In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

Resumen

Describimos aquí el método para obtener imágenes de megacariocitos y proplatados en la médula del hueso del cráneo de ratones vivos utilizando microscopía de dos fotones.

Resumen

Las plaquetas son producidas por megacariocitos, células especializadas ubicadas en la médula ósea. La posibilidad de obtener imágenes de megacariocitos en tiempo real y su entorno nativo se describió hace más de 10 años y arroja nueva luz sobre el proceso de formación de plaquetas. Los megacariocitos extienden protuberancias alargadas, llamadas proplatletas, a través del revestimiento endotelial de los vasos sinusoides. Este artículo presenta un protocolo para obtener imágenes simultáneas en tiempo real de megacariocitos etiquetados fluorescentemente en la médula ósea del cráneo y los vasos sinusoides. Esta técnica se basa en una cirugía menor que mantiene el cráneo intacto para limitar las reacciones inflamatorias. La cabeza del ratón se inmoviliza con un anillo pegado al cráneo para evitar que los movimientos respiren.

Utilizando microscopía de dos fotones, los megacariocitos se pueden visualizar hasta por unas pocas horas, lo que permite la observación de protuberancias celulares y proplatlets en el proceso de elongación dentro de los vasos sinusoides. Esto permite cuantificar varios parámetros relacionados con la morfología de las protuberancias (anchura, longitud, presencia de zonas de constricción) y su comportamiento de elongación (velocidad, regularidad, o presencia de pausas o fases de retracción). Esta técnica también permite el registro simultáneo de plaquetas circulantes en los vasos sinusoides para determinar la velocidad plaquetaria y la dirección del flujo sanguíneo. Este método es particularmente útil para estudiar el papel de los genes de interés en la formación de plaquetas utilizando ratones modificados genéticamente y también es susceptible de pruebas farmacológicas (estudiar los mecanismos, evaluar medicamentos en el tratamiento de trastornos de producción de plaquetas). Se ha convertido en una herramienta invaluable, especialmente para complementar los estudios in vitro, ya que ahora se sabe que la formación de proplatlet in vivo e in vitro se basa en diferentes mecanismos. Se ha demostrado, por ejemplo, que los microtúbulos in vitro son necesarios para el alargamiento proplalet per se. Sin embargo, in vivo,más bien sirven como un andamio, el alargamiento es promovido principalmente por las fuerzas del flujo sanguíneo.

Introducción

Las plaquetas son producidas por células especializadas en megacariocitos ubicadas en la médula ósea. La forma precisa en que los megacariocitos liberan plaquetas en la circulación ha permanecido poco clara durante mucho tiempo debido al desafío técnico en la observación de eventos en tiempo real a través del hueso. La microscopía de dos fotones ha ayudado a superar este desafío y ha llevado a grandes avances en la comprensión del proceso de formación de plaquetas. Las primeras observaciones in vivo de megacariocitos fueron realizadas por von Andrian y sus colegas en 2007, con la visualización de megacariocitos fluorescentes a través del cráneo¹. Esto fue posible porque la capa ósea en el cráneo frontoparietal de ratones adultos jóvenes tiene un grosor de unas pocas decenas de micras y es lo suficientemente transparente como para permitir la visualización de células fluorescentes en la médula ósea subyacente².

Los estudios posteriores aplicaron este procedimiento para evaluar la formación de proplatlets en diversas condiciones y para descifrar los mecanismos subyacentes^3,4,5,6. Estos estudios proporcionaron evidencia definitiva de que los megacariocitos extienden dinámicamente las protuberancias, llamadas proplatlets, a través de la barrera endotelial de los vasos sinusoides(Figura 1). Estos proplatlets se liberan como fragmentos largos que representan varios cientos de plaquetas en volumen. Las plaquetas se formarán después de la remodelación de los proplatlets en la microcirculación de los órganos aguas abajo, especialmente en los pulmones⁷. Hasta la fecha, sin embargo, el proceso preciso y los mecanismos moleculares siguen siendo objeto de debate. Por ejemplo, el papel propuesto de las proteínas citoesqueléticas en el alargamiento de los proplatlets difiere entre las condiciones in vitro e in vivo ³, y las diferencias en la formación de proplatlet se han demostrado en condiciones inflamatorias⁶. Para complicar aún más las cosas, un estudio reciente cuestionó el concepto impulsado por proplatelets y propuso que in vivo,las plaquetas se forman esencialmente a través de un mecanismo de gemación de membrana en el nivel de megacariocitos^8.

