Cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica

Resumen

La escherichia coli es la principal causa de meningitis bacteriana gram-negativa neonatal. Durante la infección bacteriana, las especies reactivas de oxígeno producidas por neutrófilos desempeñan un papel bactericida importante. Aquí introducimos un método para detectar las especies reactivas de oxígeno en neutrófilos en respuesta a la meningitis E. coli.

Resumen

Escherichia coli (E. coli)es la bacteria Gram-negativa más común que causa meningitis neonatal. La aparición de bacteremia y penetración bacteriana a través de la barrera hematoencefálica son pasos indispensables para el desarrollo de la meningitis E. coli. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) representan los principales mecanismos bactericidas de los neutrófilos para destruir los patógenos invadidos. En este protocolo, la producción de ROS intracelular dependiente del tiempo en neutrófilos infectados con E. coli meningítica se cuantificó utilizando sondas ROS fluorescentes detectadas por un lector de microplacas de fluorescencia en tiempo real. Este método también se puede aplicar a la evaluación de la producción de ROS en células de mamíferos durante las interacciones patógeno-huésped.

Introducción

La meningitis bacteriana neonatal es una enfermedad infecciosa pediátrica común. Escherichia coli (E. coli)con una cápsula K1 es el patógeno gram-negativo más común que causa meningitis bacteriana neonatal, representando alrededor del 80% de la incidencia total^1,2,3. A pesar de los avances en la quimioterapia antimicrobiana y la atención de apoyo, la meningitis bacteriana sigue siendo una de las afecciones más devastadoras con alta morbilidad y mortalidad^4.

La aparición de meningitis bacteriana neonatal generalmente comienza con la bacteremia causada por la entrada de bacterias patógenas en la circulación periférica de las lesiones locales de los recién nacidos, seguida de la penetración a través de la barrera blood - brain (BBB) en el cerebro, lo que resulta en la inflamación de las meninges⁴. La aparición de la bacteremia depende de la interacción entre las bacterias y las células inmunes huésped, incluidos los neutrófilos y los macrófagos, etc. Los neutrófilos, que representan ~50-70% de los glóbulos blancos, son la primera línea de defensa contra las infecciones bacterianas^5,6. Durante la invasión de bacterias, los neutrófilos activados son reclutados en los sitios infecciosos y liberan especies reactivas de oxígeno (ROS) incluyendo el anión superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilos y oxígeno singlete^7. El ROS se somete a reacciones redox con la membrana celular, moléculas de ácido nucleico y proteínas de la bacteria, lo que resulta en la lesión y muerte de la bacteria invasora^8. Las mitocondrias son el sitio principal de producción de ROS en células eucariotas, y varios oxidases (por ejemplo, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) complejo oxidasa, sistema lipoxigenasa, proteína quinasa C y sistema ciclooxigenasa) median la producción de ROS^9,10. La medición en tiempo real de la producción de ROS, que representa el mecanismo antimicrobiano primario en neutrófilos, es un método útil para estudiar la defensa del huésped durante la interacción bacteriana-huésped.

En este protocolo, la producción de ROS dependiente del tiempo en neutrófilos infectados con E. coli meningítica se cuantificó con una sonda ROS fluorescente DHE, detectada por un lector de microplacas de fluorescencia en tiempo real. Este método también se puede aplicar a la evaluación de la producción de ROS en otras células de mamíferos durante la interacción patógeno-huésped.

Protocolo

La sangre periférica de los voluntarios aplicados en esta investigación fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional del primer Hospital de la Universidad Médica de China (#2020-2020-237-2).

