Generación y cultivo de organoides linguales derivados de células madre gustales de ratones adultos

Resumen

El protocolo presenta un método para cultivar y procesar organoides linguales derivados de células madre gustales aisladas de la papila gustal posterior de ratones adultos.

Resumen

El sentido del gusto está mediado por las papilas gustativas en la lengua, que se componen de células receptoras del gusto (TRC) que se renuevan rápidamente. Esta rotación continua es impulsada por células progenitoras locales y hace que la función gustal sea propensa a la interrupción por una multitud de tratamientos médicos, lo que a su vez afecta gravemente la calidad de vida. Por lo tanto, estudiar este proceso en el contexto del tratamiento farmacológico es vital para comprender si y cómo se ven afectadas la función progenitora del gusto y la producción de CVR. Dadas las preocupaciones éticas y la disponibilidad limitada de tejido gustativo humano, los modelos de ratón, que tienen un sistema de sabor similar al de los humanos, se utilizan comúnmente. En comparación con los métodos in vivo, que consumen mucho tiempo, son costosos y no susceptibles de estudios de alto rendimiento, los organoides linguales murinos pueden permitir que los experimentos se ejecuten rápidamente con muchas réplicas y menos ratones. Aquí, se han adaptado protocolos publicados anteriormente y se presenta un método estandarizado para generar organoides del gusto a partir de células progenitoras del gusto aisladas de la papila circunvalada (CVP) de ratones adultos. Las células progenitoras gustales en el CVP expresan LGR5 y se pueden aislar a través de la clasificación celular activada por fluorescencia EGFP (FACS) de ratones portadores de un alelo Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2.} Las células clasificadas se enchan en un sistema de cultivo 3D basado en gel de matriz y se cultivan durante 12 días. Los organoides se expanden durante los primeros 6 días del período de cultivo a través de la proliferación y luego entran en una fase de diferenciación, durante la cual generan los tres tipos de células gustales junto con las células epiteliales no gustales. Los organoides se pueden cosechar al madurar en el día 12 o en cualquier momento durante el proceso de crecimiento para la expresión de ARN y el análisis inmunohistoquímico. La estandarización de los métodos de cultivo para la producción de organoides linguales a partir de células madre adultas mejorará la reproducibilidad y hará avanzar los organoides linguales como una poderosa herramienta de detección de drogas en la lucha para ayudar a los pacientes que experimentan disfunción del gusto.

Introducción

En roedores, las papilas gustativas linguales se alojan en papilas fungiformes distribuidas anteriormente, papilas foliadas bilaterales posteriormente, así como una sola papila circunvalada (CVP) en la línea media posterodorsal de la lengua¹. Cada papila gustativa está compuesta por 50-100 células receptoras del gusto (TRC) de corta duración y rápida renovación, que incluyen células de soporte tipo I similares a las gliales, células tipo II que detectan dulce, amargo y umami, y células tipo III que detectan agrias^2,3,4. En el CVP de ratón, las células madre LGR5⁺ a lo largo de la lámina basal producen todos los tipos de TRC, así como las células epiteliales no gustales⁵. Al renovar el linaje del gusto, las células hijas LGR5 se especifican primero como células precursoras del gusto postmitótico (células tipo IV) que entran en una papila gustativa y son capaces de diferenciarse en cualquiera de los tres tipos de^{CVR 6.} La rápida rotación de los TRP hace que el sistema de sabor sea susceptible a la interrupción por tratamientos médicos, incluida la radiación y ciertas terapias farmacológicas^{7,8,9,10,11,12,13}. Por lo tanto, estudiar el sistema de sabor en el contexto de la regulación de las células madre del gusto y la diferenciación de la CVR es vital para comprender cómo mitigar o prevenir la disfunción del gusto.