Este trabajo presenta un protocolo para la observación de megacariocitos y proplatlets en la médula ósea a partir del hueso del cráneo en ratones vivos, utilizando un procedimiento mínimamente invasivo. Se han descrito enfoques similares para visualizar otras células de la médula, en particular las células madre y progenitoras hematopoyéticas⁹. El enfoque aquí está en la observación de megacariocitos y plaquetas para detallar algunos parámetros que se pueden medir, en particular las morfologías propallet y la velocidad plaquetaria. Este protocolo presenta cómo insertar un catéter en la vena yugular para inyectar trazadores fluorescentes y medicamentos y observar a través del hueso del cráneo. El hueso calvarial se expone mediante cirugía menor para que se pegue un anillo al hueso. Este anillo sirve para inmovilizar la cabeza y evitar movimientos debidos a la respiración y formar una copa llena de solución salina como medio de inmersión de la lente. Esta técnica es muy adecuada para i) observar en tiempo real la geometría sinusoide y los megacariocitos interactuando con la pared del vaso; ii) seguir a los megacariocitos en el proceso de formación, elongación y liberación de proplatlet; y iii) medir los movimientos plaquetarios para monitorear el flujo sanguíneo sinusoide complejo. Los datos obtenidos mediante este protocolo han sido publicados recientemente³.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre ética de los experimentos con animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, acuerdo sobre instalaciones para animales N°: G67-482-10, acuerdo de proyecto N°: 2018061211274514).

1. Preparación de ratones e inserción de un catéter en la vena yugular

NOTA: Aquí, machos o hembras, ratones reporteros mTmG de 5-7 semanas de edad fueron utilizados (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor^{tm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)}cruzados con ratones Pf4-cre^11,permitiendo el etiquetado de fluorescencia verde intenso en megacariocitos y plaquetas¹². Antes de comenzar el experimento, precaliente la cámara de calentamiento del microscopio durante unas horas.

