que hacen del pez cebra un poderoso organismo modelo para abordar las preguntas del desarrollo¹. Los avances en las tecnologías genéticas moleculares combinados con estudios de imágenes in vivo de alta resolución permitieron abordar los mecanismos biológicos celulares subyacentes a los procesos de desarrollo². En particular, en el campo de la diferenciación neuronal, la fisiología, la conectividad y la función, el pez cebra ha arrojado luz sobre la interacción de la dinámica molecular, las funciones cerebrales y el comportamiento organísmico con un detalle sin precedentes.

Sin embargo, la mayoría de estos estudios se restringen a etapas embrionarias y larvales tempranas durante la primera semana de desarrollo, ya que la transparencia del tejido del sistema nervioso se pierde progresivamente. En estas etapas, el tejido cerebral se ve impedido de acceder por los enfoques de microscopía de alta resolución quedando protegido por la diferenciación y pigmentación del cráneo³.

Por lo tanto, las cuestiones clave de la diferenciación neuronal, la maduración y la plasticidad, como el refinamiento de la conectividad neuronal o la escala sináptica, son difíciles de estudiar. Estos procesos celulares son importantes para definir los mecanismos celulares que impulsan, por ejemplo, el comportamiento social, la toma de decisiones o el comportamiento basado en la motivación, áreas a las que la investigación del pez cebra sobre larvas de varias semanas de edad ha contribuido recientemente con hallazgos clave basados en estudios de comportamiento⁴.

Los enfoques farmacológicos para inhibir la pigmentación en larvas de pez cebra durante varias semanas son apenas factibles o incluso pueden causar efectos perjudiciales^5,6,7,8. Las cepas mutantes dobles o triples con defectos específicos de pigmentación, como casper⁹ o cristal^10,se han convertido en herramientas tremendamente valiosas, pero son laboriosas en la reproducción, proporcionan poca descendencia y plantean el peligro de acumular malformaciones genéticas debido a la endogamia excesiva.

Aquí, se proporciona un procedimiento mínimamente invasivo como alternativa que es aplicable a cualquier cepa de pez cebra. Este procedimiento se adaptó a partir de estudios electrofisiológicos para registrar la actividad neuronal en larvas de pez cebra vivas y despiertas. En los teleóstos, la piel y el cartílago blando del cráneo se pueden eliminar cuidadosamente mediante la micro-peeling de estas capas, ya que no están estrechamente entrelazadas con la vasculatura cerebral. Esto permite exponer el tejido cerebral que contiene neuronas y tractos axonales sin daño y registrar la morfología neuronal, incluidas las estructuras sinápticas y su contenido molecular, que a su vez incluye la observación de cambios fisiológicos como transitorios de Ca^{2 +} o eventos de transporte intracelular durante varias horas. Además, más allá de las caracterizaciones descriptivas, el acceso directo al tejido cerebral permite interrogar las funciones neuronales maduras mediante la administración de sustancias neurofarmacológicas y enfoques optogenéticos. Por lo tanto, las verdaderas relaciones de función de la estructura se pueden revelar en el cerebro juvenil del pez cebra utilizando esta estrategia de exposición cerebral.

Protocolo

Todo el trabajo con animales descrito aquí está de acuerdo con las regulaciones legales (Directiva UE 2010/63). El mantenimiento y la manipulación de los peces han sido aprobados por las autoridades locales y por el representante de bienestar animal de la Technische Universität Braunschweig.

1. Preparación de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), agarosa de baja fusión y agujas de vidrio afiladas

