Cosecha y desagregación: un paso pasado por alto en la investigación de métodos de biopelícula

Resumen

Este documento detalla los métodos que demuestran tres técnicas comunes de recolección y desagregación de biopelículas en dos tipos de superficie, pruebas de robustez de un método de cosecha e información mínima a considerar al elegir y optimizar las técnicas de cosecha y desagregación para aumentar la reproducibilidad.

Resumen

Los métodos de biopelícula consisten en cuatro pasos distintos: cultivar la biopelícula en un modelo relevante, tratar la biopelícula madura, cosechar la biopelícula de la superficie y desagregar los grupos, y analizar la muestra. De los cuatro pasos, la recolección y la desagregación son los menos estudiados, pero sin embargo críticos cuando se considera el potencial de sesgo de la prueba. Este artículo demuestra las técnicas de cosecha y desagregación comúnmente utilizadas para biopelículas cultivadas en tres superficies diferentes. Las tres técnicas de recolección y desagregación de biopelículas, obtenidas de una extensa revisión de la literatura, incluyen vórtice y sonicación, raspado y homogeneización, y raspado, vórtice y sonicación. Se consideran dos tipos de superficie: dura no porosa (policarbonato y vidrio de borosilicato) y porosa (silicona). Además, proporcionamos recomendaciones para la información mínima que debe incluirse al informar la técnica de cosecha seguida y un método acompañante para verificar el sesgo.

Introducción

La definición de biofilm ha evolucionado en las últimas décadas y abarca la asociación microbiana con una variedad de superficies biológicas y/o no biológicas, la inclusión de componentes no ^celulares1 que muestran un crecimiento diferente y la expresión ^genética2 dentro de una matriz. La biopelícula proporciona protección contra las tensiones ambientales, como el secado, y puede hacer que la acción de los desinfectantes químicos sea menos efectiva, lo que resulta en la supervivencia de los microbios. Los sobrevivientes dentro de una biopelícula pueden potencialmente proporcionar una fuente de microorganismos patógenos que son un problema de salud ^pública3.

Los métodos de biopelícula se componen de cuatro pasos, crecimiento, tratamiento, muestreo (cosecha y desagregación) y análisis. El crecimiento, el primer paso, donde el usuario determina las condiciones de crecimiento del organismo, la temperatura, los medios, etc., es el más considerado e informado en la literatura de biofilm4,5,6,7. La etapa de tratamiento evalúa los antimicrobianos (por ejemplo, desinfectantes) para determinar su eficacia, ya sea contra una biopelícula ^madura3,8,9 o el antimicrobiano puede incorporarse a la superficie para determinar la capacidad del producto para prevenir o reducir el crecimiento de la biopelícula10. El tercer paso, el muestreo, incluye pasos para cosechar la biopelícula de la superficie en la que estaba creciendo y para desagregar los grupos eliminados3,8,11. El cuarto paso, el análisis, puede incluir recuentos celulares viables, microscopía, mediciones de fluorescencia, resultados moleculares y/o una evaluación de componentes ^{matriciales8,9}. La evaluación de los datos proporciona información sobre el resultado de un experimento. De los cuatro, el muestreo es a menudo el paso más pasado por alto porque supone que la técnica de recolección y/o desagregación de biopelícula elegida es 100% efectiva, a menudo sin ^{verificación11}.

Las suspensiones planctónicas de bacterias, a menudo consideradas homogéneas, requieren un vórtice simple antes del análisis. Los biofilms, sin embargo, son comunidades complejas compuestas por microorganismos (procariotas y/o eucariotas), exopolisacáridos, proteínas, lípidos, ADN extracelular y células ^huésped12. Se necesitan pasos más allá de los métodos tradicionales de cultivo microbiológico planctónico para cosechar adecuadamente la biopelícula de una superficie y luego desagregarla en una suspensión homogénea de una sola célula. Una extensa revisión de la literatura (información no incluida en esta publicación) demostró que la elección de la técnica de eliminación y desagregación depende de una serie de factores, incluidas las especies presentes en la biopelícula, la superficie a la que está unida la biopelícula (no porosa o porosa), la accesibilidad a las superficies de crecimiento (cupón fácilmente extraíble o destrucción física del aparato en el que crece la biopelícula), geometría de la superficie (área y forma), densidad de la biopelícula en las superficies de crecimiento y equipo de laboratorio disponible.