1. Transporte el ratón a la sala de imágenes y proceda a la anestesia.
   1. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución de ketamina (ketamina (100 μg/g) y xilazina (10 μg/g) (5 μL/g).
      NOTA: La administración repetida de ketamina/xilazina se utiliza aquí y funciona bien, pero requiere la interrupción del registro para la reinyección regular. Alternativamente, si se dispone de una máquina de anestesia, la inducción de la anestesia puede realizarse con ketamina/xilazina y posteriormente mantenerse bajo inhalación de gases (mezcla de isoflurano, aire y oxígeno).
   2. Reemplace al animal en su jaula hasta que alcance la anestesia profunda. Coloque el ratón sobre una placa calentada calentada a 37 °C para todas las manipulaciones posteriores.
      NOTA: Mientras el animal alcanza la anestesia profunda, encienda el microscopio y todo el equipo (ver sección 4.1) y configure los diferentes parámetros necesarios (ver sección 4.2) para iniciar el experimento una vez realizada la cirugía. Aquí, el procedimiento dura solo 3 h y es terminal. El ratón es sacrificado después del experimento sin despertarse. Por lo tanto, la desinfección con etanol para la piel y los instrumentos es suficiente. Sin embargo, dependiendo de las pautas institucionales, o si el procedimiento duraría más tiempo, se deben utilizar métodos de desinfección más completos, como tres exfoliantes alternos con betadina / povidona y alcohol.
2. Instale un catéter en la vena yugular.
   NOTA: Es importante evitar la contaminación microbiana durante la cirugía en la medida de lo posible. Tenga cuidado de desinfectar cuidadosamente la piel con etanol al 70% (EtOH) antes de proceder con la cirugía. Siempre use tijeras y pinzas esterilizadas, y enjuáguelas regularmente en 70% EtOH. Trabaje en un lugar limpio y use una máscara facial. Se utiliza un catéter de 22 G "sobre la aguja", que consiste en una aguja dentro de un tubo de plástico, para la inyección intravenosa (consulte la Tabla de materiales).
   1. Coloque el ratón sobre su espalda y fije las patas anteriores con cinta quirúrgica para estirar la garganta (Figura 2A). Desinfectar la garganta con etanol al 70%.
      NOTA: Para mayor comodidad, la garganta se puede afeitar antes de la cirugía. Si el procedimiento dura más tiempo, se debe realizar un afeitado cuidadoso para una técnica aséptica adecuada.
   2. Haga una incisión de 0.7-1 cm sobre la vena yugular derecha o izquierda usando tijeras estériles. Estirar el tejido conectivo adyacente para exponer la vena yugular externa y la parte superior del músculo pectoral (Figura 2A).
   3. Llene el catéter con solución salina fisiológica tibia y estéril. Inserte el catéter en la vena después de penetrar a través del músculo pectoral (Figura 2B).
      NOTA: Tenga cuidado de evitar burbujas de aire dentro del catéter. Es importante insertar el catéter a través del músculo para prevenir la hemorragia, ya que el músculo formará un punto de compresión. Incluso los ratones con defectos de hemostasia, como los ratones Itgb3^-/-, no sangran al insertar el catéter con este enfoque.
   4. Retire suavemente la aguja y, si es necesario, mueva con cuidado el catéter más profundamente en la vena. Conecte la jeringa y estabilice el catéter agregando una gota de pegamento quirúrgico (Tabla de Materiales).
      NOTA: Es posible insertar un catéter dentro de la vena de la cola, aunque requiere algo de práctica porque la vena tiene un calibre más pequeño. Esto es especialmente difícil cuando se usan ratones con cabello oscuro, cuya vena de la cola apenas es visible. Debido a su mayor calibre, colocar el catéter dentro de la vena yugular puede permitir que se inyecten volúmenes más grandes o tratamientos repetidos de manera más confiable. Tenga en cuenta que la jeringa se llena por primera vez con solución salina tibia, y no olvide inyectar el volumen muerto antes de inyectar la solución de medicamento.
   5. Devuelva con cuidado el ratón a una posición prona (Figura 2C). Aplicar gel (Tabla de Materiales) en los ojos para prevenir la sequedad.

2. Cirugía e instalación del anillo craneal

NOTA: El soporte completo para la instalación del ratón comprende 4 piezas, un bloque y una placa, el anillo para sostener la cabeza del ratón y un tornillo para fijar el anillo al bloque(Figura 3A). Todos los elementos del soporte se han obtenido de i.materialise.com mediante impresión 3D. La placa está hecha de polímero de acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), el bloque y el tornillo de acero inoxidable, y el anillo de acero inoxidable de alta calidad (acero inoxidable de alto detalle) (Consulte la Figura suplementaria S1 para dimensiones y materiales suplementarios para los archivos de impresión 3D). El bloque se fija permanentemente al soporte, ya sea atornillado o pegado. Una vez que el anillo se fija en el cráneo del ratón, debe atornillarse al soporte del bloque (Figura 3A).