1. Preparación de reactivos y medios de cultivo

1. Preparar el tampón de lisis de glóbulos rojos añadiendo 8,29 g de NH₄Cl, 1 g de KHCO_3,37,2 mg de Na₂EDTA en 1 L de agua destilada doble y ajustar el pH a 7,2-7,4. Retire la bacteria mediante filtración utilizando filtros de 0,22 μm.
2. Prepare el medio de cultivo experimental para neutrófilos añadiendo un 5% de suero bovino fetal al medio RPMI 1640 y guárdelo a 4 °C. Equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso.
   NOTA: Utilice el medio RPMI 1640 sin fenol rojo.
3. Preparar solución salina tampón de fosfato (PBS) añadiendo 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄·2H₂O y 0,2 g de KH₂PO₄ en 1 L de agua destilada doble en un matraz de vidrio de 1 L. Ajuste el pH a 7,2-7,4. Autoclave durante 15 min a 121 °C.
4. Preparar solución de rifampicina mediante la disolución de 0,5 g de polvo de rifampicina en 10 ml de sulfóxido de dimetil (DMSO) para producir una solución de rifampicina de 50 mg/ml.
5. Preparar solución de agar LB añadiendo 10 g de NaCl, 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 15 g de polvo de agar en 1 L de agua destilada doble y autoclave la mezcla. Llene las placas De Petri a la mitad del volumen vertiendo solución de agar LB caliente que contenga 100 rifampicina de μg/ml. Guarde la placa sólida enfriada a 4 °C.
6. Preparar caldo de infusión cardíaca cerebral (BHI) apropiado para cepas bacterianas mediante la disolución de 37 g de polvo BHI en 1 L de agua destilada doble. Ajuste el pH a 7,2 y autoclave.
7. Disolver la sonda fluorescente dihidroethidium (DHE) en disolvente DMSO para producir una solución de stock de 10 mM. Mezcle suavemente antes de usarlo.
   NOTA: Aliquot la solución de stock inmediatamente en viales a prueba de luz. La vida útil de la solución de stock es de 6 meses a -20 °C.

2. Preparación de la cepa bacteriana E44

NOTA: E44 es una cepa mutante de E. coli meningítica con resistencia a la rifampicina.

1. Sumerja la colonia E44 criopreservada con una punta de pipeta estéril, inocular la cepa E44 en la placa de agar LB que contiene 100 μg/ml de rifampicina dibujando líneas. Ponga la placa boca abajo en la incubadora a 37 °C durante la noche.
2. Un día antes del experimento, elija una colonia E44 de la placa con una punta de pipeta estéril y colóquela en 5 ml de caldo BHI que contenga 100 rifampicina de μg/ml en un matraz de 50 ml. Incubar el cultivo bacteriano a 37 °C con 90 rpm durante 17 h en un agitador de incubación.

3. Aislamiento de neutrófilos de sangre periférica humana

1. Extraiga 5 ml de muestra de sangre de voluntarios por vía intravenosa al tubo de recolección de sangre al vacío que contiene EDTA para la anticoagulación.
2. Centrífuga las muestras de sangre periférica a 500 x g durante 5 min. Las muestras de sangre se dividen en tres capas por centrifugación, que de abajo a arriba son la capa de glóbulos rojos (RBC), la capa de glóbulos blancos (CMB) y la capa plasmática, secuencialmente.
3. Aspirar la capa de glóbulos blancos con un pipete a un nuevo tubo con 3x Tampón de lisis RBC. Mezcle bien la mezcla y colóquelo a temperatura ambiente durante 5 minutos.
4. Centrífuga el tubo a 500 x g durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante por completo y descartar.
   1. Repita el procedimiento de lisis con el búfer de lisis RBC 1-2 veces, hasta que el precipitado se vuelva blanco.
5. Lave las células resuspendiendo el precipitado con 2 ml de PBS. A continuación, centrífuga a 300 x g durante 5 minutos para dejar que las células se asienten hasta la parte inferior del tubo.
6. Etiquete a los neutrófilos con microperlas CD16 resuspendiendo el sedimento con 50 μL de amortiguador de clasificación de células magnéticas precooled. A continuación, mezcle con 50 μL de microperlas CD16 humanas a fondo. Incubar la mezcla a 4 °C durante 30 min.
   NOTA: Las soluciones deben preenfriarse para evitar el taponamiento de anticuerpos en la superficie celular y el etiquetado no específico. La mayoría de los adultos tienen entre 4.000 y 10.000 glóbulos blancos por microlitro de sangre, entre los cuales, los neutrófilos representan aproximadamente el 50-70%. Según las estimaciones, los recuentos de glóbulos blancos totales en 5 ml de sangre periférica humana suelen ser de hasta 2-5 x 10^7.
7. Lave las células añadiendo 2 ml de amortiguador de clasificación de células magnéticas y centrífuga a 4 °C, 300 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante por completo y vuelva a gastar el precipitado con 500 μL de búfer de clasificación.
8. Monte la columna magnética y el estante de separación. Mueva el separador al estante con la columna magnética y enjuague la columna con 3 ml de búfer de clasificación.
9. Suelte la suspensión celular en la columna para permitir que los neutrófilos etiquetados por las cuentas magnéticas se unan a la columna magnética.
10. Lávese las celdas no etiquetadas añadiendo 3 ml de búfer de clasificación de células magnéticas 3 veces, asegurándose de que el depósito de columnas esté vacío cada vez.
11. Retire la columna del separador magnético y colóquela en un tubo de 15 ml. Agregue 5 ml de búfer de clasificación de células magnéticas a la columna. Expulse las células etiquetadas magnéticas usando un émbolo.
    NOTA: Para mejorar la pureza de los neutrófilos, los pasos de clasificación pueden repetirse utilizando una nueva columna.
12. Centrífuga el tubo a 300 x g durante 5 min, deseche el sobrenadante por completo y resuspend el precipitado con 1 ml de medio de cultivo. Determine el número de celda con un contador de celdas y prepare las celdas para más experimentos.