Cuando la biopelícula se cosecha de una superficie, la suspensión celular resultante es heterogénea. Para que esta suspensión no uniforme se enumere con precisión, debe desglosarse en células individuales. Los recuentos de placas viables suponen que una unidad formadora de colonias se origina en una bacteria. Si se colocan agregados de biopelícula en el medio de crecimiento, es imposible distinguir células individuales, lo que podría conducir a estimaciones inexactas. Por ejemplo, durante las pruebas de eficacia del desinfectante, si un tratamiento elimina la biopelícula de manera muy efectiva de una superficie en comparación con el control, la reducción del registro podría parecer artificialmente grande en comparación con el control. Por otro lado, un desinfectante químico que fija biofilm en una superficie en comparación con el control parecerá tener una menor reducción de ^logaritmos11. Este tipo de escenario podría conducir a una interpretación sesgada de los datos experimentales.

En preparación para la publicación, una revisión de la literatura determinó que los enfoques comunes para cosechar y desagregar la biopelícula incluyen raspado, hisopo, sonicación, vórtice o una combinación de estos. El raspado se define como la eliminación física de la biopelícula de las superficies con un palo estéril, espátula u otra herramienta. El hisopo se refiere a la eliminación de la biopelícula de las superficies con un palo con punta de algodón u otro material absorbente fijo. La sonicación se refiere a la interrupción de la biopelícula de las superficies a través de ondas ultrasónicas distribuidas a través del agua. El vórtice se refiere al uso de un mezclador para lograr un vórtice líquido de la muestra dentro de un tubo. La homogeneización utiliza cuchillas giratorias para cortar por cizallamientos de biopelícula cosechados en una suspensión de una sola célula. En este trabajo, presentamos tres métodos de cosecha y desagregación para dos tipos de superficie diferentes, duro / no poroso y poroso.

Se proporciona una lista de información mínima recomendada que los investigadores deben incluir en las secciones de métodos de las publicaciones. Esperamos que la inclusión de esta información permita a otros investigadores reproducir su trabajo. No existe un método perfecto de cosecha y desagregación, por lo tanto, también se proporcionan recomendaciones sobre cómo verificar la técnica.

En este artículo se demuestran tres métodos comunes para cosechar y desagregar la biopelícula de las superficies de crecimiento comunes. Esta información permitirá a los investigadores comprender mejor la precisión general y el sesgo de un método de prueba de biopelícula. Los métodos descritos son los siguientes: (1) Una biopelícula de Pseudomonas aeruginosa cultivada en cupones de policarbonato (superficie dura no porosa) bajo alto cizallamiento de fluidos en el reactor de biopelícula CDC se cosecha y desagrega después de una combinación de cinco pasos de vórtice y sonicación para lograr la cosecha y desagregación de biopelícula (2) A P. aeruginosa La biopelícula cultivada en cupones de vidrio de borosilicato (superficie dura no porosa) en el reactor de flujo de goteo bajo cizallamiento de fluido se cosecha y desagrega mediante raspado y homogeneización (3) Una biopelícula de Escherichia coli cultivada en tubos de silicona (superficie porosa) se cosecha y desagrega mediante raspado, seguido de sonicación y vórtice.