1. Humedezca el cabello en el cuero cabelludo con una toalla de papel mojada con etanol al 70% para la desinfección. Retire todo el cabello suelto con una toalla de papel mojada.
   NOTA: Para mayor comodidad, el cuero cabelludo puede afeitarse antes de la cirugía.
2. Incise el cuero cabelludo formando una T en la línea media hasta 1 cm y entre las orejas para exponer el calvario utilizando tijeras y pinzas finas estériles.
   NOTA: El anillo se colocará para superponerse a los huesos frontal y parietal (Figura 3B).
3. Use pinzas estériles para exponer el cráneo. Retire con cuidado el periostio con tijeras y pinzas. Use un hisopo de algodón estéril empapado con solución salina fisiológica para eliminar todo el periostio y cualquier residuo o cabello, lo que podría alterar las imágenes.
   NOTA: Para limitar las reacciones inflamatorias, tenga mucho cuidado de no dañar el hueso.
4. Elimine cualquier rastro de sangre enjuagando con solución salina y seque rápidamente el hueso con un hisopo de algodón seco. Aplique el gel de pegamento al anillo, colóquelo sobre el hueso expuesto y manténgalo durante unos segundos para que el anillo esté firmemente unido al cráneo.
   NOTA: Ningún pegamento debe entrar en el campo de observación, ya que puede conducir a una autofluorescencia indeseable.
5. Humedezca ligeramente el cráneo con un hisopo de algodón sumergido en solución salina fisiológica.
6. Prepare la pasta dental de silicio mezclando cuidadosamente los componentes azules y amarillos 1: 1. Aplique pasta dental alrededor del anillo para sellar y evitar fugas durante las imágenes. Retire con cuidado cualquier pasta dental o pegamento que pueda haber entrado en el anillo.
7. Llene el anillo con solución salina y verifique si hay fugas.
   NOTA: La solución salina sirve como medio de inmersión para el objetivo del microscopio. El sangrado puede ser más crítico cuando se usan ratones con defectos relacionados con la hemostasia. Es esencial evitar que la sangre entre en el anillo, ya que puede difuminar más imágenes.
8. Coloque el ratón sobre el soporte y atornille el anillo en el soporte del bloque (Figura 3C). Coloque compresas dobladas debajo de la cabeza del animal para levantar la cabeza y evitar el desprendimiento del anillo del cráneo.
   NOTA: La cabeza está fijada directamente para evitar los movimientos de imagen debido a la respiración.
9. Coloque el soporte y el conjunto del ratón en la cámara del microscopio calentada(Figura 3D).
   NOTA: Tenga cuidado de no desalojar el catéter insertado en ningún momento.

3. Seguimiento de los ratones anestesiados hasta el final del experimento

NOTA: La anestesia se reinduce cada 35 min alternando inyecciones subcutáneas (s.c.) de ketamina (25 μg/g) en un volumen de 5 μL/g de peso corporal y una mezcla de ketamina (50 μg/g) y xilazina (5 μg/g) (1,2 μL/g). Como no es posible abrir la cámara del microscopio calentada durante la adquisición, se realiza un monitoreo anestésico antes y después de la administración del anestésico mediante pellizco del dedo del pie. Del mismo modo, el pellizco del dedo del dedo del dedo del día se realiza antes de comenzar cada nueva grabación de video.

1. Si es necesario, detenga la adquisición y vuelva a inducir la anestesia mediante inyección de s.c.
   1. Teniendo cuidado de no mover la cabeza del ratón, pellizque la piel de la espalda entre el pulgar y el dedo índice de la mano izquierda. Inyecte por vía subcutánea el anestésico en el pliegue de la piel de la espalda con la mano derecha (o viceversa para las personas zurdas).
2. Verifique la presencia de solución salina en el anillo y, si es necesario, llénelo con solución salina fresca. Continúe grabando durante los próximos 35 minutos y proceda de manera similar durante la duración de la grabación.
3. Al final del experimento, eutanasia al ratón por dislocación cervical antes de que se despierte.
   NOTA: El ratón se mantiene anestesiado durante un tiempo máximo de 3 h, de acuerdo con el comité ético y de bienestar animal local.

