Utilización de electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de la neurona del gránulo cerebeloso y el desarrollo de la sinapsis

Resumen

Aquí describimos un método para visualizar la sinaptogénesis de las neuronas granulares en el cerebelo del ratón durante el curso del desarrollo cerebral postnatal cuando estas células refinan sus estructuras sinápticas y forman sinapsis para integrarse en el circuito cerebral general.

Resumen

Las neuronas experimentan cambios dinámicos en su estructura y función durante el desarrollo del cerebro para formar conexiones apropiadas con otras células. El cerebelo de roedores es un sistema ideal para rastrear el desarrollo y la morfogénesis de un solo tipo de célula, la neurona granulosa cerebelosa (CGN), a través del tiempo. Aquí, la electroporación in vivo de progenitores de neuronas granulares en el cerebelo de ratón en desarrollo se empleó para etiquetar escasamente las células para análisis morfológicos posteriores. La eficacia de esta técnica se demuestra en su capacidad para mostrar las etapas clave del desarrollo de la maduración de CGN, con un enfoque específico en la formación de garras dendríticas, que son estructuras especializadas donde estas células reciben la mayoría de sus entradas sinápticas. Además de proporcionar instantáneas de las estructuras sinápticas de CGN a lo largo del desarrollo cerebeloso, esta técnica se puede adaptar para manipular genéticamente las neuronas granulares de manera autónoma celular para estudiar el papel de cualquier gen de interés y su efecto en la morfología de CGN, el desarrollo de garras y la sinaptogénesis.

Introducción

El desarrollo del cerebro es un proceso prolongado que se extiende desde la embriogénesis hasta la vida postnatal. Durante este tiempo, el cerebro integra una combinación de estímulos intrínsecos y extrínsecos que esculpen el cableado de las sinapsis entre las dendritas y los axones para guiar finalmente el comportamiento. El cerebelo de roedores es un sistema modelo ideal para estudiar cómo se desarrollan las sinapsis porque el desarrollo de un solo tipo de neurona, la neurona granular cerebelosa (CGN), se puede rastrear a medida que pasa de una célula progenitora a una neurona madura. Esto se debe, en parte, al hecho de que la mayoría de la corteza cerebelosa se desarrolla postnatalmente, lo que permite una fácil manipulación genética y etiquetado celular después del nacimiento¹.

En los mamíferos, la diferenciación de CGN comienza al final del desarrollo embrionario cuando un subconjunto de células proliferativas en el cerebro posterior migra sobre el labio rómbico para formar una zona germinal secundaria en la superficie del cerebelo ^2,3,4. Aunque están totalmente comprometidas con una identidad progenitora de neuronas granulares (GNP), estas células continúan proliferando dentro de la porción externa de la capa granular externa (EGL) hasta el día postnatal 14 (P14). La proliferación de esta capa resulta en una expansión masiva del cerebelo ya que estas células dan lugar exclusivamente a CGNs⁵. Una vez que las CGN recién nacidas salen del ciclo celular en el EGL, migran hacia el interior hacia la capa granular interna (IGL), dejando atrás un axón que se bifurcará y viajará en la capa molecular del cerebelo, formando fibras paralelas que hacen sinapsis en las células de Purkinje⁶. La posición de estas fibras dentro de la capa molecular depende del momento de la salida del ciclo celular.

Las CGN que se diferencian primero dejan sus fibras paralelas hacia la parte inferior de la capa molecular, mientras que los axones de CGN que se diferencian más tarde se agrupan en la parte superior ^7,8. Una vez que los cuerpos celulares CGN alcanzan el IGL, comienzan a elaborar dendritas y forman sinapsis con neuronas inhibitorias y excitatorias cercanas. El árbol dendrítico maduro de un CGN exhibe una arquitectura estereotipada con cuatro procesos principales. En el transcurso de la maduración de CGN, las estructuras al final de estas dendritas forman una garra que se enriquece con proteínas postsinápticas ^9,10. Estas estructuras especializadas, llamadas garras dendríticas, contienen la mayoría de las sinapsis en las neuronas granulares y son importantes para recibir tanto entradas excitatorias de inervaciones de fibras musgosas que se originan en la protuberancia, como entradas inhibitorias de células locales de Golgi. Una vez configuradas completamente, las conexiones sinápticas de las CGN permiten que estas células transmitan entradas desde los núcleos precerebelosos a las células de Purkinje, que se proyectan desde la corteza cerebelosa hacia los núcleos cerebelosos profundos.

