Evaluación de la resección final global de DOBLE cadena de ADN utilizando el etiquetado brdU-DNA junto con imágenes de discriminación del ciclo celular

Resumen

En el presente protocolo, demostramos cómo visualizar la resección final de doble cadena de ADN durante la fase S / G2 del ciclo celular utilizando un método basado en inmunofluorescencia.

Resumen

El estudio de la respuesta al daño del ADN (DDR) es un campo complejo y esencial, que solo se ha vuelto más importante debido al uso de medicamentos dirigidos a DDR para el tratamiento del cáncer. Estos objetivos son las poli(ADP-ribosa) polimerasas (PARP), que inician diversas formas de reparación del ADN. La inhibición de estas enzimas utilizando inhibidores de PARP (PARPi) logra una letalidad sintética al conferir una vulnerabilidad terapéutica en células deficientes en recombinación homóloga (HR) debido a mutaciones en cáncer de mama tipo 1 (BRCA1), BRCA2, o pareja y localizador de BRCA2 (PALB2).

Las células tratadas con PARPi acumulan roturas de doble cadena de ADN (DSB). Estas roturas son procesadas por la maquinaria de resección final del ADN, lo que lleva a la formación de ADN monocatenario (ss) y la posterior reparación del ADN. En un contexto deficiente en BRCA1, la revitalización de la resección del ADN a través de mutaciones en los inhibidores de la resección del ADN, como 53BP1 y DYNLL1, causa resistencia a PARPi. Por lo tanto, ser capaz de monitorear la resección del ADN en el celulo es fundamental para una comprensión más clara de las vías de reparación del ADN y el desarrollo de nuevas estrategias para superar la resistencia a PARPi. Las técnicas basadas en la inmunofluorescencia (IF) permiten monitorear la resección global del ADN después del daño del ADN. Esta estrategia requiere el etiquetado de ADN genómico de pulso largo con 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU). Después del daño del ADN y la resección final del ADN, el ADN monocatenario resultante es detectado específicamente por un anticuerpo anti-BrdU en condiciones nativas. Además, la resección del ADN también se puede estudiar utilizando marcadores del ciclo celular para diferenciar entre varias fases del ciclo celular. Las células en la fase S/G2 permiten el estudio de la resección final dentro de HR, mientras que las células G1 se pueden utilizar para estudiar la unión final no homóloga (NHEJ). En este documento se describe un protocolo detallado para este método IF acoplado a la discriminación del ciclo celular.

Introducción

La modulación de los factores de reparación del ADN es un método en constante evolución para la terapia del cáncer, particularmente en entornos tumorales deficientes en la reparación del DSB de ADN. La inhibición de factores de reparación específicos es una de las ingeniosas estrategias utilizadas para sensibilizar a las células cancerosas a agentes dañinos para el ADN. Décadas de investigación condujeron a la identificación de varias mutaciones de genes de reparación del ADN como biomarcadores para las opciones de estrategia ^{terapéutica1}. En consecuencia, el campo de la reparación del ADN se ha convertido en un centro para el desarrollo de fármacos para garantizar una amplia gama de tratamientos, potenciando el concepto de medicina personalizada.

Los DSB son reparados por dos vías principales: NHEJ y ^HR2. La vía NHEJ es propensa a errores, ligando rápidamente los dos extremos de ADN con poco o ningún procesamiento final de ADN e involucrando la proteína quinasa (DNA-PKCs), el complejo Ku70/80, 53BP1 y las proteínas RIF13. En contraste, la RRHH es un mecanismo fiel iniciado por ^BRCA14. Un paso esencial en la reparación de HR es el proceso de resección del extremo del ADN, que es la degradación de los extremos rotos que conduce a ADN monocatenario (ss) con extremos 3'-OH. BRCA1 facilita el reclutamiento de las proteínas aguas abajo que forman el resectosoma MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, que intervienen en la resección del ADN de 5' a ^3'5.

La resección final inicial se logra a través de la actividad de endonucleasa de MRE11, lo que permite un procesamiento posterior por parte de las nucleasas DNA2 y EXO1. Los voladizos de ssDNA generados son rápidamente recubiertos por la proteína de replicación A (RPA) para protegerlos de un procesamiento posterior. Posteriormente, BRCA2, PALB2 y BRCA1 se comprometen a mediar en el desplazamiento de RPA y el ensamblaje del nucleofilamento RAD51 requerido para el mecanismo de reparación dirigido por homología. Un equilibrio fino entre el uso de NHEJ y HR es necesario para el mantenimiento óptimo de la integridad genómica. La elección de la vía depende de la fase del ciclo celular. HR se utiliza preferentemente durante las fases S a G2 en las que la resección de ADN está en el nivel más alto, y las cromátidas hermanas están disponibles para garantizar una reparación adecuada.

La poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1) es una de las primeras proteínas reclutadas para el DSB. Regula tanto la actividad de resección como el ensamblaje de los efectores aguas abajo implicados en el ^NHEJ5,6. PARP-1 también es necesario para la reparación de roturas monocatenarias de ADN durante la ^{replicación7,8}. Debido a su importante papel en la reparación del ADN, los inhibidores de PARP (PARPi) se utilizan como terapias contra el cáncer. En varios cánceres con deficiencia de FC, el tratamiento con PARPi conduce a una respuesta letal sintética debido a la incapacidad de las células deficientes en HR para reparar el daño acumulado a través de una vía ^{alternativa9,10}. Actualmente hay cuatro PARPi aprobados por la FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib y Talazoparib (también llamado BMN 673), que se utilizan para diversos tratamientos contra el cáncer de mama y ^ovario11. Sin embargo, la resistencia a PARPi es común, y una causa potencial surge a través de la readquisición de la competencia en ^RRHH12. La pérdida o inhibición de PARP-1 en presencia de irradiación desregula la maquinaria del resectosoma, lo que lleva a la acumulación de tractos ssDNA más ^largos13. Por lo tanto, un estudio en profundidad de la resección del ADN in vivo es fundamental para una comprensión más clara de las vías de reparación del ADN y el posterior desarrollo de nuevas estrategias para tratar el cáncer y superar la resistencia a PARPi.

Se han empleado varios métodos para detectar eventos de resección de ^ADN5. Uno de estos métodos es la técnica clásica basada en IF que permite la tinción indirecta y la visualización del ADN resecado después de un DSB inducido por estrés mediante el uso de un anticuerpo anti-RPA. Etiquetar el ADN genómico con 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) y detectar solo ssDNA es una medida directa de los eventos de resección del ADN. Elude el monitoreo de RPA, que está involucrado en múltiples procesos celulares como la replicación del ADN. En el método descrito aquí, las células incubadas con BrdU para un solo ciclo celular permiten que BrdU se incorpore a una hebra del ADN celular replicante. Después de la resección, la tinción de IF se realiza en condiciones que permiten la detección de BrdU solo en forma de ssDNA, con el uso de un anticuerpo anti-BrdU. Este anticuerpo solo puede acceder a los nucleótidos brdU expuestos y no detectará los integrados en el ADN de doble cadena. Utilizando microscopía de fluorescencia, el ADN resecado se puede visualizar en forma de focos de BrdU/ssDNA punteados. La intensidad nuclear de estos focos se puede utilizar como una lectura para cuantificar la resección después del daño en el ADN. Este artículo describe paso a paso los procesos de este método, que se puede aplicar a la mayoría de las líneas celulares de mamíferos. Este método debe ser de amplia utilidad como una forma simple de monitorear la resección final del ADN en el celulo, como prueba de concepto.

Protocolo

1. Cultivo celular, tratamientos y preparación de hojas de cubierta

NOTA: Todos los recubrimientos celulares, transfecciones y tratamientos, aparte de la irradiación, deben realizarse bajo una campana de cultivo celular estéril.