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Protocolo

1. Vórtice y sonicación

1. Cultive una biopelícula madura de P. aeruginosa ATCC 15442 cultivada de acuerdo con la norma ASTM E25622.
2. Al final del período de crecimiento de 48 h, prepárese para tratar la biopelícula y los cupones de muestra de acuerdo con la norma ASTM E28718
3. Inserte asépticamente protectores contra salpicaduras en autoclave en tubos cónicos estériles de 50 ml utilizando pinzas esterilizadas por llama. Repita la repetición para todos los tubos que recibirán tratamiento. Los tubos para cupones de control no necesitan un protector contra salpicaduras.
4. Retire asépticamente una varilla seleccionada al azar del reactor de biopelícula de los CDC. Enjuague los cupones para eliminar las células sueltas sumergiendo suavemente la varilla en 30 ml de agua tamponada estéril.
5. Sostenga la varilla paralela a la mesa de trabajo, sobre un tubo cónico vacío y estéril de 50 ml y, utilizando una llave Allen esterilizada por llama, afloje el tornillo para dejar caer un cupón recubierto de biopelícula en el tubo. Repita para el número deseado de cupones. Retire los protectores contra salpicaduras y colóquelos en un recipiente separado para la esterilización.
6. Usando una pipeta serológica de 5 ml, pipetee lentamente 4 ml del tratamiento o control en los tubos para que el líquido fluya por el interior de la pared del tubo.
7. Golpee suavemente la parte inferior del tubo para que las burbujas de aire debajo del cupón se desplacen. Permita 30 - 60 s entre cada adición.
8. Al final del tiempo de contacto especificado, pipetee 36 ml de neutralizador en los tubos en el mismo orden en que se aplicó el tratamiento (o control).
   NOTA: El volumen final de tratamiento combinado y neutralizador es importante para determinar con precisión la densidad logarítmica de la biopelícula.
9. Vórtice cada tubo en el ajuste más alto durante 30 ± 5 s. Asegúrese de que se logre un vórtice completo.
   NOTA: Se debe tener precaución al vórtice cupones pesados como el acero inoxidable en viales de vidrio donde podría ocurrir una rotura.
10. Determine el número óptimo de tubos por baño y la colocación dentro del bastidor del tubo de ensayo antes de procesar las muestras reales. Si procesa varias muestras, confirme que la temperatura del agua en el baño sonicante es de 21 ± 2 ^oC.
11. Coloque los tubos en el bastidor de tubos suspendidos en el sonicador desgasificado de tal manera que el nivel de agua en el baño sea igual al nivel de líquido en los tubos. Sonicado a 45 kHz, 100% de potencia y función Normal para 30 ± 5 s. Repita los ciclos de vórtice y sonicación y luego termine con un vórtice final (5 ciclos en total).
    NOTA: Estos tubos con el biofilm cosechado y desagregado son la dilución ¹⁰⁰ o 0.
12. Diluya en serie la muestra en agua tamponada. Placa en el agar R2A utilizando el método de chapado apropiado. Incubar a 36 ± 2 ^oC durante 24 h. Cuente las colonias según corresponda al método de recubrimiento utilizado y registre los datos.

2. Raspado y homogeneización

1. Cultivar un biofilm maduro de P. aeruginosa ATCC 15442 según la Norma ASTM E264713.
2. Configure la estación de muestreo para incluir tablero de muestreo, etanol al 95% en un vaso de precipitados, quemador de alcohol, hemostáticos, herramienta de eliminación de cupones, vasos de precipitados con agua de dilución estéril y tubos de dilución para enjuagar los cupones.
3. Apague la bomba. Retire una cubierta de canal y use una herramienta estéril de eliminación de cupones y hemostáticos para quitar el cupón, teniendo cuidado de no molestar la biopelícula.
4. Enjuague el cupón sumergiendo suavemente, con un movimiento fluido, en 45 ml de agua de dilución estéril (contenida en un tubo de centrífuga de 50 ml). Invierta inmediatamente el movimiento para eliminar el cupón.
5. Coloque el cupón en un vaso de precipitados que contenga 45 ml de agua de dilución estéril. Raspe la superficie del cupón cubierta de biopelícula en una dirección descendente durante aproximadamente 15 s, utilizando una espátula o raspador estéril. Enjuague la espátula o el raspador revolviéndolo en el vaso de precipitados. Repita el proceso de raspado y enjuague 3-4 veces, asegurando una cobertura completa de la superficie del cupón.
6. Enjuague el cupón manteniéndolo en un ángulo de 60° sobre el vaso de precipitados estéril y pipeteando 1 ml de agua de dilución estéril sobre la superficie del cupón. Repetir para un total de 5 enjuagues. El volumen final en el vaso de precipitados es de 50 ml.
   NOTA: El volumen final de tratamiento combinado y neutralizador es importante para determinar con precisión la densidad logarítmica de la biopelícula.
7. Reemplace cada cubierta de canal a medida que se eliminan los cupones.
8. Trabajando en el gabinete de bioseguridad, homogeneice la muestra de biopelícula raspada. Conecte una sonda homogeneizadora estéril al homogeneizador, coloque la punta de la sonda en el líquido, encienda el homogeneizador y aumente hasta 20.500 rpm.
9. Homogeneizar la muestra durante 30 s. Apague las RPM y apague el homogeneizador.
10. Desinfecte la sonda entre muestras de biofilm homogeneizando un espacio en blanco de dilución estéril de 9 ml a 20.500 rpm durante 30 s como se describió anteriormente. Homogeneizar un tubo de 9 mL de etanol al 70% durante 30 s, separar la sonda y dejar reposar en el tubo de etanol durante 1 min. Homogeneizar dos espacios en blanco de dilución adicionales.
    NOTA: Se puede utilizar una sonda homogeneizadora desechable para cada muestra.
11. Diluya en serie las muestras en agua tamponada. Placa en agar R2A utilizando el método de chapado apropiado. Incubar placas a 36 ± ^2oC durante 24 h, contar colonias según corresponda al método de chapado utilizado y registrar datos.