La electroporación postnatal in vivo de los PNB es ventajosa sobre otros métodos basados en el etiquetado, como la infección viral y la generación de líneas de ratón transgénico, porque la expresión de las construcciones deseadas se puede lograr en una línea de tiempo rápida, y el método se dirige a una pequeña población de células, útil para estudiar los efectos autónomos celulares. Este método se ha utilizado en estudios previos para estudiar el desarrollo morfológico de las CGN; Sin embargo, estos estudios se han centrado en un solo punto de tiempo o en una ventana corta de tiempo 9,10,11,12,13. Este método de etiquetado se combinó con el análisis de imágenes para documentar los cambios en la morfología de CGN que ocurren a lo largo de todo el curso de tiempo de la diferenciación de CGN durante las primeras tres semanas de vida postnatal. Estos datos revelan la dinámica del desarrollo de las dendritas CGN que subyacen a la construcción de los circuitos cerebelosos.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Duke (IACUC).

1. Preparación del ADN para electroporación in vivo o IVE (1 día antes de la cirugía)

1. Reúna los siguientes materiales: ADN purificado (0.5-25 μg por animal), acetato de sodio 3 M, etanol, colorante verde rápido, agua destilada ultrapura, solución tampón de fosfato (PBS) (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Para el ADN, se obtuvo de Addgene (FUGW, https://www.addgene.org/14883/) una construcción que expresa la proteína fluorescente verde (GFP) bajo un promotor de ubiquitina humana. Cualquier construcción que exprese GFP u otra proteína fluorescente bajo el control de un promotor ubicuo debería funcionar. El etiquetado específico de CGN con esta técnica no depende del constructo, sino de la electroporación.
2. Prepare el ADN para la electroporación mezclando la cantidad deseada de ADN, 10% en volumen de acetato de sodio 3 M y 250% en volumen de etanol 100% helado. Tenga en cuenta que el ADN precipitará fuera de la solución inmediatamente.
3. Continuar precipitando la mezcla de ADN durante la noche a -20 °C o durante una hora a -80 °C.
4. El pellet precipitó ADN en una centrífuga de mesa a >16,000 × g y lavó dos veces con etanol al 70%.
5. Deje que el pellet de ADN se seque completamente y reconstituya en una solución 1x PBS + 0.02% Fast Green.

Figura 1: Limitación de la profundidad de inyección a 1,5 mm utilizando un espaciador. (A) Un segmento de 11,2 mm se corta de una pipeta de carga con una cuchilla de afeitar. (B) El espaciador se coloca en la punta de la jeringa Hamilton (la longitud total es de 1,27 cm o 0,5 pulgadas) y se asegura con adhesivo o parapelícula. La punta expuesta debe tener 1,5 mm de longitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Electroporación in vivo de progenitores de neuronas granulares en ratones postnatales de siete días de edad

NOTA: Todas las cirugías de electroporación se realizaron en una sala quirúrgica estéril y altamente ventilada, y todo el personal usó equipo de protección personal completo que incluía guantes, mascarilla, gorro para el cabello, bata y cubiertas para zapatos. Alternativamente, las cirugías se pueden realizar en una campana ventilada y estéril.