Los ratones son un modelo tradicional para los estudios in vivo en la ciencia del gusto, ya que tienen un sistema de sabor organizado de manera similar a los humanos^14,15,16. Sin embargo, los ratones no son ideales para estudios de alto rendimiento, ya que son costosos de mantener y requieren mucho tiempo para trabajar. Para superar esto, en los últimos años se han desarrollado métodos de cultivo de organoides in vitro. Los organoides del gusto se pueden generar a partir de tejido CVP nativo, un proceso en el que los organoides brotan a partir del epitelio CVP aislado de ratón cultivado ex vivo¹⁷. Estos organoides muestran un epitelio multicapa consistente con el sistema de sabor in vivo. Una forma más eficiente de generar organoides que no requiere cultivo cvP ex vivo fue desarrollada por Ren etal. en 2014¹⁸. Adaptando los métodos y medios de cultivo desarrollados por primera vez para cultivar organoides intestinales, aislaron células progenitoras individuales de Lgr5-GFP⁺ de CVP de ratón y las enchaparon en gel de matriz^19. Estas células individuales generan organoides linguales que proliferan durante los primeros 6 días de cultivo, comienzan a diferenciarse alrededor del día 8, y al final del período de cultivo contienen células epiteliales no gustales y los tres tipos de^{CVR 18,20}. Hasta la fecha, se han publicado múltiples estudios que utilizan el sistema modelo de organoides^{linguales 17,18,20,21,22}; sin embargo, los métodos y las condiciones de cultivo utilizados para generar estos organoides varían entre las publicaciones (Tabla suplementaria 1). Por lo tanto, estos métodos se han ajustado y optimizado aquí para presentar un protocolo estandarizado detallado para el cultivo de organoides linguales derivados de LGR5⁺ progenitores de CVP de ratón adulto.

Los organoides linguales proporcionan un modelo único para estudiar los procesos biológicos celulares que impulsan el desarrollo y la renovación de las células gustales. A medida que las aplicaciones de los organoides linguales se expanden y más laboratorios avanzan hacia la utilización de modelos organoides in vitro, es importante que el campo se esfuerce por desarrollar y adoptar protocolos estandarizados para mejorar la reproducibilidad. El establecimiento de organoides linguales como una herramienta estándar dentro de la ciencia del gusto permitiría estudios de alto rendimiento que separan cómo las células madre individuales generan las células diferenciadas del sistema de sabor adulto. Además, los organoides linguales podrían emplearse para detectar rápidamente los medicamentos en busca de posibles impactos en la homeostasis del gusto, que luego podrían investigarse más a fondo en modelos animales. En última instancia, este enfoque mejorará los esfuerzos para diseñar terapias que mejoren la calidad de vida de los futuros receptores de medicamentos.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron en una instalación acreditada por AAALAC de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, la Ley de Bienestar Animal y la Política de Servicio de Salud Pública, y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado. Los ratones Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2} utilizados en este protocolo son de The Jackson Laboratory, Stock No. 008875.

NOTA: Los siguientes pasos deben completarse antes de comenzar para garantizar una progresión suave y oportuna del protocolo: establecer el baño de agua a 37 ° C, configurar la centrífuga a 4 ° C, hacer soluciones enzimáticas de inyección y disociación de las soluciones de stock de 10 mg / ml de dispasa, colagenasa y elastasa (consulte la Tabla de materiales),eliminar el gel de matriz del congelador de -20 ° C (~ 750 μL necesario para una placa de 48 pozos) y descongelar sumergiendo el vial en hielo para en un al menos 3-4 h, tubos de microcentrífuga pre-recubrimiento en FBS sin diluir balanceándose suavemente a temperatura ambiente durante al menos 30 min (dos tubos de 2 ml para la recolección de tejidos, dos tubos de 1,5 ml para células disociadas y un tubo de 1,5 ml para la recolección de células individuales del clasificador celular; elimine el exceso de FBS antes de su uso).

1. Aislamiento del epitelio CVP

NOTA: Para obtener suficientes células LGR5⁺ para una placa completa de 48 pomos, recoja tres CVP Lgr5-EGFP en el mismo tubo y procese simultáneamente. Es importante destacar que cosecha y procesa el CVP de al menos un compañero de camada de tipo silvestre en paralelo en un tubo separado y utilícelo como un control de gating para establecer los parámetros de FACS (consulte Resultados representativos).

