Análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificación de epítopos de células T CD4 restringidas por HLA-DR basadas en una matriz peptídica

Resumen

Sobre la base de una matriz peptídica derivada del virus de la hepatitis B (VHB), las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB podrían evaluarse en paralelo con la identificación de epítopos de células T CD4 específicas del VHB.

Resumen

Las células T CD4 juegan un papel importante en la patogénesis de la hepatitis B crónica. Como población celular versátil, las células T CD4 se han clasificado como subconjuntos funcionales distintos en función de las citoquinas que secretaron: por ejemplo, IFN-γ para las células CD4 T helper 1, IL-4 e IL-13 para las células CD4 T helper 2, IL-21 para las células auxiliares foliculares CD4 T y LA IL-17 para las células CD4 T helper 17. El análisis de las células T CD4 específicas del virus de la hepatitis B (VHB) basadas en la secreción de citoquinas después de la estimulación de péptidos derivados del VHB podría proporcionar información no solo sobre la magnitud de la respuesta de las células T CD4 específicas del VHB, sino también sobre los subconjuntos funcionales de las células T CD4 específicas del VHB. Los enfoques novedosos, como la transcriptómica y el análisis metabolómico, podrían proporcionar información funcional más detallada sobre las células T CD4 específicas del VHB. Estos enfoques generalmente requieren el aislamiento de células T CD4 viables específicas del VHB basadas en multómeros del complejo II de histocompatibilidad mayor peptídico, mientras que actualmente la información sobre los epítopos de células T CD4 específicas del VHB es limitada. Sobre la base de una matriz peptídica derivada del VHB, se ha desarrollado un método para evaluar las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificar epítopos de células T CD4 específicas del VHB simultáneamente utilizando muestras de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con infección crónica por VHB.

Introducción

Actualmente, hay 3 enfoques principales para analizar las células T específicas del antígeno. El primer enfoque se basa en la interacción entre el receptor de células T y el péptido (epítopo). Las células T específicas del antígeno podrían teñirse directamente con multómeros del complejo de histocompatibilidad peptídico mayor (MHC). La ventaja de este método es que podría obtener células T viables específicas de antígenos, adecuadas para el análisis transcriptómico / metabolómico posterior. Una limitación de este método es que no pudo proporcionar información sobre toda la respuesta de las células T a un antígeno específico, ya que requiere péptidos de epítopo validad....

Protocolo

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente incluido en el estudio. El protocolo del estudio se ajusta a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975 reflejadas en la aprobación a priori del comité de ética médica del Southwest Hospital.

1. Diseño de la matriz peptídica derivada del VHB

1. Descargue secuencias de aminoácidos del antígeno central del VHB de las bases de datos del NCBI (GenBank: AFY98989.1).
2. Compre péptidos derivados del antígeno central del VHB (un panel de 35 péptidos 15-mer superpuestos por 10 residuos, pureza > 90%, 4 mg / péptido) de un proveedor de servicios de sín....

Resultados

La frecuencia de las células T CD4 secretoras de citoquinas se calcula como la suma de productores simples y productores dobles. Como se demuestra en la Figura 1,la frecuencia de las células T CD4 secretoras de α TNF-y la frecuencia de las células T CD4 secretoras de IFN-γ en el control de fondo (DMSO) son del 0,154% y 0,013% respectivamente. La frecuencia de TNF-α secretando células T CD4 y la frecuencia de IFN-γ secretando células T CD4 específicas para el grupo de péptidos Core.......

Discusión

Los pasos más críticos en este protocolo se enumeran a continuación: 1) suficientes PBMC de alta viabilidad para iniciar la expansión de PBMCs; 2) entorno apropiado para la expansión de pbMC; y 3) eliminación completa de grupos de péptidos residuales en cultivo de PBMC antes de la identificación del epítopo.

Todo el análisis en este protocolo depende de la proliferación robusta de células T CD4. En general, el número de PBMC después de la expansión de 10 días será de 2 a 3 vec.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Bovine V (BSA)	Beyotime	ST023
APC-conjugated Anti-human TNF-α	eBioscience	17-7349-82	Keep protected from light
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	Limit cell clumping
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER	IHW09126	HLA-DRB1*0803 homozygote
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER	IHW09121	HLA-DRB1*1202 homozygote
Cell Culture Flask (T75)	Corning	430641
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom)	Corning	3599	Flat bottom
Cell Culture Plate (96-well, round bottom)	Corning	3799	Round bottom
Cell Strainer	Corning	CLS431751	Pore size 70 μm, white, sterile
Centrifuge Tube (15 mL)	KIRGEN	KG2611	Sterile
Centrifuge Tube (50 mL)	Corning	430829	Sterile
Centrifuge, Refrigerated	Eppendorf	5804R
Centrifuge, Refrigerated	Thermo	ST16R
Centrifuge, Refrigerated	Thermo	Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set)	BD Biosciences	562574	Prepare solution before use
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Keep at room temperature to prevent crystallization
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline			Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave.
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-03
Filter Tips (0.5-10)	Kirgen	KG5131	Sterile
Filter Tips (100-1000)	Kirgen	KG5333	Sterile
Filter Tips (1-200)	Kirgen	KG5233	Sterile
FITC-conjugated Anti-human CD4	BioLegend	300506	Keep protected from light
Fixable Viability Dye eFluor780	eBioscience	65-0865-14	Keep protected from light
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD Biosciences	554724	Protein Transport Inhibitor
Haemocytometer	Brand	718620
HBV Core Antigen Derived Peptides	ChinaPeptides
HEPES	Gibco	15630080	100 ml
Human Serum AB	Gemini Bio-Products	100-51	100 ml
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634
KCl	Sangon Biotech	A100395-0500
KH2PO4	Sangon Biotech	A100781-0500
LSRFortessa Flow Cytometer	BD
L-glutamine	Gibco	25030081	100 ml
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Corning	MCT-150-C	Autoclaved sterilization before using
Microplate Shakers	Scientific Industries	MicroPlate Genie
Mitomycin C	Roche	10107409001
Na2HPO4.7H2O	Sangon Biotech	A100348-0500
NaCl	Sangon Biotech	A100241-0500
PCR Tubes (0.2 mL)	Kirgen	KG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8	BioLegend	300914	Keep protected from light
PE-conjugated Anti-human IFN-γ	eBioscience	12-7319-42	Keep protected from light
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122	100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3	eBioscience	45-0037-42	Keep protected from light
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P1585
Recombinant Human IL-2	PeproTech	200-02
Recombinant Human IL-7	PeproTech	200-07
RPMI Medium 1640	Gibco	C11875500BT	500 ml
Sodium pyruvate,100mM	Gibco	15360070
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR	BioLegend	307648
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1125