1. Prepare el ACSF disolviendo los productos químicos enumerados a las siguientes concentraciones en agua destilada. 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/mol), 2,1 mM CaCl₂ (110,99 g/mol), 1,2 mM MgCl₂ 6x H₂O (203,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,31 g/mol) y 10 mM d-Glucosa (180,16 g/mol).
   NOTA: Para MgCl_2,CaCl₂y KCl, las soluciones de stock de 1 M se preparan en agua estéril desalada y se almacenan a 4 °C para la posterior preparación de ACSF fresco. La glucosa, hepes y naCl se disuelven como compuestos sólidos en la solución fresca de ACSF. Para disolver productos químicos, siga las instrucciones del fabricante.
2. Ajuste el pH del ACSF a 7,8 con 10 M de NaOH. La preparación de ACSF requiere una medición precisa de los productos químicos y un ajuste fino del pH, ya que reemplaza el líquido cefalorraquídeo y mantiene las condiciones fisiológicas requeridas para que las neuronas sean completamente funcionales, de lo contrario podría causar disfunción cerebral y muerte neuronal.
3. Conservar el ACSF recién preparado a 4 °C durante un máximo de 4 semanas. Para las condiciones de trabajo, alícuota el volumen requerido de ACSF para el día/experimento y precalentarlo a 25-28 °C (y opcionalmente oxigenarlo, paso 2.5)
   NOTA: AsCF recién preparado está bien por 1 día. Si planea usarlo durante varios días, ACSF debe ser filtrado estéril.
4. Para la anestesia posterior de las larvas, prepare una solución de 50 mM de d-tubocurarina en agua destilada y almacene la solución a -20 °C como alícuotas de 100 μL en el congelador hasta que sea necesario.
5. Para incrustar el pescado, prepare agarosa de baja fusión (LM) al 2,5% disolviendo 1,25 g de LM-agarosa(Tabla de Materiales)en 50 ml de ACSF y hierva hasta que la agarosa se disuelva por completo.
   NOTA: Alternativamente, se pueden usar concentraciones más altas o más bajas de LM-agarosa dependiendo de la configuración experimental. Sin embargo, si la agarosa es demasiado suave, no podrá mantener al pez en posición al abrir el cráneo.
6. Almacene la agarosa a 37 °C de baño de agua, para evitar la solidificación y porque esta temperatura tampoco dañará a las larvas al incrustar. Después de que la agarosa hervida se enfríe a 37 ° C en el baño de agua, agregue la cantidad necesaria de d-tubocurarina a la agarosa alicitada necesaria para que el día alcance una concentración de trabajo de 10 μM. Para su uso futuro, guarde la agarosa sobrada a 4 °C para evitar la contaminación.
7. Prepare agujas de vidrio afiladas y delgadas de capilares de vidrio (Figura suplementaria 1) utilizando un tirón de micropipeta con los siguientes ajustes.
   1. Puller I, Capilar tipo 1: Calor 1: 65.8; Calor 2: 55.1; Tirón de 2 pasos
      Puller II, Capilar tipo 2: Calor = 700; Fil = 4; Vel = 55; Del = 130; Pul = 55; Tirón de 1 paso.
      NOTA: Las unidades son específicas para cada cajón y capilar de vidrio utilizados aquí, respectivamente (ver Tabla de Materiales). Otros capilares y tirantes también se pueden utilizar para preparar las agujas de vidrio. Pero las agujas de vidrio no deben ser demasiado delgadas, ya que pueden romperse al entrar en contacto con el cráneo. Capilar: longitud: 100 mm (4 pulgadas); OD: 1,5 mm; IDENTIFICACIÓN: 0,84 mm; filamento: Sí