3. Raspado, vórtice y sonicación

1. Cultivar una biopelícula madura de Escherichia coli ATCC 53498 en tubos de catéter de ^silicona10.
2. Prepare los materiales de muestreo: tubos de enjuague, tubo de centrífuga estéril, placa de Petri estéril vacía, hemostático y tijeras de acero inoxidable esterilizados por llama, temporizador y regla.
3. Con la bomba en pausa, use etanol al 70% para limpiar el exterior de la tubería. Mida 2 cm desde el extremo, evitando el área unida al conector, y marque el tubo para determinar las ubicaciones de corte.
4. Con tijeras esterilizadas a la llama, corte el tubo en la marca de 2 cm y coloque el segmento en una placa de Petri estéril vacía. Limpie el tubo con etanol al 70% y vuelva a conectar el extremo distal al tubo de desecho.
5. Enjuague el segmento de tubos para eliminar las células planctónicas. Con pinzas esterilizadas por llama, sumerja suavemente el segmento de tubería en 20 ml de agua de dilución estéril y luego retire inmediatamente. Coloque el segmento en 10 ml de neutralizador.
6. Con pinzas esterilizadas por llama, sostenga el segmento del tubo y raspe con una barra aplicadora de madera estéril hasta que se hayan raspado todas las áreas internas del tubo. Ocasionalmente enjuague el palo en los 10 ml de neutralizador y vuelva a colocar el segmento en el tubo de muestra. El segmento de tubos raspados es la dilución ¹⁰⁰ o 0.
   NOTA: El volumen final de tratamiento combinado y neutralizador es importante para determinar con precisión la densidad logarítmica de la biopelícula.
7. Vórtice cada tubo en el ajuste más alto durante 30 ± 5 s. Coloque el tubo en el bastidor de tubos suspendido en el sonicador de modo que el nivel de agua en el baño sea igual al nivel de líquido en los tubos. Sonicado a 45 kHz, 100% de potencia y función Normal durante 30 ± 5 segundos. Repita los ciclos de vórtice y sonicación y luego termine con un vórtice final.
   NOTA: Este tubo con la biopelícula cosechada y desagregada es la dilución ¹⁰⁰ .
8. Diluya en serie las muestras en agua tamponada. Plato en agar de soja tríptico utilizando el método de recubrimiento apropiado.
9. Incubar placas a 36 ± 2 ^oC durante 24 h. Contar las colonias según corresponda al método de chapado utilizado, registrar los datos y calcular la media aritmética.

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Resultados

Validación/Confirmación de un Método de Cosecha
Varios estudios que se llevaron a cabo en nuestro laboratorio examinaron la capacidad del vórtice y la sonicación para cosechar eficazmente la biopelícula cultivada en el reactor de biopelícula (ASTM E2562)² utilizando el método de tubo único (ASTM E2871)⁸.

Una biopelícula atcc 15442 de P. aeruginosa se cultivó de acuerdo con ASTM E2562...

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Discusión

Información mínima para los métodos de recolección y desagregación
Para crear datos de biopelícula reproducibles en toda la comunidad científica, es imperativo que los autores incluyan tantos detalles como sea posible con respecto a cada uno de los pasos de crecimiento, tratamiento, muestreo y análisis de un método de biopelícula. La estandarización de los métodos de biopelícula ha ayudado en este esfuerzo, ya que permite al investigador hacer referencia a un método específico y cualqui...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506