1. Eutanasiar a los ratones con asfixia por CO₂ de acuerdo con las regulaciones de la IACUC, seguido de un método secundario aprobado como la toracotomía bilateral, la dislocación cervical, la decapitación o la exsanguinación.
2. Use tijeras de disección estériles grandes para cortar las mejillas y romper la mandíbula. Levante la lengua y corte el frenillo lingual para separar la lengua del piso de la cavidad oral. Cortar la lengua y recogerla en solución salina tamponada con fosfato (dPBS) estéril y helada de Dulbecco con Ca²⁺ y Mg^2+.
3. Retire y deseche la lengua anterior cortando justo la parte anterior de la eminencia intermolar con una cuchilla de afeitar(Figura 1A,línea discontinua). Use una delicada toallita para tareas para eliminar el vello y el exceso de líquido de la lengua posterior.
4. Llene 1 ml de jeringa con 200-300 μL de solución enzimática inyectable (concentración final: 2 mg/ml de colagenasa tipo I y 5 mg/ml de dispasa II en Ca²⁺/Mg²⁺que contenga dPBS, diluida a partir de soluciones madre de 10 mg/ml) e inserte una aguja de 30 G x 1/2 justo encima de la eminencia intermolar(Figura 1B,flecha negra)hasta justo antes de la CVP(Figura 1B, Figura 1B), caja negra). Inyecte la solución enzimática debajo y en los bordes laterales de la CVP entre el epitelio y los tejidos subyacentes (lámina propia, músculo). Retire la jeringa lenta y continuamente de la lengua a medida que se realiza la inyección.
5. Incubar la lengua en dPBS estériles libres de Ca²⁺/Mg²⁺a temperatura ambiente durante exactamente 33 min.
6. Haga pequeños cortes en el epitelio bilateralmente y justo antes de la CVP usando tijeras de disección extra finas, y pele suavemente el epitelio levantándolo con fórceps finas. Una vez que el epitelio de la zanja esté libre del tejido conectivo subyacente, colóquelo en un tubo de microcentrífuga vacío de 2 ml pre-recubierto con FBS. Realice el recorte epitelial antes o después de separar el epitelio CVP(Figura 1C,D).

2. Disociación del epitelio CVP

NOTA: La disociación del epitelio CVP y el chapado se representan gráficamente en la Figura 2.

1. Añadir el cóctel enzimático de disociación (concentración final: 2 mg/mL de colagenasa tipo I, 2 mg/ml de elastasa y 5 mg/ml de dispasa II en Ca²⁺/Mg²⁺que contiene dPBS, diluido a partir de soluciones madre de 10 mg/ml) a los tubos que contienen epitelios CVP pelados (200 μL por CVP). Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 45 min. Vórtice brevemente cada 15 min.
   NOTA: Precalentado 0.25% de Tripsina-EDTA en baño de agua a 37 °C durante los últimos 15 min de incubación del cóctel de enzimas.
2. Después de la incubación, el vórtice (tres pulsos) luego tritura con una pipeta Pasteur de vidrio durante 1 min. Después de que las piezas de tejido se asienten, pipetee el sobrenadante que contiene la primera colección de células disociadas, en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml recubiertos de FBS correspondientes al genotipo. Procese las piezas de tejido restantes como se describe en el paso 2.3. abajo.
   1. Girar el sobrenadante durante 5 min a 370 x g y 4 °C a las células de pellets.
   2. Retire el sobrenadante resultante y resuspante el pellet celular en tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7.0) y 1% FBS en Ca²⁺/ Mg²⁺-libre de PBS (50 μL por CVP)). Almacenar en hielo.
3. Mientras lleva a cabo los pasos 2.2.1 y 2.2.2, disociar las piezas de tejido restantes del paso 2.2 agregando tripsina-EDTA al 0,25% precalentadas (200 μL por CVP) a los tubos originales de microcentrífuga de 2 ml e incube en un baño de agua de 37 °C durante 30 min. Vórtice brevemente cada 10 min.
4. Después de la incubación, vórtice el tubo que contiene piezas de tejido (tres pulsos) y luego triture con una pipeta Pasteur de vidrio durante 1 min. Después de que las piezas de tejido se asienten, pipetee el sobrenadante en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contienen células del paso 2.2.2. Deseche los tubos que contienen las piezas de tejido restantes.
   1. Girar los tubos con células disociadas durante 5 min a 370 x g y 4 °C a células de pellets.
   2. Retire los gránulos de células sobrenadantes y resuspend en FACS Buffer (100 μL por CVP). Almacenar en hielo.
5. Pase las células a través de un filtro de malla de nylon de 30 μm y agregue DAPI_(emisión de λ = 450 nm) a las mezclas celulares antes de FACS. Aislar células Lgr5-GFP⁺ vía FACS utilizando el canal de proteína fluorescente verde_(excitación λ = 488 nm;_emisión λ = 530 nm). Clasificar las células usando una boquilla de 100 μm en un tubo de microcentrífuga fresco recubierto de FBS de 1,5 ml que contenga 300 μL de Ca²⁺/ Mg²⁺ dPBS libre. Coloque las células sobre hielo hasta que se enchapar.