2. Anestesia de larvas y preparaciones para incrustar

1. Al comenzar el experimento del día, transfiera los animales que se necesitan con una pipeta Pasteur de plástico a una placa de Petri de 90 mm de diámetro, que se llena con Danieau (para larvas que todavía se mantienen en una placa de Petri con Danieau) o agua de la instalación de peces (para larvas que tienen más de 7 dpf y se mantienen en la instalación de peces).
   1. Cuando pipetee peces mayores de 2 semanas, asegúrese de que la abertura de la pipeta sea lo suficientemente grande como para evitar dañar a los peces al transferirlos. No use una red porque dañará físicamente especialmente a las larvas más jóvenes.
2. Añadir rotíferos o nauplios de artemia adecuados para el tamaño de las larvas mantenidas en la placa de Petri, para garantizar el libre acceso a los alimentos y el máximo estado de salud de las larvas y para reducir el estrés.
3. Para la incrustación, transfiera las larvas seleccionadas a una placa de Petri de 35 mm de diámetro llena de ACSF. Agregue el volumen necesario de d-tubocurarina para alcanzar una concentración de trabajo / dosis efectiva de 10 μM y espere unos minutos hasta que las larvas estén completamente inmovilizadas¹¹.
   NOTA: Cuando los peces envejecen o si se necesita una anestesia completa más rápida (menos de 5 min), es posible aumentar la concentración de d-tubocurarina (LD₅₀ para ratones es de 0,13 mg / kg por vía intravenosa¹²). También es posible utilizar un anestésico diferente, como α-bungarotoxina (concentración de trabajo: 1 mg/mL), que tiene el mismo efecto que el curare y también mantiene el cerebro completamente activo¹³. Si un cerebro completamente activo no es necesario para el tema de interés, la tricaína en una dosis no letal (0,02%) también es una opción para anestesiar completamente las larvas. Sin embargo, la tricaína bloquea los canales de sodio, lo que afecta la actividad cerebral¹⁴.
4. Prepare la cámara de montaje tomando la tapa de la placa de Petri de 35 mm de diámetro, voltee la tapa boca abajo y coloque una cubierta de vidrio cuadrada (24 x 24 mm) en la parte inferior de la tapa. Consulte la Figura 1 (parte superior) para obtener una descripción esquemática de estos pasos. La superficie más lisa del vidrio evita el deslizamiento del bloque de agarosa, que contiene las larvas durante el procedimiento de apertura del cráneo.
5. Alícute la cantidad de ACSF necesaria para el día en un vial apropiado (por ejemplo, tubo de 50 ml, precipitado, botella de Schott, etc.) y oxigenarlo con carbógeno (5% CO_2,95% O_2). Si solo se toma imágenes de la morfología (por ejemplo, patrones de fluorescencia), el ACSF sigue siendo necesario para garantizar la integridad del cerebro y que las células no estén influenciadas negativamente por los efectos de la osmolaridad, pero no se necesita la oxigenación del ACSF. Este paso solo debe realizarse cuando la actividad cerebral completa es necesaria para obtener imágenes.
   NOTA: Para una saturación óptima de oxígeno del medio, agregue una piedra de aire al extremo del tubo de carbógeno. Para garantizar un nivel de oxígeno suficientemente alto, es necesario intercambiar el ACSF en las cámaras de imágenes con ACSF recién oxigenado cada 20-60 minutos, dependiendo del número y la edad de las larvas incrustadas en la misma cámara de imágenes (por ejemplo, para una sola larva incrustada, el intercambio de ACSF cada hora es suficiente. Para seis larvas mayores de 14 dpf incrustadas en paralelo, es necesario intercambiar ACSF cada 20 minutos), así que planifique la cantidad necesaria de ACSF saturado de oxígeno de acuerdo con el experimento planificado.

3. Incrustación de las larvas

1. Transfiera las larvas completamente anestesiadas con una pipeta Pasteur de plástico a la cámara de montaje preparada (en el paso 2.4). Luego, retire cuidadosamente el exceso de medio para evitar la dilución de la LM-agarosa. Todos los siguientes pasos deben realizarse bajo un microscopio estereoscópico con suficiente aumento.
   NOTA: Inclinar la cámara de montaje puede ayudar a retirar completamente el medio.
2. Proceda inmediatamente al siguiente paso, agregando una gota de LM-agarosa suficientemente grande sobre las larvas (alrededor de 1 ml, dependiendo del tamaño de las larvas) para proteger a los animales de la desecación y reducir el estrés innecesario.
3. Oriente las larvas en posición antes de que la agarosa se solidifique. Asegúrese de que la parte dorsal de las larvas se dirija hacia arriba. Además, asegúrese de incrustar las larvas lo más cerca posible de la superficie de la agarosa.
   NOTA: Dependiendo del tamaño y el número de larvas planificadas para incrustar al mismo tiempo, es posible ajustar la concentración de agarosa. Por ejemplo, para 1-3 larvas que tienen 30 dpf de edad, se recomienda una concentración de 1.8% -2% LM-agarosa. Para 1-4 larvas que tienen 7 dpf de edad, es más factible usar 2.5% LM-agarosa, mientras que, para 5-8 larvas, 2% es más adecuado. Si se requiere un cerebro completamente activo, se recomienda incrustar solo tres peces al mismo tiempo para reducir el tiempo necesario para operar las larvas. En general, se recomienda utilizar concentraciones más bajas (1,8%-2%) cuanto más viejas sean las larvas o más larvas se planee incrustar al mismo tiempo.
4. Si las imágenes se graban con un microscopio invertido, recorte el bloque de agarosa que contiene las larvas en una pequeña forma cuboide. Esto es importante para transferir las larvas a la cámara de imágenes más adelante. Si se utiliza un microscopio vertical, dicho recorte no es necesario, ya que la cámara de montaje también se puede utilizar como cámara de imágenes. En la Figura 1 (parte superior), se puede encontrar una descripción esquemática de estos pasos.