1. Reúna los siguientes materiales: ADN para electroporación, tijeras quirúrgicas pequeñas, pinzas quirúrgicas pequeñas, jeringa Hamilton personalizada, aplicador de punta de algodón, almohadilla térmica, betadina, etanol al 70%, 1x PBS, parapelícula, adhesivo tisular (cianoacrilato de n-butil-éster), isoflurano, electroporador y electrodos tipo pinza (consulte la Tabla de materiales).
2. Corte un espaciador de una punta de carga esterilizada para que quepa sobre la jeringa Hamilton y limite la profundidad de inyección a 1,5 mm (Figura 1A, B). Asegure el espaciador con adhesivo o parafilm.
3. Anestesiar al cachorro P7 en una cámara de isoflurano a una velocidad de entrega de 0,8 L/min. Confirme la anestesia completa monitoreando al animal para detectar disminución de la respiración y falta de respuesta de pellizco del dedo del pie o la cola (Figura 2A).
4. Una vez que el animal esté completamente anestesiado, coloque a los cachorros en un pedestal equipado con un cono nasal, administrando isoflurano constante al 4% a una velocidad de entrega de 0.8 L / min. Limpie la parte superior de la cabeza del cachorro 3 veces con un hisopo estéril de betadina y luego etanol al 70%, alternando entre los dos, para preparar el sitio. Deje que la solución se seque antes de continuar.
5. Usando un par de tijeras esterilizadas, haga una pequeña incisión con un corte que abarque la distancia desde la parte superior hasta la base de las orejas para revelar el cerebro posterior (Figura 2B).
6. Localice el cerebelo (Figura 2C), inserte la punta expuesta de la jeringa de Hamilton a través del cráneo, perpendicular al cerebro, e inyecte 1,5 μL de mezcla de ADN en el parénquima cerebeloso empujando lentamente el émbolo posterior de la jeringa. Después de la administración de la mezcla de ADN, tire lentamente de la aguja hacia atrás para evitar derrames de espalda y permita que la solución de ADN se difunda durante 30 s.
7. Apague el isoflurano y coloque el cachorro en una almohadilla térmica a 37 °C. Prepare el electrodo tipo pinza para la electroporación sumergiendo ambos extremos en PBS estéril 1x.
   NOTA: Mojar el electrodo tipo pinza evitará quemaduras de contacto en la piel del cachorro durante la administración de los pulsos eléctricos.
8. Oriente la pinza-electrodo por encima del sitio de inyección con el extremo más hacia abajo y el extremo negativo por encima de la cabeza del animal (Figura 2D). Administre cinco pulsos eléctricos desde el electroporador con los siguientes ajustes: intervalo entre pulsos de 50 ms, 130 V y 950 ms.
   NOTA: Si es necesario, realice una inyección de prueba para asegurarse de que el sitio de inyección esté ubicado en el vermis cerebeloso (Figura 2E).
9. Pellizque la incisión cerrada y selle la herida con un adhesivo tisular de cianoacrilato n-butil-éster no tóxico. Limpie la herida con etanol al 70%, ya que cualquier rastro de sangre aumenta la probabilidad de infanticidio y canibalismo parental.
10. Deje que el animal se recupere en una almohadilla térmica de 37 ° C antes de devolver el cachorro a la madre. Controle a los cachorros cada 30 minutos durante al menos 2 h después de la cirugía para garantizar una recuperación completa.
    NOTA: El infanticidio por cualquiera de los padres es bastante común. Para evitar el canibalismo, aloje al padre en una jaula diferente antes de comenzar la electroporación, y siempre devuelva a los cachorros limpios y recuperados (es decir, sin manchas de sangre, completamente móviles) a la jaula original en la cama original. Los cachorros también se pueden limpiar con excrementos de la jaula original para minimizar el olor a sangre. El uso de una madre sustituta puede ser necesario si la madre original continúa canibalizando a sus cachorros.

Figura 2: Electroporación cerebelosa in vivo de progenitores de neuronas granulares en crías de ratón de tipo salvaje P7. (A) Los cachorros son anestesiados con isoflurano al 4% administrado a una velocidad de 0.8L / min para asegurar la anestesia durante toda la inyección de la solución de ADN. El isoflurano se administra a una velocidad de 0,8 L/min. (B) Después de esterilizar al ratón 3 veces con betadina y etanol al 70%, se realiza una incisión que abarca la distancia de las orejas, revelando el cerebro posterior. (C) Una imagen ampliada de una demarcación blanca en el cráneo, un punto de referencia para el sitio de inyección. La construcción de ADN debe inyectarse dentro de 1 mm por encima de la marca; Las líneas punteadas delinean la demarcación, y la flecha negra denota el sitio de inyección. Las crestas del vermis cerebeloso pueden ser visibles y pueden ser útiles para encontrar el sitio de inyección. (D) Orientación del electrodo tipo pinza para una electroporación eficiente. El extremo más (+) debe estar orientado hacia abajo para atraer ADN cargado negativamente hacia el parénquima cerebeloso antes de la administración de pulsos eléctricos. (E) La inyección de prueba de 1 μL de un colorante verde rápido al 0,02% muestra que la inyección se localiza en el centro del vermis cerebeloso entre los lobulillos 5-7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Inmunohistoquímica de CGNs electroporados

