Minimizar el sangrado de la vena porta posterior a la infusión durante el trasplante intrahepático de islotes en ratones

Resumen

Aquí presentamos procedimientos quirúrgicos refinados para realizar con éxito el trasplante intraportal de islotes, un procedimiento quirúrgico clínicamente relevante pero técnicamente desafiante, en ratones.

Resumen

Aunque el hígado se acepta actualmente como el sitio de trasplante primario para islotes humanos en entornos clínicos, los islotes se trasplantan debajo de la cápsula renal en la mayoría de los estudios preclínicos de trasplante de islotes en roedores. Este modelo se usa comúnmente porque el trasplante de islotes intrahepáticos murinos es técnicamente desafiante, y un alto porcentaje de ratones podría morir por complicaciones quirúrgicas, especialmente sangrado del sitio de inyección después del trasplante. En este estudio, se demuestran dos procedimientos que pueden minimizar la incidencia de sangrado de la vena porta después de la infusión. El primer método aplica una esponja de gelatina hemostática absorbible al sitio de inyección, y el segundo método consiste en penetrar la aguja de inyección de islotes a través del tejido graso primero y luego en la vena porta mediante el uso del tejido graso como una barrera física para detener el sangrado. Ambos métodos podrían prevenir eficazmente la muerte del ratón inducida por sangrado. Se presentó toda la sección hepática que muestra la distribución de los islotes y la evidencia de trombosis de los islotes después del trasplante, una característica típica del trasplante intrahepático de los islotes. Estos protocolos mejorados refinan los procedimientos de trasplante intrahepático de islotes y pueden ayudar a los laboratorios a establecer el procedimiento para estudiar la supervivencia y la función de los islotes en entornos preclínicos.

Introducción

El trasplante intraportal de islotes (IIT) a través de la vena porta es el método más utilizado para el trasplante de islotes humanos en entornos clínicos. El modelo IIT de ratón ofrece una gran oportunidad para estudiar el trasplante de islotes y probar enfoques intervencionistas prometedores que pueden mejorar la eficacia del trasplante de islotes1. El IIT fue descrito por primera vez en la década de 1970 y utilizado por varios grupos1,2,3,4,5. Recuperó popularidad después del avance en el trasplante de islotes humanos en el año 20006,7. Sin embargo, la mayoría de los estudios de trasplante de islotes utilizaron la cápsula renal como un sitio preferido para el trasplante experimental de islotes debido a su fácil éxito. Por el contrario, el IIT es más desafiante técnicamente y se utiliza con menos frecuencia para los estudios de trasplante de ^islotes8,9. Sin embargo, a diferencia del IIT, los islotes trasplantados debajo de la cápsula renal no sufren la reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre caracterizada por trombosis, inflamación e isquemia del tejido hepático y, por lo tanto, tienen una mejor función que los islotes trasplantados al hígado. El modelo de cápsula renal, por lo tanto, puede no imitar completamente las tensiones encontradas por los islotes en el trasplante de islotes humanos10,11,12.

Una de las principales complicaciones de la IIT en ratones es el sangrado del lugar de inyección después del trasplante, lo que podría causar un 10-30% de mortalidad entre diferentes cepas de ^ratón12. En este documento, se han desarrollado dos enfoques refinados para detener el sangrado de manera más rápida y segura y para reducir la mortalidad del ratón después de un IIT. La demostración visual de estos detalles refinados ayudará a los investigadores a identificar los pasos clave de este procedimiento técnicamente desafiante. Además, la ubicación de los injertos de islotes en el hígado del receptor se determinó mediante el examen histológico del tejido hepático teñido de hematoxilina y eosina (H&E) (sección completa) que lleva islotes trasplantados.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur y el Centro Médico Ralph H Johnson en Charleston.