4. Exponer el cerebro

NOTA: Todos los siguientes pasos deben realizarse con el mayor cuidado para no dañar innecesariamente las larvas. Si se requiere un cerebro completamente activo para el experimento, tenga en cuenta que con cada segundo que pasa, mientras que el pez todavía está completamente montado en agarosa y tiene un cráneo abierto sin ACSF oxigenado, el cerebro sufrirá de falta de oxígeno y también se secará. Los efectos de la deficiencia de oxígeno se volverán aún más dramáticos, cuanto más viejas sean las larvas incrustadas. Por lo tanto, es importante realizar la cirugía no solo en el menor tiempo posible, sino también con la máxima precisión para no evocar daño cerebral mecánico con la aguja. Cuando se entrena, los pasos 4.2-4.4 no deben tomar más de 30 s por pez.

1. Comience la cirugía tan pronto como la agarosa se haya solidificado. Primero, recorte todo el exceso de agarosa por encima de la región cerebral de interés para obtener acceso libre a la cabeza y un espacio de trabajo despejado. Si la parte dorsal de la cabeza ya está sobresaliendo de la agarosa, omita este paso.
2. Dependiendo de la región de interés, elija un lugar para comenzar con la cirugía. Tome la aguja de vidrio y haga una pequeña incisión a través de la piel, pero sin penetrar demasiado profundamente en el tejido. Este será el punto de partida para pelar la piel superpuesta.
   NOTA: Para obtener resultados óptimos, nunca comience directamente por encima de la región de interés para reducir el riesgo de dañar estructuras importantes. Si es necesario, es posible incluso comenzar detrás del cerebro posterior y desde allí trabajar hacia adelante hasta que el área no deseada de la piel se despegue.
3. Continúe con cortes muy pequeños a lo largo de la parte de la piel con el objetivo de eliminar apenas moviendo la aguja justo debajo de la superficie. La mayoría de las veces no es necesario moverse completamente alrededor del cerebro y cortar un pedazo de piel y cráneo en forma de círculo, sino simplemente hacer dos incisiones a lo largo de la cabeza y luego empujar la piel hacia uno u otro lado. La Figura 2 muestra una representación esquemática de la estrategia de corte óptima para obtener libre acceso al cerebelo.
   NOTA: Esta microquirugía es un procedimiento delicado y lo más probable es que necesite un poco de entrenamiento para eliminar perfectamente la piel sin dañar el cerebro subyacente. También se recomienda averiguar la estrategia de corte óptima para la región cerebral de interés y seguir con ella durante el período del experimento.
4. Inmediatamente después de eliminar la piel de todas las larvas incrustadas, proceda vertiendo ACSF (oxigenado) sobre la agarosa para inundar las partículas no deseadas de la piel y la sangre y para mantener el cerebro completamente activo y protegerlo de la resequedad.
   NOTA: Si se necesita un cerebro sano para el experimento, se recomienda ir por un máximo de tres peces a la vez.
5. Si usa un microscopio vertical, comience directamente con las imágenes.
   1. Cuando utilice un microscopio invertido, deslice una pequeña espátula debajo del bloque de agarosa cuboide (paso 3.4).
   2. Agregue una pequeña gota de LM-agarosa al fondo de la cámara de imágenes (por ejemplo, plato con fondo de vidrio) e inmediatamente voltee el bloque de agarosa que contiene las larvas con la espátula durante 180 ° y empuje suavemente hacia el fondo de la cámara de imágenes, mientras que la gota de agarosa líquida actúa como pegamento.
   3. Cuando la agarosa se haya solidificado, llene la cámara de imágenes con ACSF (oxigenado) y luego comience a obtener imágenes. Consulte la Figura 1 (parte inferior) para obtener una descripción esquemática.
6. Cuando se requiera actividad cerebral completa para el experimento, siempre asegúrese de que el ACSF en la cámara de imágenes tenga un nivel de oxígeno suficientemente alto. Para garantizar esto, intercambie el medio cuidadosamente con ACSF recién oxigenado cuando sea posible cada 20-60 minutos (dependiendo del número y tamaño del pez, el tamaño y la superficie de la cámara de imágenes y la duración de la imagen).