3. Recubrimiento de células Lgr5-EGFP

1. Determine el volumen de suspensión celular LGR5⁺ recibido del citómetro de flujo.
2. En función del número de celdas obtenidas del clasificador, calcule el número de células por μL. Luego, determine el volumen necesario para obtener el número deseado de células para el recubrimiento (usamos 200 células por pozo de una placa de 48 pozos) y transfiera ese volumen total de células suspendidas a un nuevo tubo de microcentrífuga.
3. Gire el tubo durante 5 minutos a 370 x g y 4 °C a las células de pellet (el pellet puede no ser visible). Retire el sobrenadante y coloque el tubo sobre hielo.
4. Resuspenda suavemente el pellet celular en la cantidad adecuada de gel de matriz (15 μL por pozo para placas de 48 pozos); pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para distribuir completamente las células en gel de matriz. Coloque 15 μL de gel de matriz/mezcla celular en el centro de cada pozo. Mantenga el tubo de la microcentrífuga sobre hielo en un tubo cónico de 50 ml durante el recubrimiento para evitar que el gel de matriz se gelifique. Continúe mezclando la mezcla de gel de matriz / célula a lo largo del revestimiento mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo cada tres pozos para garantizar una distribución uniforme de las células a través de los pozos.
5. Coloque la placa en la incubadora (37 ° C, 5% de CO_2,~ 95% de humedad) durante 10 minutos para permitir la gelificación del gel de matriz. Luego, agregue 300 μL de medios WENRAS + Y27632 a temperatura ambiente a cada pozo y devuelva la placa a la incubadora.

4. Mantenimiento de organoides

NOTA: Los organoides se cultivan en medios organoides convencionales (WENR) que comprenden EGF recombinante y 50% de medios acondicionados que contienen Wnt3a, Noggin y R-spondin^23. Los fármacos A8301 y SB202190 se agregan durante los primeros 6 días del período de cultivo para optimizar el crecimiento (WENRAS media) (Figura 5), luego se eliminan para promover la diferenciación (WENR media)²⁰. Y27632 se agrega durante los primeros 2 días de cultivo para promover la supervivencia. Las condiciones de los medios en relación con la línea de tiempo de la cultura se presentan en la Figura 4.

1. Dos días después del chapado, retire los medios WENRAS + Y27632 de cada pozo utilizando una pipeta de 1 ml, asegurando que no haya contaminación cruzada. Agregue 300 μL de medios WENRAS por el lado del pozo para no interrumpir el gel de la matriz. Devuelva la placa a la incubadora.
2. Cambiar los medios cada 2 días, utilizando los medios apropiados para la etapa de cultivo (Figura 4). Mantenga los organoides hasta el día 12, cuando los organoides estén listos para cosechar.

5. Procesamiento de ARN

1. Recolección de organoides para ARN
   1. Coloque la placa de 48 pozos sobre hielo durante 30 minutos para despolimerizar el gel de matriz.
   2. Usando una pipeta de 1 ml, tire hacia arriba de los medios organoides; luego, a medida que el medio se devuelve al pozo, use la punta de la pipeta para rayar y romper aún más el gel de la matriz. Transfiera el contenido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agrupando el contenido de tres pozos en un tubo. Centrifugar los tubos durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.
   3. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante de medios sin eliminar ningún organoide; luego, vuelva a girar los tubos durante 5 minutos a 300 x g a temperatura ambiente.
   4. Retire los medios restantes y resuspónda los organoides en tampón de lisis de 350 μL + β-mercaptoetanol (βME) (10 μL βME por tampón de lisis de 1 ml). Coloque las muestras en hielo para la extracción inmediata de ARN o guárdelo a -80 °C.
2. Análisis cuantitativo de RT-PCR
   1. Mida la cantidad de ARN mediante espectrofotómetro. Transcribir inversamente el ARN utilizando un kit de síntesis de ADNc.
   2. Mezclar aDNc equivalente a ARN de 5 ng con cebadores de avance y retroceso prevalidados de 200 nM (Tabla 1) y Master Mix de PCR fluorescente. Ejecute la reacción qRT-PCR durante 40 ciclos a: 95 °C durante 15 s, luego a 60 °C durante 60 s.