1. Reúna los siguientes materiales: isoflurano, 1x PBS, 4% de paraformaldehído (PFA), 30% de sacarosa, suero normal de cabra, detergente no iónico, portaobjetos de vidrio, cubreobjetos de vidrio, esmalte de uñas, medios de montaje, tinte nuclear Hoechst y anticuerpos primarios y secundarios apropiados (consulte la Tabla de materiales).
2. Anestesiar al animal experimental con isoflurano y confirmar la anestesia completa con un pellizco para el dedo del pie y la cola.
3. Realizar una perfusión transcárdica inyectando lentamente 1x PBS y 4% PFA en el ventrículo izquierdo del corazón del animal. Deje que la sangre drene del animal cortando la vena cava.
4. Arregle el cerebro durante la noche sumergiéndolo en PFA al 4% a 4 °C. Al día siguiente, enjuague rápidamente el cerebro con 1x PBS y transfiera el cerebro a sacarosa al 30% en 1x PBS para crioprotección durante al menos 24 h.
5. Si es necesario, corte el cerebro por la mitad a lo largo del eje rostral-caudal y confirme la expresión de la construcción del reportero transfectado utilizando un microscopio de disección fluorescente vertical.
   NOTA: Mantenga el cerebro sumergido en 1x PBS en un plato pequeño para evitar que se seque.
6. Monte el cerebro en un micrótomo de congelación, corte secciones sagitales de 25 μm y permita que las secciones se desarrollen en una mezcla 1: 1 de PBS y glicerol.
   NOTA: Las secciones se pueden almacenar en esta solución crioprotectora a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.
7. Lave las secciones tres veces en 1x PBS durante 10 minutos cada una para eliminar el crioprotector, y bloquee el tejido en 1x PBS + 10% de suero de cabra normal + 0,2% de detergente no iónico en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 1 h.
8. Preparar solución primaria de anticuerpos: 1x PBS, suero de cabra normal al 10%, detergente no iónico al 0,2% y anticuerpo anti-GFP, y centrifugar la solución durante 5 min a >16.000 × g. Incubar secciones en la solución de anticuerpos a 4 °C en un agitador orbital durante 48 h.
9. Lave la solución de anticuerpos primarios durante 15 minutos cinco veces con 1x PBS + 0,2% de detergente no iónico.
10. Preparar solución de anticuerpos secundarios: 1x PBS, suero de cabra normal al 10%, detergente no iónico al 0,2% y un anticuerpo secundario apropiado para detectar GFP; Centrifugar la solución a >16.000 × g. Incubar secciones en la solución de anticuerpos en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 2-3 h. Proteja las secciones de la exposición a la luz para evitar el blanqueamiento.
11. Lave la solución de anticuerpos secundarios tres veces con 1x PBS + 0.2% de detergente no iónico durante 15 minutos cada vez. Incubar secciones en 1x PBS + Hoechst durante 5 min para teñir núcleos.
12. Lave la solución Hoechst con 1x PBS + 0,2% de detergente no iónico y móntela en portaobjetos de vidrio. Cubra las secciones con medios de montaje, cubra los portaobjetos y selle el portaobjetos con esmalte de uñas para evitar la evaporación.

4. Análisis morfológicos de CGNs - reconstrucción tridimensional (3D) y área superficial y volumen celular

1. Imagen de CGN electroporadas individuales en un microscopio confocal a un objetivo de 63x con un zoom de 2x, tomando imágenes de pila z a 0,5 μm por pila. Imagen de una celda por ventana de imagen para permitir un fácil análisis y reconstrucción de la imagen.
2. Instale el plug-in Simple Neurite Tracer para FIJI utilizando el siguiente enlace (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions) para rastrear fácil y eficientemente la estructura de CGN electroporados en el espacio tridimensional (3D).
   NOTA: Hay una versión actualizada del plug-in (https://imagej.net/SNT).
3. Analice la longitud de la neurita y la formación de garras dendríticas de manera ciega utilizando Simple Neurite Tracer. Cargue imágenes z-stack de un solo canal de CGN electroporadas en FIJI y haga clic en Plugins | Segmentación | Trazador simple de neuritas (Figura 3D).
4. Acceda al menú desplegable y seleccione Crear nuevo visor 3D (Figura 3D).
5. Desplácese hasta la base de una dendrita, donde se conecta al soma celular y comience un camino haciendo clic en la unión. Trace manualmente la ruta haciendo clic en las secciones donde la señal de relleno de celda es más brillante, presionando [y] para mantener la traza. Traza hasta el final de la dendrita si no contiene una garra o hasta la base de la garra y confirma la trayectoria presionando [f] (Figura 4D).
6. A continuación, trace la garra comenzando un camino en la base de la estructura y rastreando hasta el final de la neurita más larga. Rastree las ramas secundarias y terciarias manteniendo pulsada la tecla [ctrl] en Windows o [alt] en un Mac OS y haciendo clic en la ruta. Confirme la ruta pulsando [f].
7. Observe que las mediciones de las trazas son visibles en una ventana separada; Sume todas las medidas de las ramas de la garra (primaria, secundaria, terciaria) para obtener la longitud total de cada garra.
8. Para analizar el área superficial y el volumen celular de CGN electroporadas, descargue el software de análisis celular Imaris (https://imaris.oxinst.com/).
   NOTA: FIJI también se puede utilizar para reconstruir celdas en 3D a partir de imágenes z-stack utilizando plug-ins gratuitos y fácilmente disponibles. Además, hay una función de representación volumétrica en Simple Neurite Tracer, pero Imaris se utilizó por las razones que se describen a continuación.
9. Sube una imagen z-stack de un CGN electroporado en Imaris. Acceda al kit de herramientas de reconstrucción 3D presionando Surpass.
10. Para reconstruir el CGN, pulse Superficies y seleccione una región de interés que abarque la totalidad de la celda dentro de la ventana de imagen. Una vez que haya terminado, presione la flecha azul hacia adelante en la esquina inferior derecha debajo de Crear.
11. Si la imagen contiene varios canales para diferentes señales, seleccione el canal que contiene el CGN electroporado y pulse la flecha azul hacia adelante.
12. Usando la barra deslizante, establezca un umbral deseado que se ajuste con mayor precisión a la señal de la celda electroporada. Acérquese más a la superficie de la celda para determinar con precisión el umbral. Una vez terminado, pulse la doble flecha verde para reconstruir la celda y obtener el área de superficie y el tamaño del volumen a partir de los metadatos.