1. Día 1
   1. En una placa de 6 pocillos, coloque una sola cubierta en cada pozo para tantas condiciones como sea necesario. Placa ~ 150,000 células HeLa para transfección o tratamiento farmacológico, según se desee.
      NOTA: Si es transfectante, se recomienda hacer una transfección inversa en el momento del recubrimiento, o es posible hacer una transfección hacia adelante varias horas después del recubrimiento para permitir la adherencia. Una transfección inversa se logra agregando la mezcla de transfección a la cubierta antes de que se agreguen las células; por lo tanto, la transfección comienza antes de que las células comiencen a adherirse. Una transfección hacia adelante, por el contrario, es la adición de la mezcla de transfección después de la adherencia a la superficie generalmente al día siguiente. Sin embargo, es posible hacer esto el mismo día, siempre que se dé suficiente tiempo para que las células se adhieran.
   2. Para este método, use 4 pocillos: Pozo 1: control de siRNA (denominado siCTRL); Pozo 2: siRNA contra PARP-1 (siPARP-1); Pozo 3: no tratado; Pozo 4: Células a tratar con 5 μM BMN673 1 h antes de la irradiación.
      NOTA: En este protocolo, todas las pruebas se realizaron en condiciones irradiadas (ver sección 1.3).
   3. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de _CO2 durante la noche, aunque el protocolo de transfección permite hasta 3 días de incubación. El tiempo de incubación antes del tratamiento con BrdU dependerá de la eficiencia de la transfección de siRNA. Si no hay transfección, la incubación durante 16 h es suficiente para permitir la adherencia al coverslip y cierto crecimiento celular.
      NOTA: Las condiciones de la incubadora se pueden cambiar de acuerdo con la línea celular utilizada.
2. Día 2
   1. Añadir BrdU a una concentración final de 10 μM en el medio de cultivo apropiado, e incubar durante 16 h (un ciclo celular).
      NOTA: La solución de BrdU se prepara en dimetilsulfóxido; la solución madre utilizada es de 10 mM y se almacena en alícuotas a -20 °C.
3. Día 3
   1. Irradie las placas con una dosis total de 5 Gy de irradiación de rayos X (varíe la dosis de irradiación según el tipo de irradiador, por ejemplo, irradiadores de animales pequeños frente a irradiadores de sobremesa). Consulte la Tabla de materiales para la marca y el modelo de irradiador utilizado.
   2. Devuelva las placas a la incubadora y suelte las células durante 3 h.
   3. Durante el período de incubación de 3 h, prepare los dos tampones, A y B, y el paraformaldehído al 4% (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
      NOTA: Los tampones A y B y la sacarosa deben prepararse frescos el día de la fijación, utilizando solución de sacarosa fresca para evitar la contaminación.
      1. Preparar el buffer A (Pre-Extraction Buffer), según el orden (30 mL) descrito en la Tabla 1.
         NOTA: La sacarosa 1M debe prepararse el día de su uso para evitar la contaminación.
      2. Preparar el tampón B (Cytoskeleton Stripping Buffer) según el orden descrito en la Tabla 1 (30 mL).
         NOTA: El tampón B debe prepararse en el orden citado para evitar la precipitación de Tween-20 y la solución de desoxicolato de sodio.
      3. Preparar 4% de PFA, 2 mL por condición (10 mL), bajo una capucha química (Tabla 1).

2. Pre-extracción y fijación

NOTA: Todas las preextracción y fijación se realizan con las hojas de cubierta que quedan en la placa de cultivo de tejidos sobre hielo o a 4 °C; el cubrecoges solo se levanta en el último paso del montaje (ver discusión).

1. Pre-extracción
   1. Aspire el medio, lave cuidadosamente las células dos veces con 1x PBS y retire el PBS. Añadir 2 ml de tampón A previo a la extracción e incubar inmediatamente a 4 °C durante 10 min.
      NOTA: Es importante que el tiempo de incubación en el búfer A no se extienda. La incubación prolongada en los tampones previos a la extracción dará como resultado un mayor número de células separadas de la cubierta. Alternativamente, en lugar de incubación a 4 ° C, la incubación se puede hacer en hielo.
   2. Elimine el búfer A a través de la aspiración.
      NOTA: No lave las fundas después de quitar el búfer A. Continúe con el siguiente paso.
   3. Añadir 2 ml de Cytoskeleton Stripping Buffer B e incubar inmediatamente a 4 °C durante 10 min. Aspire cuidadosamente el tampón B y lave cuidadosamente las células una vez con 1x PBS. Aspire con cuidado el 1x PBS.
2. Fijación
   1. Fije las células agregando 2 ml de PFA al 4% debajo de la capucha química.
      NOTA: El PFA es tóxico y debe manipularse bajo una capucha química.
   2. Incubar las células a temperatura ambiente durante 20 min. Lave las fundas dos veces con 1x PBS y aspire el exceso.
   3. Cubra los coverslips con metanol 100% frío e incube los coverslips a -20 °C durante 5 min. Lavar dos veces con 1x PBS.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las fundas se pueden almacenar a 4 °C en 1x PBS y la placa envuelta en papel de aluminio si es necesario. Las células no deben mantenerse más de 5 días antes de continuar con el protocolo IF.

3. Permeabilización

1. Incubar las células con 2 mL de 1x PBS que contenga 0.5% Triton X-100 a temperatura ambiente durante 15 min. Lave los cubrehojas tres veces con 2 ml de 1x PBS.