4. Imágenes de dos fotones

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el microscopio y el equipo relacionado. Las imágenes se grabaron con un escáner resonante (12 u 8 kHz). El modo bidireccional se configuró para aumentar la adquisición de velocidad a medida que los píxeles se registran en ambas direcciones; por lo tanto, cualquier desajuste en la fase debe corregirse con la "corrección de fase" del panel de control. Finalmente, se estableció un promedio adaptado como un compromiso entre la velocidad de adquisición y la relación señal-ruido.

1. Encienda el microscopio de dos fotones, incluido el láser y el escáner resonante (la potencia del láser de salida generalmente ~ 1.8-2.5 W dependiendo del láser).
2. Establezca la longitud de onda láser adecuada para los fluoróforos elegidos. Establezca la longitud de onda adecuada para la recuperación de las luces emitidas.
   NOTA: Aquí, se utilizó una longitud de onda de 913 nm y detectores híbridos (500-550 nm y 575-625 nm) para excitar y detectar simultáneamente AlexaFluor-488 y Qtracker-655, respectivamente.
3. Usando el catéter intrayugular, inyecte el marcador fluorescente para etiquetar la vasculatura (Qtracker-655; Tabla de Materiales). Inyectar 50 μL/ratón de una solución a 0,2 μM, renovada una vez cada hora para un máximo de 150 μL/experimento.
   NOTA: Se pueden utilizar otros trazadores como el dextrano¹de alto peso molecular. En ese caso, considere que la viscosidad de la sangre puede ser alterada por el dextrano y modifique algunos parámetros hemorreológicos.
4. Coloque la etapa del microscopio con el soporte y el mouse debajo del objetivo del microscopio. Revisa que el anillo esté siempre lleno de solución salina y sumerge el objetivo. Use la epifluorescencia para localizar los vasos de la médula ósea (rojo) y la presencia de megacariocitos (verde) alineados a lo largo de los vasos sinusoides.
   NOTA: El hueso del cráneo tiene un grosor inferior a 100 μm². La médula se encuentra debajo del hueso y es fácilmente reconocible por los megacariocitos verdes fluorescentes y los densos vasos sinusoides anastomosados rojos etiquetados por Qtracker-655.
5. Adquisiciones largas (megacariocitos, proplatlets)
   1. Busque la región de interés. Aplique los parámetros de adquisición de imágenes como se mencionó anteriormente.
   2. Para adquisiciones largas (por ejemplo, visualización de la formación o elongación de proplatelets), adquiera imágenes de pila z con intervalos optimizados (generalmente entre 0,85 y 1,34 μm) utilizando un escáner resonante de 8 kHz.
      NOTA: Un escáner resonante de 12 kHz puede aumentar la velocidad de adquisición.
   3. Adquiere imágenes de 384 x 384 píxeles para visualizar todo el megacariocito y la vasija. Utilice el promedio de línea, según lo desee, para una adquisición rápida con buena resolución. Determine el intervalo de tiempo de adquisición de la pila de imágenes, generalmente 10 s o 30 s para la visualización de proplatelets.
      NOTA: Aquí, se utilizó un promedio de línea de 8 para obtener una mayor relación señal-ruido, lo que permitió la adquisición de 1 imagen/10 s con un escáner resonante de 8 kHz. Asegúrese de que se permita el promedio de línea durante la adquisición en vivo.
6. Adquisición corta y rápida (plaquetas)
   NOTA: Para una adquisición más corta de eventos rápidos, como la velocidad plaquetaria, es esencial maximizar la velocidad de adquisición de fotogramas. La selección del tipo de adquisición adecuado optimizará la velocidad de adquisición de fotogramas (es decir, un tipo de adquisición espacio-temporal "xyt").
   1. Minimice (por ejemplo, 256 x 90 píxeles) y ajuste el tamaño de la imagen al recipiente girando el campo de imágenes, si es necesario.
   2. Utilice la velocidad de escaneo más alta disponible.
   3. Utilice el escaneo bidireccional.
      NOTA: Para el escaneo bidireccional, asegúrese de que la fase esté bien ajustada.