1. Inducción de la diabetes usando estreptozotocina (STZ)

1. Preparación de ratones receptores:
   1. Pesa todos los ratones individualmente.
   2. Verifique los niveles de glucosa en la sangre de una muestra de sangre de la vena de la cola usando un glucómetro.
2. Determinación de la dosis de STZ para tres escenarios diferentes:
   1. Para los ratones con enfermedad del hígado graso, inyecte una dosis de STZ [40 mg/kg/día, inyección intraperitoneal (i.p.)] durante 5 días consecutivos.
   2. Para los ratones NOD-SCID inyectar 125 mg/kg de STZ, inyección única, i.p. después del ayuno nocturno.
   3. Para ratones C57BL/6 inyectar 225 mg/kg de STZ, inyección única, i.p.
3. Cálculos para STZ (13,5 mg/ml):
   NOTA: Este cálculo es para cinco ratones C57BL/6 con pesos corporales de 30 g:
   1. Peso corporal total: 5 ratones x 30 g/ratón = 150g
   2. STZ necesario: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg
4. Preparación STZ:
   1. Pesar la STZ después de la dosis precalculada.
   2. Transfiera el polvo STZ pesado a un vaso de precipitados de 10 ml sobre hielo.
   3. Agregue 3 ml de solución de citrato de sodio al vaso de precipitados para disolver el STZ.
   4. Mezcle bien, esterilice el filtro a través de un poro de 0,22 μm y use la solución STZ dentro de los 10 minutos posteriores a la preparación.
5. Inyección STZ:
   1. Cargue la cantidad deseada de solución STZ (suficiente para un ratón) en una jeringa de 1 ml.
   2. Realice la inyección intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho del abdomen del ratón.
   3. Observe a los ratones durante 5 minutos después de la inyección y verifique si hay signos de incomodidad durante este período de tiempo antes de volver a colocarlos en las jaulas.
   4. Controle el nivel de glucosa en sangre de una muestra de sangre de la vena de la cola usando un glucómetro diariamente después de la inyección de STZ.
      NOTA: En este experimento, los ratones se consideran diabéticos cuando la glucosa en sangre no ayunada se > 350 mg / dL durante dos días consecutivos.

2. Preparación de islotes

NOTA: Los islotes humanos fueron cultivados en medios CMRL-1066 suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) a una densidad de 10.000 islotes equivalentes (IEQ) por plato de cultivo celular de 100 ^mm9. Los islotes de ratón se cultivaron en DMEM con 10% de FBS y 1% de P/S con la misma ^densidad13. Los ratones machos NOD-SCID y C57BL/7 entre 6-10 semanas de edad se obtuvieron de fuentes comerciales.

1. Separe los islotes cultivados de la placa de cultivo celular mediante un rascado suave.
2. Seleccione a mano el número deseado de islotes (por ejemplo, 300-350 islotes) utilizando una jeringa de 1 cc y colóquelos en tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo.
3. Gire el tubo durante 10 segundos con la microcentrífuga.
4. Retira el sobrenadante, dejando un poco de líquido para evitar perder el pellet.
5. Resuspend el pellet en 200 μL de HBSS con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%.
6. Aspire los islotes resuspendidos en una jeringa de insulina de 0,5 ml.
7. Coloque la jeringa en posición vertical. Deje que los islotes se hundan durante 1 min.
8. Empuje la jeringa para eliminar todas las burbujas, dejando alrededor de 100-150 μL de líquido que contiene islotes.
9. Coloque la cabeza de la jeringa hacia abajo y golpee suavemente el costado de la jeringa para permitir que los islotes se distribuyan equitativamente por todo el líquido. Los islotes ya están listos para la inyección.

3. Trasplante de islotes

1. Inducir y mantener al ratón bajo anestesia general con isoflurano al 2%. Compruebe la falta de reflejos del pedal para garantizar la anestesia adecuada del animal.
2. Afeitarse y quitar el pelaje en el área del abdomen del ratón.
3. Administrar una dosis única preoperatoria de buprenorfina (0,1 mg/kg p.i.).
4. Desinfectar la zona quirúrgica con tres toallitas alternas de 2% de yodo y 75% de alcohol.
5. Realizar una laparotomía con micro tijeras para generar una incisión de 1-1,5 cm.
6. Abra la cavidad peritoneal con un retractor. Siga con el método A o el método B como se detalla a continuación.

4. Método A: (detener el sangrado con espuma de gel, Figura 1A)14,15,16

1. Preparación del ratón
   1. Coloque una gasa estéril alrededor de la incisión.
   2. Extraiga suavemente el intestino con un fórceps y manténgalo en la gasa.
   3. Identificar la vena porta por su ubicación y exponerla bien.
   4. Cubra el intestino con una gasa tibia húmeda en solución salina durante toda la cirugía.
2. Inserte la aguja de la jeringa de insulina precargada del islote a través de la vena porta cerca del duodeno (Figura 1B). Para hacerlo, sostenga la aguja con el orificio (bisel) hacia abajo y coloque el ángulo de la superficie de apertura paralela a la pared de la vena porta antes de penetrar a través de la pared.
   1. Tire del émbolo para extraer un poco de sangre (20-50 μL) en la jeringa para mezclar primero los islotes.
   2. Infundir los islotes en la vena porta lentamente mientras tira y empuja repetidamente la zambullida.
   3. Coloque un trozo de espuma de gel (aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm de tamaño) para cubrir el sitio de inyección.
   4. Presione la espuma de gel hacia abajo con una punta de algodón mientras extrae la aguja de la vena porta.
   5. Continúe presionando el gel durante aproximadamente 2 minutos para confirmar que no hay sangrado activo.
   6. Enrolle la punta de algodón sobre y lejos de la espuma de gel para asegurarse de que la espuma de gel cubra bien la vena porta.