6. Inmunohistoquímica

1. Recolección y fijación de los organoides
   1. Coloque la placa de 48 pozos sobre hielo durante 30 minutos para aflojar el gel de matriz.
   2. Retire los medios organoides y agregue 400 μL de PBS helado a cada pozo. Luego, retire el PBS y agregue 400 μL de solución de recuperación celular helada a cada pozo. Balancear suavemente a 4 °C durante 30 min.
   3. Cubra una punta de pipeta de 1 ml con 1% de BSA en PBS, y pipetee suavemente el contenido del pozo hacia arriba y hacia abajo para romper el gel de matriz. Transfiera los organoides a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml colocado sobre hielo.
   4. Enjuague cada pozo con 300 μL PBS + 1% BSA y transfiera los organoides restantes a los tubos correspondientes. Retire Cell Recovery Solution/PBS + BSA de cada tubo. Agregue 400 μL de PBS helado, luego repita con otro enjuague de PBS helado.
   5. Retire el PBS y fije los organoides con 300 μL de PFA al 4% en frío (en 0,1 M PB) durante 20 min, incubando a temperatura ambiente. Retire el PFA y enjuague los organoides con PBS helado de 400 μL.
   6. Eliminar PBS; luego, agregue 400 μL PBS + 1% BSA. Conservar a 4 °C.
2. Tinción por inmunofluorescencia
   1. Enjuague los organoides en 500 μL PBS + 1% BSA. Luego, incube los organoides en solución bloqueadora (5% de suero normal de cabra o burro, 1% de albúmina sérica bovina, Tritón X 100 al 0,3% en 1x PBS pH 7.3) durante 2 h, balanceándose suavemente a temperatura ambiente.
   2. Añadir la solución de anticuerpos primarios (anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo) y escríerla suavemente durante 3 noches a 4 °C.
   3. Lave los organoides 4x durante 1 h con PBS de 500 μL + Tritón al 0,2%, balanceándose suavemente a temperatura ambiente. Añadir solución secundaria de anticuerpos (anticuerpos secundarios diluidos en solución bloqueante) y organoides de roca durante la noche, protegidos de la luz, a 4 °C.
   4. Lave los organoides 3x durante 1 h con PBS de 500 μL + Tritón al 0,2%, protegido de la luz y balanceándose suavemente a temperatura ambiente. Incubar con DAPI diluido 1:10.000 en PB de 0,1 M durante 20 min, balanceando y cubriendo a temperatura ambiente.
   5. Lavar los organoides 3x durante 20 min con 0.1 M PB, balanceándolos suavemente y cubiertos a temperatura ambiente.
3. Montaje deslizante de organoides para microscopía confocal invertida.
   NOTA: Las imágenes paso a paso del proceso de montaje de diapositivas se muestran en la Figura 7.
   1. Cree un perímetro cuadrado de ~ 1 mm de espesor de 22 x 22 mm de arcilla de modelado no tóxica en un portaobjetos de microscopio.
   2. Retire 0,1 M pb del tubo de la microcentrífuga y resuspenda suavemente los organoides en el medio de montaje de 100 μL de su elección; luego, transfiera al centro del cuadrado de arcilla.
   3. Llene el cuadrado de arcilla hasta que el medio de montaje esté casi en la parte superior. Luego, coloque la cubierta cuadrada de 22 x 22 mm sobre arcilla y presione firmemente hacia abajo en los lados de la cubierta para sellar. Deje que se cure de acuerdo con las instrucciones del fabricante (aquí, a temperatura ambiente durante 1-2 días) y guárdelo a 4 ° C.