   4. Minimice el promedio de línea para encontrar el compromiso óptimo entre la definición de la imagen y la rapidez de adquisición.
      NOTA: Para las mediciones de la velocidad de las plaquetas, una imagen pixelada puede ser suficiente si ayuda a aumentar la rapidez de adquisición.
   5. Minimice la pila z para aumentar la rapidez de adquisición. Adquirir solo 1 pila z es suficiente para cuantificar la velocidad plaquetaria. Adquirir durante 10-20 s para medir la velocidad plaquetaria.
      NOTA: Se puede obtener un máximo de 133 fotogramas/s utilizando estas condiciones con un escáner resonante de 12 kHz. Los parámetros deben adaptarse a las condiciones. En algunos vasos, la velocidad plaquetaria es, sin embargo, demasiado alta para cuantificar la velocidad plaquetaria con estos ajustes de manera confiable.
7. Medición de ancho y largo de proplatelet
   NOTA: Para cargar los archivos LIF obtenidos en el software Leica con ImageJ, primero descargue e instale el complemento LOCI en ImageJ para utilizar el Importador de bioformatos.
   1. Ancho del proplatelet
      1. Abra la película con ImageJ. Para realizar la medición de anchura, use solo la película de los proplatelets sin el recipiente. Para separar los diferentes canales, haga clic en Imagen| Colorea y selecciona Dividir canales.
      2. Para una película de pila z, haga una proyección z promedio para cada punto de tiempo haciendo clic en Imagen| Pilas y seleccione Proyecto Z. En Tipo de proyección, introduzca Intensidad media.
      3. Trate la imagen para eliminar el ruido. Reste el fondo haciendo clic en Proceso| Reste el fondo y aplique el radio de la bola rodante: 50.0 píxeles. Suaviza la imagen haciendo clic en Procesar y Suavizar.
      4. Traza una línea cerca de la base del proplatelet (cerca del megacariocito, evitando cualquier otro objeto).
         NOTA: No olvide establecer la escala de la imagen para obtener el valor en la unidad deseada haciendo clic en Analizar y Establecer escala. De forma predeterminada, la unidad de la imagen está en píxeles.
      5. Traza el perfil de intensidad, ajusta una curva gaussiana y calcula el ancho completo a medio máximo (FWHM). Para eso, escriba el siguiente script en una macro haciendo clic en Plugins| Nuevo y seleccione Macro y ejecutarlo haciendo clic en Macro| Ejecutar macro: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("Gaussiano",x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) ) * sigma; imprimir (FWHM).
         NOTA: Asegúrese de que solo haya un pico en el escaneo de línea, correspondiente a la intensidad del proplatelet.
      6. Realice las acciones descritas en el paso 4.7.5 en 1 segmento o repita a lo largo del tiempo para obtener el ancho medio del proplatelet
   2. Longitud del proplatelet
      1. Traza una línea a lo largo del proplatelet, desde la base cerca del megacariocito hasta la parte superior. Utilice una línea segmentada para seguir la forma proplatelet. Repítelo para cada punto de tiempo.
      2. Recuerda guardar cada línea usando el ROI Manager: haz clic en Analizar | Herramientas y seleccione ROI Manager. Haga clic en Agregar en la ventana ROI Manager para agregar cada línea al administrador tal como está seleccionado. Para guardar todas las líneas de una carpeta, haga clic en el Administrador de ROI al anular la selección | Más y haga clic en Guardar. Desde el Gestor de ROI, extraiga el valor de longitud de cada línea (Medida) de la tabla de resultados.
         NOTA: No olvide establecer la escala de la imagen para obtener el valor en las unidades deseadas haciendo clic en Analizar y Establecer escala. De forma predeterminada, la unidad de la imagen está en píxeles.
8. Medición de la velocidad plaquetaria
   NOTA: La velocidad plaquetaria se calcula a partir de la grabación de video de plaquetas fluorescentes que fluyen dentro del vaso durante 10-20 s. Se realiza un tratamiento de primera imagen para obtener datos de escaneo de línea repetidos cíclicamente. El movimiento conduce a rayas cuyo ángulo depende de la velocidad, lo que permite su cálculo. Aquí, la velocidad se calculó con un método que utiliza la transformada de radón, que es más robusta que el método clásico de descomposición del valor singular (SVD)¹⁵.