5. Método B: (detener el sangrado con almohadilla de grasa, Figura 1C)¹⁷

1. Exponga la vena porta a fondo.
   1. Use dos puntas de algodón para sostener la vena porta expuesta tanto del lado izquierdo como del derecho.
   2. Identifique la almohadilla de tejido graso entre el duodeno y la vena porta.
   3. Penetre a través de la almohadilla de grasa antes de insertar la aguja en la vena porta (Figura 1D).
   4. Infundir los islotes, siguiendo el procedimiento similar descrito anteriormente en las partes 4.2.1 y 4.2.2 del método A.
   5. Saque la aguja mientras presiona la grasa con una punta de algodón.
   6. Continúe presionando la almohadilla de grasa durante 1 minuto después de quitar la aguja.
2. Después de confirmar que no hay sangrado de la vena porta, devuelva suavemente el intestino a la cavidad peritoneal en su posición original.
3. Dejar 0,5 ml de solución salina tibia (36-37 °C) en la cavidad abdominal antes del cierre.
   NOTA: La solución salina tibia facilita el movimiento y la recuperación del intestino después de la cirugía y previene la necrosis intestinal.
4. Cierre la capa muscular con una sutura 5-0.
5. Cierre la capa de la piel con una sutura 4-0.
6. Coloque el ratón en una jaula limpia en una almohadilla térmica hasta que se recupere completamente de la anestesia.
7. Continúe proporcionando un analgésico (por ejemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) cada 12 h y calor suplementario durante 48 h después de la cirugía.
   NOTA: El procedimiento de trasplante de islotes tarda aproximadamente 15-20 minutos en completarse.

6. Tinción de H&E y fotografía de toda la sección del hígado

1. Perfusión hepática
   1. Ponga al ratón bajo anestesia como se describe anteriormente en la parte 3.1.
   2. Exponga cuidadosamente la vena porta y corte la vena cava inferior.
   3. Perfundir manualmente el hígado utilizando 20 ml de paraformaldehído al 10% a través de la vena porta durante aproximadamente 5 minutos, utilizando una jeringa de 20 ml con aguja ^25G18.
      NOTA: La perfusión hepática puede eliminar la sangre del tejido hepático y mejorar la fijación hepática sin alterar los injertos de los islotes.
   4. Diseccionar el hígado entero perfundido de otros órganos.
   5. Fijar el tejido hepático perfundido en paraformaldehído al 10% durante 24 h.
   6. Incrustar el tejido en parafina.
   7. Corte secciones de tejido de 5 μm de espesor cada una y colóquelas en un portaobjetos de vidrio para mancharlas.
   8. Realizar tinción de H&E, insulina, fibrina y neutrófilos polimorfonucleares (PMN) utilizando métodos ^{estándar15,16}.
   9. Escanee toda la sección del hígado bajo un microscopio.

Resultados

Se realizaron trasplantes singénicos y xenogénicos de islotes a través de la vena porta. La función del injerto de islotes se observó de manera dependiente de la dosis en ambos modelos de trasplante de islotes. En el modelo de trasplante de islotes singénicos utilizando ratones C57BL/6, el trasplante de 250 islotes condujo a normoglucemia transitoria antes de que los ratones volvieran a la hiperglucemia. Los ratones que recibieron 500 islotes alcanzaron y mantuvieron la normoglucemia más allá de los 30 días post...

Discusión

En este estudio, se han demostrado dos procedimientos mejorados que pueden prevenir el sangrado y pueden reducir la mortalidad del ratón durante el IIT del ratón. Este estudio permite a los investigadores visualizar el modelo de trasplante de islotes que es único en el estudio de la respuesta inflamatoria instantánea mediada por la sangre después del trasplante. El modelo IIT es un modelo distintivo para estudiar la supervivencia de las células de los islotes y las lesiones isquémicas hepáticas en respuesta al tr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
1 mL Syringe with needle	AHS	AH01T
20 mL Syringe	BD	301031
25G x 5/8" hypodermic needles	BD	305122
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
CMRL-1066	Corning	15110CV
DMEM	Corning	10013CV
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35011CV
FreeStyle  Glucose meter	Abbott	Lite
FreeStyle Blood Glucose test strips	Abbott	Lite
Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP)	Pharmacia & Upjohn Company	34201
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 27-gauge needle	BD	879588
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Penicillin/streptomycin (P/S)	HyClone	SV30010
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Streptozocin (STZ)	Sigma	S0130
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416