Figura 3: Análisis inmunohistoquímico y reconstrucción tridimensional de neuronas granulares electroporadas. Los ratones P7 CD-1 fueron electroporados con una construcción que expresa GFP. Los cerebros fueron recolectados y sometidos a inmunohistoquímica, microscopía confocal y reconstrucción 3D para análisis morfológico. (A) Línea de tiempo desde la electroporación hasta el procesamiento de imágenes de un ratón de 10 DPI. (B) Imagen de proyección máxima de una sección transversal sagital del cerebelo electroporado 10-DPI; Las líneas blancas delimitan las capas cerebelosas, y la barra de escala es de 25 μm. (C) Imagen de proyección máxima de una sola neurona granulosa electroporada 10-DPI y la traza 3D correspondiente, barra de escala es de 10 μm. (D) Las reconstrucciones 3D se generaron utilizando el plugin FIJI Simple Neurite Tracer. Todas las mediciones se rastrearon a través de la pila z, siguiendo la señal de llenado de celdas. Las medidas del eje y la garra se trazaron por separado para cada dendrita; La línea punteada denota porción de dendrita dentro del plano actual. Abreviaturas: 3D = tridimensional; GFP = proteína verde fluorescente; DPI = días después de la inyección; PSD-95 = proteína de densidad postsináptica 95; PNB = progenitores de neuronas granulosas; PFA = paraformaldehído. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Figura 4: Análisis de la morfología de las neuronas granulares durante el desarrollo cerebeloso. (A) Imágenes de proyección máxima de CGN electroporadas de 3-DPI a 14-DPI (edad postnatal P10 a P21), núcleos (azul) y GFP (verde); Las puntas de flecha indican dendritas individuales, y la barra de escala es de 10 μm. (B) Número promedio de dendritas. (...

Discusión

Las neuronas granulares cerebelosas son las neuronas más abundantes en el cerebro de los mamíferos, constituyendo casi el 60-70% de la población total de neuronas en el cerebro de roedores ^1,14. El cerebelo ha sido ampliamente utilizado para dilucidar los mecanismos de proliferación celular, migración, formación de dendritas y desarrollo de sinapsis 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Betadine	Purdue Production	67618-150-17
Cemented 10 µL needle	Hamilton	1701SN (80008)	33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style
Chicken anti-GFP	Millipore Sigma	AB16901	Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration
Cotton-tip applicator
Donkey anti-chicken Cy2	Jackson ImmunoResearch	703-225-155	Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration
Ethanol (200 proof)	Koptec	V1016
Electroporator ECM 830	BTX Harvard Apparatus	45-0052
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G
FUGW plasmid	Addgene	14883
Glass slides	VWR	48311-703	Superfrost plus
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Heating pad	Softheat
Hoescht 33342 fluorescent dye	Invitrogen	62249
Imaris	Bitplane
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Micro cover glass	VWR	48382-138
Nail polish	Sally Hansen	Color 109
Normal goat serum	Gibco	16210064
O.C.T. embedding compound	Tissue-Tek	4583
Olympus MVX10 Dissecting Scope	Olympus	MVX10
P200 pipette reach tip	Fisherbrand	02-707-138	Used for needle spacer
Parafilm	Bemis	PM-996
PBS pH 7.4 (10x)	Gibco	70011-044
Simple Neurite Tracer	FIJI		https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions
Sucrose	Sigma	S0389
Surgical tools	RWD Life Science		Small scissors and tweezers
Triton X-100	Roche	11332481001	non-ionic detergent
Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0489	5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Vectashield mounting media	Vectashield	H1000
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Zeiss 780 Upright Confocal	Zeiss	780