4. Inmunotinción

1. Paso de bloqueo
   1. Prepare suficiente tampón de bloqueo nuevo (3% BSA en 1x PBS) para usar 2 ml por funda.
      NOTA: Prepare un tampón de bloqueo adicional de 5 ml para hacer las soluciones de anticuerpos.
   2. Agregue 2 ml de tampón de bloqueo a cada pozo e incube a temperatura ambiente durante 1 h.
2. Incubación primaria de anticuerpos
   1. Preparar la solución primaria de anticuerpos en tampón de bloqueo fresco: BrdU RPN202 1:1000 y antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) 1:500, 100 μL por funda.
      NOTA: Para preservar el anticuerpo, se puede utilizar un volumen más pequeño, 75-100 μL para un coverlip de 22 x 22 mm, 50-75 μL para un coverlip de 18 x 18 mm.
   2. En cada funda, agregue 100 μL de solución primaria de anticuerpos. Cubra los cubrecolchas con un cuadrado de parafilm usando pinzas, y coloque cuidadosamente el parafilm para no crear burbujas.
   3. Cubra la placa con papel de aluminio e incube el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada.
   4. Retire los cuadrados de la parapelícula y lave las fundas tres veces con 2 ml de 1x PBS estéril.
3. Incubación secundaria de anticuerpos
   1. Preparar suficiente solución de anticuerpos secundarios en un tampón de bloqueo fresco: dilución anti-ratón 488 fluorescente secundaria A11011 (para BrdU) 1:800 y anti-conejo 568 fluorescente secundaria A11011 (para PCNA) dilución 1:800.
      NOTA: Los colores utilizados se pueden cambiar para adaptarse a las necesidades experimentales. La marca específica utilizada se puede encontrar en la Tabla de Materiales.
   2. Agregue en cada funda 100 μL de solución de anticuerpos secundarios, cubra las fundas con un cuadrado de parapelícula usando pinzas y coloque cuidadosamente la parapelícula sin burbujas.
   3. Incubar el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 h con la placa cubierta de papel de aluminio.
   4. Lave los cubrehojas tres veces con 2 ml de 1x PBS.
4. Tinción nuclear
   1. Preparar un volumen de 2 ml por cápsula de 1x PBS que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a una concentración final de 1 μg/mL (1:1000).
   2. Agregue en cada cubierta 2 ml de la solución DAPI. Incubar los coverslips a temperatura ambiente durante 10 min con la placa cubierta de papel de aluminio. Lave las fundas dos veces con 1x PBS.
   3. Cubra los cubrehojas con 1x PBS y use una aguja o pinzas finas para levantar el coverslip desde el fondo del pozo. Seque con cuidado el exceso de líquido golpeando suavemente un borde sobre una toalla de papel.
      NOTA: Tenga cuidado de no dejar caer la diapositiva o permitir que la superficie plana con las celdas adherentes toque el papel.
   4. Monte las cubiertas en diapositivas utilizando 10-20 μL de medios de montaje específicos de IF.

5. Adquisición y análisis de imágenes

NOTA: La adquisición de imágenes se puede realizar en varios tipos de microscopios fluorescentes. Se utilizó un microscopio de epifluorescencia con un objetivo de aceite 63x; ver la Tabla de Materiales para la marca y el modelo. No se requieren pilas Z, aunque pueden ser útiles dependiendo de la línea celular y el nivel de tinción mitocondrial.

