Utilización de electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de la neurona del gránulo cerebeloso y el desarrollo de la sinapsis

Resumen

Aquí describimos un método para visualizar la sinaptogénesis de las neuronas granulares en el cerebelo del ratón durante el curso del desarrollo cerebral postnatal cuando estas células refinan sus estructuras sinápticas y forman sinapsis para integrarse en el circuito cerebral general.

Resumen

Las neuronas experimentan cambios dinámicos en su estructura y función durante el desarrollo del cerebro para formar conexiones apropiadas con otras células. El cerebelo de roedores es un sistema ideal para rastrear el desarrollo y la morfogénesis de un solo tipo de célula, la neurona granulosa cerebelosa (CGN), a través del tiempo. Aquí, la electroporación in vivo de progenitores de neuronas granulares en el cerebelo de ratón en desarrollo se empleó para etiquetar escasamente las células para análisis morfológicos posteriores. La eficacia de esta técnica se demuestra en su capacidad para mostrar las etapas clave del desarrollo de la maduración de CGN, con un enfoque específico en la formación de garras dendríticas, que son estructuras especializadas donde estas células reciben la mayoría de sus entradas sinápticas. Además de proporcionar instantáneas de las estructuras sinápticas de CGN a lo largo del desarrollo cerebeloso, esta técnica se puede adaptar para manipular genéticamente las neuronas granulares de manera autónoma celular para estudiar el papel de cualquier gen de interés y su efecto en la morfología de CGN, el desarrollo de garras y la sinaptogénesis.

Introducción

El desarrollo del cerebro es un proceso prolongado que se extiende desde la embriogénesis hasta la vida postnatal. Durante este tiempo, el cerebro integra una combinación de estímulos intrínsecos y extrínsecos que esculpen el cableado de las sinapsis entre las dendritas y los axones para guiar finalmente el comportamiento. El cerebelo de roedores es un sistema modelo ideal para estudiar cómo se desarrollan las sinapsis porque el desarrollo de un solo tipo de neurona, la neurona granular cerebelosa (CGN), se puede rastrear a medida que pasa de una célula progenitora a una neurona madura. Esto se debe, en parte, al hecho de que la mayoría de la corteza cerebelosa se des....

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Duke (IACUC).

1. Preparación del ADN para electroporación in vivo o IVE (1 día antes de la cirugía)

1. Reúna los siguientes materiales: ADN purificado (0.5-25 μg por animal), acetato de sodio 3 M, etanol, colorante verde rápido, agua destilada ultrapura, solución tampón de fosfato (PBS) (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Para el ADN, se obtuvo de Addgene (FUGW, https://www.addgene.org/14883/) una construcción que expresa la proteína fluorescente verde (GFP) bajo....

Resultados

Figura 4: Análisis de la morfología de las neuronas granulares durante el desarrollo cerebeloso. (A) Imágenes de proyección máxima de CGN electroporadas de 3-DPI a 14-DPI (edad postnatal P10 a P21), núcleos (azul) y GFP (verde); Las puntas de flecha indican dendritas individuales, y la barra de escala es de 10 μm. (B) Número promedio de dendritas. (.......

Discusión

Las neuronas granulares cerebelosas son las neuronas más abundantes en el cerebro de los mamíferos, constituyendo casi el 60-70% de la población total de neuronas en el cerebro de roedores ^1,14. El cerebelo ha sido ampliamente utilizado para dilucidar los mecanismos de proliferación celular, migración, formación de dendritas y desarrollo de sinapsis 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Betadine	Purdue Production	67618-150-17
Cemented 10 µL needle	Hamilton	1701SN (80008)	33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style
Chicken anti-GFP	Millipore Sigma	AB16901	Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration
Cotton-tip applicator
Donkey anti-chicken Cy2	Jackson ImmunoResearch	703-225-155	Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration
Ethanol (200 proof)	Koptec	V1016
Electroporator ECM 830	BTX Harvard Apparatus	45-0052
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G
FUGW plasmid	Addgene	14883
Glass slides	VWR	48311-703	Superfrost plus
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Heating pad	Softheat
Hoescht 33342 fluorescent dye	Invitrogen	62249
Imaris	Bitplane
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Micro cover glass	VWR	48382-138
Nail polish	Sally Hansen	Color 109
Normal goat serum	Gibco	16210064
O.C.T. embedding compound	Tissue-Tek	4583
Olympus MVX10 Dissecting Scope	Olympus	MVX10
P200 pipette reach tip	Fisherbrand	02-707-138	Used for needle spacer
Parafilm	Bemis	PM-996
PBS pH 7.4 (10x)	Gibco	70011-044
Simple Neurite Tracer	FIJI		https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions
Sucrose	Sigma	S0389
Surgical tools	RWD Life Science		Small scissors and tweezers
Triton X-100	Roche	11332481001	non-ionic detergent
Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0489	5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Vectashield mounting media	Vectashield	H1000
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Zeiss 780 Upright Confocal	Zeiss	780