Análisis cuantitativo basado en microscopía de escaneo láser confocal de la distribución de conidios de Aspergillus fumigatus en pulmón de ratón ópticamente despejado de montaje entero

Resumen

Describimos el método para el análisis cuantitativo de la distribución de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamaño) en las vías respiratorias de ratones. El método también se puede utilizar para el análisis de micropartículas y la distribución de aglomerado de nanopartículas en las vías respiratorias en varios modelos de condiciones patológicas.

Resumen

Aspergillus fumigatus conidia son patógenos en el aire que pueden penetrar en las vías respiratorias humanas. Las personas inmunocompetentes sin alergias exhiben resistencia y tolerancia inmunológica, mientras que en pacientes inmunocomprometidos, los conidios pueden colonizar las vías respiratorias y causar trastornos respiratorios invasivos graves. Varias células en diferentes compartimentos de las vías respiratorias están involucradas en la respuesta inmune que previene la invasión de hongos; sin embargo, los aspectos espacio-temporales de la eliminación de patógenos aún no se comprenden completamente. Las imágenes tridimensionales (3D) de órganos de montaje entero limpiados ópticamente, particularmente los pulmones de ratones experimentales, permiten la detección de patógenos etiquetados fluorescentemente en las vías respiratorias en diferentes puntos de tiempo después de la infección. En el presente estudio, describimos una configuración experimental para realizar un análisis cuantitativo de la distribución de A. fumigatus conidia en las vías respiratorias. Utilizando microscopía fluorescente de barrido láser confocal (CLSM), rastreamos la ubicación de los conidios marcados fluorescentemente en las ramas bronquiales y el compartimiento alveolar 6 horas después de la aplicación orofaríngea a ratones. El enfoque descrito aquí se utilizó previamente para la detección de la ubicación precisa del patógeno y la identificación de las células que interactúan con el patógeno en diferentes fases de la respuesta inmune. La configuración experimental se puede utilizar para estimar la cinética de la eliminación del patógeno en diferentes condiciones patológicas.

Introducción

Diariamente, las personas inhalan patógenos en el aire, incluidas las esporas de hongos oportunistas Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) que pueden penetrar en el tracto respiratorio¹. El tracto respiratorio de los mamíferos es un sistema de vías respiratorias de diferentes generaciones que se caracterizan por las diferentes estructuras de las paredes de las vías respiratorias^2,3,4. Las paredes traqueobronquiales consisten en varios tipos de células entre las que se encuentran las células ciliadas que proporcionan el aclarami....

Protocolo

Todos los métodos relacionados con los animales de laboratorio descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto Shemyakin y Ovchinnikov de Química Bioorgánica, Academia de Ciencias de Rusia (número de protocolo 226/2017).

1. Aplicación de A. fumigatus conidia

1. Para obtener A. fumigatus conidia marcado fluorescentemente, fije 5 × 10⁸ conidios agregando 1 ml de paraformaldehído al 3% al pellet de conidios. Incubar en un tubo de ensayo de 50 ml durante 2 h en un agitador a temperatura ambiente.
2. Lavar los conidios con 20 ml de soluc....

Resultados

Siguiendo el protocolo anterior, se obtuvo la imagen 3D que muestra las vías respiratorias y los conidios de A. fumigatus en el lóbulo pulmonar de un ratón (Figura 1A). La estreptavidina (que se utilizó para la visualización de las vías respiratorias) etiquetó bronquios y bronquiolos¹⁵. Además, los vasos grandes, que son fácilmente distinguibles de las vías respiratorias por su morfología, y la pleura se visualizan en el canal de las vías respirat.......

Discusión

La obtención de imágenes 3D de órganos completos permite obtener los datos sin disección del espécimen, lo que es de gran importancia para investigar los aspectos espaciales de la distribución anatómica del patógeno en el organismo. Existen varias técnicas y modificaciones de limpieza óptica de tejidos que ayudan a superar la dispersión de la luz láser y permiten la obtención de imágenes de todo el órgano^15,16,18,.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conidia	ATCC	46645	The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcohol	Panreac	141081.1611	98.0-100 %
Benzyl benzoate	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 mice	Pushchino Animal Breeding Centre (Russia)		Male. 12 - 30 week old.
Catheter	Venisystems	G715-A01	18G
Cell imaging coverglass-bottom chamber	Eppendorf	30742028	4 or 8 well chamber with coverglass bottom
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Any centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscope	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855	≥99.9%
FIJI image processing package	FIJI		Free software
Forcep	B. Braun Aesculap	BD557R	Toothed
Forcep	B. Braun Aesculap	BD321R	Fine-tipped
Forcep	Bochem	1727	Smooth
Glass bottle	DURAN	242101304	With groung-in lid
Graphic Editor Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad		Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Objective	ZEISS	420640-9800-000	Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipette	ProLine	722020	5 to 50 μL
Powdered milk	Roth	T145.2
Sample mixer	Dynal	MXIC1
Scissors	B. Braun	BC257R	Blunt
Shaker	Apexlab	GS-20	50-300 rpm
Skalpel	Bochem	12646
Silk thread	B. Braun		3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher	S11223
Test tube	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane)	Helicon	H-1702-0.5	Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN microscope software	ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html