Resultados

Los ratones tienen un CVP, ubicado posteriormente en la lengua, del cual se pueden aislar células madre LGR5⁺ (Figura 1A,caja negra). La inyección de una solución enzimática debajo y alrededor de la CVP(Figura 1B)da como resultado una ligera hinchazón del epitelio y la digestión del tejido conectivo. Se logra una digestión suficiente después de una incubación de 33 minutos, lo que permite una fácil separación del epitelio C...

Discusión

Aquí se informa que es un método eficiente y fácilmente repetible para cultivar, mantener y procesar organoides linguales derivados de células madre gustales de ratones adultos. Se encontró que el uso de tres CVP de ratones Lgr5-EGFP de 8 a 20 semanas de edad es suficiente para obtener ~ 10,000 células GFP⁺ para uso experimental, lo que resulta en 50 pomos chapados a una densidad de 200 células por pozo en placas de 48 pomos. La eliminación de los epitelios de zanja CVP se optimiza inyectando ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG	Molecular Probes	A11056, RRID: AB_142628	1:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A11010, RRID:AB_2534077	1:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG	Invitrogen	A11075, RRID:AB_2534119	1:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A31573, RRID:AB_2536183	1:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG	Molecular Probes	A21247, RRID:AB_141778	1:2000
DAPI (for FACS)	Thermo Fischer	62247
DAPI (for immunohistochemistry)	Invitrogen	D3571, RRID:AB_2307445	1:10000
Goat anti-CAR4	R&D Systems	AF2414, RRID:AB_2070332	1:50
Guinea pig anti-KRT13	Acris Antibodies	BP5076, RRID:AB_979608	1:250
Rabbit anti-GUSTDUCIN	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-395, RRID:AB_673678	1:250
Rabbit anti-NTPDASE2	CHUQ	mN2-36LI6, RRID:AB_2800455	1:300
Rat anti-KRT8	DSHB	TROMA-IS, RRID: AB_531826	1:100
Equipment
2D rocker	Benchmark Scientific Inc.	BR2000
3D Rotator	Lab-Line Instruments	4630
Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	S407992
Centrifuge	Eppendorf	5415D
CO2 tank	Airgas	CD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4110	184 L, Polished Stainless Steel
Incucyte	Sartorius	Model: S3	Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100	Cytomation Inc	Model: S13211997	Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E1
Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5417R
Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
Thermal Cycler	Bio-Rad	580BR
Vortex	Fisher Scientific	12-812
Water bath	Precision	51220073
Media
A83 01	Sigma	SML0788-5MG	Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 Supplement	Gibco	17504044	Stock concentration 50X, final concentration 1X
Gentamicin	Gibco	15750-060	Stock concentration 1000X, final concentration 1X
Glutamax	Gibco	35050061	Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPES	Gibco	15630080	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGF	Peprotech	315-09-1MG	Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine Noggin	Peprotech	250-38	Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165	Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Nicotinamide	Sigma	N0636-100g	Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/Strep	Gibco	15140-122	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190	R&D Systems	1264	Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned media			Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ug	APExBIO	A3008-10	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB Syringe	BD Syringe	309659
2-Mercaptoethanol, min. 98%	Sigma	M3148-25ML	β-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1420-2700
48-well plates	Thermo Scientific	150687
5 3/4 inch Pasteur Pipets	Fisherbrand	12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma Life Science	A9647-100G
Buffer RLT Lysis buffer	QIAGEN	1015750
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I	Sigma Life Science	C0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear	R&D Systems	3533-005-02	Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001
Disposable Filters	Sysmex	04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)	Gibco	10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+	Sigma Life Sciences	D8662-500ML
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)	Promega	V4231
Elastase Lyophilized	Worthington Biochemical	LS002292
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
HEPES Solution	Sigma Life Science	H3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA	Thermo Scientific	25200-056
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1706691
Modeling Clay, Gray	Sargent Art	22-4084
Needle	BD Syringe	305106
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PowerSYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
RNeasy Micro Kit	QIAGEN	74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	022363204
Sodium Chloride	Fisher Chemical	7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrous	Fisher Chemical	7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrous	Fisher Bioreagents	7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14002-14
Triton X-100	Sigma Life Science	T8787-100ML
VWR micro cover glass	VWR	48366067	22x22mm