   1. Tratamiento de imágenes con ImageJ
      1. Abra la película con ImageJ. Aplicar un filtro de desenfoque gaussiano haciendo clic en Procesar | Filtros, seleccione Desenfoque gaussianoy aplique Sigma (Radio): 2.00. Elija una región pequeña para medir el flujo y trace 3 líneas adyacentes siguiendo la dirección del flujo.
         NOTA: No olvide guardar cada línea utilizando el Administrador de ROI haciendo clic en Analizar | Herramientas | Gestor de ROI. Haga clic en Agregar en la ventana de ROI Manager para agregar cada línea y guardarlas; haga clic primero en Anular selección | Más y luego haga clic en Guardar.
      2. Usando el software de escaneo de línea ImageJ, cree un kymograph para cada línea haciendo clic en Image | Pilas; seleccione Reslice y aplique los siguientes parámetros: Espaciado de salida (micras): 1.000 / Recuento de segmentos: 1 / Evitar interpolación. Guarde las imágenes espacio-tiempo resultantes.
         NOTA: La imagen resultante muestra rayas correspondientes al movimiento lineal de las plaquetas en el flujo sanguíneo a lo largo del tiempo. El ángulo de una raya es una función de la velocidad.
   2. Medición de velocidad con el software Matlab o GNU Octave
      NOTA: La velocidad de las plaquetas en el flujo sanguíneo se estima a partir de las imágenes espacio-temporales utilizando un método de análisis computacional basado en la transformada de radón descrita por Drew y colaboradores¹⁵. La descripción de este método matemático está más allá del alcance de esta revisión, y el lector es referido a la publicación de Drew et al. para obtener detalles sobre el cálculo¹⁵. Tanto el código de Matlab como más información están disponibles en su sitio web https://www.drew-lab.org/code.
      1. Abra el código usando el software Matlab o GNU Octave.
         NOTA: El código puede requerir adaptación de acuerdo con el estudio deseado.
      2. Extraiga el valor de las 3 imágenes espacio-temporales, correspondientes a las líneas adyacentes dibujadas en la misma porción del buque. Calcule el valor medio de la velocidad del flujo plaquetario para esta porción del vaso.
         NOTA: No olvide convertir el resultado en la unidad de medida correcta (por ejemplo, μm/s).

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Resultados

Usando este protocolo, el trazador fluorescente, Qtracker-655, se administró por vía intravenosa para obtener imágenes de los vasos sinusoides de la médula ósea anastomosados en la médula ósea del cráneo y la dirección del flujo como se muestra en las flechas(Figura 4A,izquierda). Usando ratones mTmG, las plaquetas fluorescentes eGFP se registraron a lo largo de 20 s en cada rama del vaso, y su velocidad se midió utilizando el software ImageJ y GNU Octave(Figur...

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Discusión

Los mecanismos de formación de plaquetas son altamente dependientes del entorno de la médula ósea. Por lo tanto, la microscopía intravital se ha convertido en una herramienta importante en el campo para visualizar el proceso en tiempo real. Los ratones con megacariocitos fluorescentes se pueden obtener cruzando ratones que expresan la cre recombinasa en megacariocitos con cualquier ratón reportero floxed que contenga un casete de expresión génica fluorescente condicional. Aquí, se utilizaron ratones reporteros mT...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
GNU Octave software	GNU Project		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95	Leica Microsystems		simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 vascular label	Invitrogen	Q21021MP	injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Superglue gel			to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)	Coherent