Figura 1: Procedimiento esquemático para la preparación de pez cebra de cráneo abierto para imágenes in vivo de manera escalonada. Las instrucciones de trabajo para los diferentes pasos se pueden encontrar en el propio gráfico. Gráfico diseñado por Florian Hetsch y adaptado por Paul Schramm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Representación esquemática detallada de la microquirugía realizada para extirpar trozos de piel y cráneo por encima de la región cerebral de interés. El círculo rojo marca el lugar donde se debe hacer el primer corte. La línea de puntos rojos delinea el camino óptimo para cortar junto con la aguja para obtener acceso libre al cerebelo sin dañarlo. La flecha verde marca la dirección en la que la piel excesiva y las piezas del cráneo se pueden alejar fácilmente. Asegúrese de nunca penetrar en el tejido cerebral durante todo el procedimiento. Después de despegar con éxito la piel, la región cerebral de interés (aquí, cerebelo) será de libre acceso para cualquier tipo de imagen in vivo de alta resolución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Figura 3A,C muestran una larva de 14 dpf de la línea transgénica Tg[-7.5Ca8:GFP]^bz12[15] con el cráneo aún intacto. Las células pigmentarias en la piel superpuesta se distribuyen por toda la cabeza y están interfiriendo con la señal de fluorescencia en la región de interés (aquí, cerebelo). Con la larva en esta condición, no es posible obtener imágenes de alta resolución del cerebro. ...

Discusión

El método presentado proporciona un enfoque alternativo para el aislamiento cerebral o el tratamiento de larvas de pez cebra con productos farmacéuticos que inhiben la pigmentación para registrar imágenes de alta resolución de neuronas en su entorno in vivo. La calidad de las imágenes grabadas con este método es comparable a las imágenes de cerebros explantados, pero en condiciones naturales.

Además, se evita una pérdida de intensidad de fluorescencia, ya que no hay necesida...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride	Roth	A119.1
Confocal Laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
d-Glucose	Sigma	G8270-1KG
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
Glass Capillary type 1	WPI	1B150F-4
Glass Capillary type 2	Harvard Apparatus	GC100F-10
Glass Coverslip	deltalab	D102424
HEPES	Roth	9105.4
Hoechst 33342	Invitrogen (Thermo Fischer)	H3570
Imaging chamber	Ibidi	81156
Potassium chloride	Normapur	26764298
LM-Agarose	Condalab	8050.55
Magnesium chloride (Hexahydrate)	Roth	A537.4
Microscope Camera	Leica	DFC9000 GTC
Needle-Puller type 1	NARISHIGE	Model PC-10
Needle-Puller type 2	Sutter Instruments	Model P-2000
Pasteur-Pipettes 3ml	A.Hartenstein	20170718
Sodium chloride	Roth	P029.2
Sodium hydroxide	Normapur	28244262
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Waterbath	Phoenix Instrument	WB-12
35 mm petri dish	Sarstedt	833900
90 mm petri dish	Sarstedt	821473001