4. Medición de ROS

1. Centrífuga los neutrófilos aislados a 300 x g durante 5 minutos, resuspend el precipitado y ajuste la concentración celular a 2 x 10⁶/ml con un medio de cultivo que contenga una sonda de fluorescencia DHE de 5 μM.
2. Incubar los neutrófilos a 37 °C durante 30 minutos para cargar la sonda DHE, y luego asignar la suspensión celular a una microplaca de poliestireno negro de 96 pozos con 200 μL por pozo.
3. Encienda el lector de microplacas y abra el software de detección. Elija el formato de placa opaca de 96 pozos y determine el área de lectura.
   1. Ajuste la fluorescencia (Ex/Em = 518/605 nm) en modo cinético cada 5 minutos durante 60 min a 37 °C. Asegúrese de agitar el plato durante 3 s antes de cada lectura.
4. Saque la microplaca de la incubadora, agregue la E44 cultivada (MOI=100) o el phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) a cada pozo que contenga neutrófilos precargados con 3 réplicas. Utilice PMA como control positivo.
5. Coloque la placa en el lector de microplacas e inicie el ensayo inmediatamente.

Resultados

Utilizando el protocolo descrito en este artículo, los neutrófilos fueron aislados de la sangre periférica humana y cargados con la sonda de fluorescencia DHE para detectar los cambios de los niveles de ROS en respuesta a la infección por E44. Aquí, proporcionamos datos representativos que demuestran la producción ROS evocada por la cepa E44 determinada por un lector de microplacas en tiempo real. Al añadir cepas E44 a un MOI de 100, los niveles ROS aumentaron inmediatamente y mostraron una tendencia continua al a...

Discusión

Los neutrófilos actúan como el componente más abundante de los glóbulos blancos en la circulación sanguínea humana. Son células efectoras importantes en el sistema inmune humano innato, que construye la primera línea de defensa contra la invasión de patógenos¹¹. La generación de ROS representa uno de los principales mecanismos bactericidas de los neutrófilos después de la fagocitosis^11. Estudios recientes han demostrado que una estructura similar a la red liber...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL polypropylene conical centrifuge tubes	KIRGEN	KG2611
96-well plate	Corning	3025
Agar	DINGGUO	DH010-1.1
Autuomated cell counter	Bio-rad	508BR03397
Biological Safety Carbinet	Shanghai Lishen	Hfsafe-1200Lcb2
Brain heart infusion	BD	237500
CD16 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-701
Centrifuge	Changsha Xiangyi	TDZ5-WS
Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Dihydroethidium (DHE)	MedChemExpress	104821-25-2
Fetal bovine serum	Cellmax	SA211.02
Incubator	Heraeus	Hera Cell
MACS separation buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Beyoitme	S1819-1mg
QuadroMACS separation Unit	Miltenyi Biotec	130-090-976
Rifampicin	Solarbio	13292-46-1
RPMI1640 medium	Sangon Biotech	E600027-0500
Thermostatic shaker	Shanghai Zhicheng	ZWY-100D
Trypton	OXOID	LP0042
Yeast extract	OXOID	LP0021