1. Análisis de imágenes
   1. Para cada imagen, cree varios archivos tiff; fusionar todos los planos, pero mantener los canales de color separados. Importe estos archivos en Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) y analícelos utilizando la canalización Speckle Counting (Vídeo complementario 1).
   2. Cargue las imágenes (Figura suplementaria S1A).
      1. Para comenzar a crear el proyecto, cargue la canalización de conteo de manchas en el programa y las imágenes que se analizarán en el área proporcionada.
      2. Utilice el módulo NamesAndTypes para asignar un nombre significativo a cada imagen mediante el cual otros módulos se referirán a it-C01: Representando el canal BrdU; C02: Representación del canal PCNA; C03: Representación del canal DAPI.
         NOTA: Estos identificadores dependerán del microscopio; debe haber un identificador en el nombre del archivo para distinguir entre los canales.
   3. Identifique qué archivo se utilizará para identificar los núcleos y asígnele un nombre (cambie este nombre según sea necesario) (consulte la Figura suplementaria S1B y la Figura suplementaria S1C).
      1. Seleccione el diámetro del objeto entre 50 y 300 unidades de píxeles, que es el rango de tamaño aceptable para los núcleos, pero cambie el valor para que se ajuste a los núcleos de la imagen.
         NOTA: Puede ser que 50 sea un valor demasiado grande y evite que se identifiquen núcleos más pequeños; del mismo modo, 300 puede permitir que grandes agrupaciones de núcleos se cuenten como 1.
      2. Descarte los objetos fuera del rango de diámetro para asegurarse de que solo se contarán los que coincidan con los criterios.
      3. Deseche los objetos que tocan los bordes para eliminar las celdas que solo pueden estar parcialmente en el campo.
      4. Aplique el umbral para que se ajuste a las imágenes específicas. Tenga en cuenta la siguiente configuración como ejemplo. Cambiar el factor de corrección de umbrales en función de la complejidad de la estrategia de umbrales. Otras configuraciones incluyen la estrategia de umbral: Global; método de umbral: Otsu; umbrales de dos o tres clases: dos clases; escala de suavizado de umbral: 1; factor de suavizado del umbral: 1; límites inferior y superior en el umbral: 0,0 y 1,0; método para distinguir objetos agrupados: Forma; y método para dibujar líneas divisorias entre objetos agrupados: Propagate.
         NOTA: Para cada parámetro, el generador de perfiles de celda proporciona definiciones complementarias y posibilidades disponibles para la configuración de variables.
   4. Identificar el objeto primario para identificar los focos (Figura suplementaria S2A).
      1. Utilice la siguiente configuración: seleccione la imagen de entrada: Maskedgreen; nombró el objeto principal a identificar: BrdUFoci; diámetro típico del objeto: 1-15; descartar el objeto fuera del rango de diámetro: Sí; descartar el objeto que toca el borde de la imagen: No; estrategia de umbral: Adaptativa; método de umbral: Otsu; dos clases o tres umbrales de clase: Tres clases; escala de suavizado de umbral: 1; factor de suavizado del umbral: 3; y tamaño del filtro suavizante: 4.
   5. Medir la intensidad (Figura suplementaria S2B).
      1. Seleccione la imagen a medir: OrigGreen.
      2. Haga clic en Agregar otra imagen. Seleccione la imagen a medir: PCNA. Seleccionar objetos a medir: Núcleos.
         NOTA: Esto se utilizará para medir la intensidad de BrdU y PCNA, los datos finales que se graficarán.

Resultados

En este protocolo, se utilizó el ensayo basado en bromodeoxiuridina (BrdU) para medir cuantitativamente la respuesta de resección de las células HeLa al daño inducido por la irradiación. Las pistas de ssDNA generadas se visualizan como focos distintos después de la tinción por inmunofluorescencia (Figura 1A). Los focos identificados se cuantificaron y expresaron como la intensidad total integrada de la tinción de BrdU en los núcleos (Figura 1B, ...

Discusión

Este artículo describe un método que hace uso de la tinción IF para medir las variaciones en la resección del ADN en el celulo. El estándar actual para observar un efecto sobre la resección del ADN es a través de la tinción RPA; sin embargo, este es un método indirecto que puede estar influenciado por la replicación del ADN. Anteriormente, se ha descrito otra técnica de RESECCIÓN DE ADN basada en la incorporación de BrdU para clasificar las intensidades resultantes en células BrdU positivas y BrdU ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 568 goat anti-rabbit	Molecular probes	A11011	1:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Molecular probes	A11001	1:800
Anti PARP1 (F1-23)	Homemade		1:2500
Anti PCNA (SY12-07)	Novus	NBP2-67390	1:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A)	Abcam	Ab7291	1:100000
anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1:1000
Benchtop X-ray Irradiator	Cell Rad
BMN673	MedChem Express	HY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU)	Sigma	B5002
BSA	Sigma	A7906
Cell profiler	Broad Institute	V 3.19	https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft	Fisher scientific	13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen Life Technology	D1306
DMEM high glucose	Fisher scientific	10063542
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fetal Bovine serum	Gibco	12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22	Fisher scientific	12 541B
Fluorescent microscope	Leica	DMI6000B	63x immersion objective
HeLa	ATCC	CCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V	VWR	51030408	37% CO2
MgCl2	BioShop Canada	MAG520.500
NaCl	BioShop Canada	SOD002.10
Needle
PBS 1x	Wisent Bio Products	311-010-CS
PFA 16%	Cedarlane Labs	15710-S(EM)
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757-100G
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen Life Technology	P-36930
RNAiMAX	Invitrogen	13778-075
siPARPi	Dharmacon		AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA control	Dharmacon		UUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium Deoxycholcate	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sucrose	BioShop Canada	SUC507.5
Tris-base	BioShop Canada	TRS001.5
Trition X-100	Millipore Sigma	T8787-250ML
Tween20	Fisher scientific	BP337500
Tweezers