Modelos Animales de Depresión - Modelo de Desesperación Crónica (MDL)

Resumen

El modelo de ratón de desesperación crónica (MDL) de la depresión consiste en sesiones repetitivas de natación forzada y otra fase de natación retrasada como lectura. Representa un modelo adecuado para la inducción de un estado depresivo crónico estable durante al menos 4 semanas, modificable para evaluar intervenciones de tratamiento subcrónicas y agudas.

Resumen

El trastorno depresivo mayor es una de las formas más prevalentes de enfermedades mentales y causa un tremendo sufrimiento individual y una carga socioeconómica. A pesar de su importancia, el tratamiento farmacológico actual es limitado y se necesitan urgentemente nuevas opciones de tratamiento. Un factor clave en la búsqueda de nuevos fármacos potenciales es la evaluación de su potencia antidepresiva en modelos animales apropiados. La clásica prueba de natación forzada porsolt se utilizó para este propósito durante décadas para inducir y evaluar un estado depresivo. Consiste en dos períodos cortos de natación forzada: el primero para inducir un estado depresivo y el segundo al día siguiente para evaluar el efecto antidepresivo del agente administrado entre las dos sesiones de natación. Este modelo podría ser adecuado como una herramienta de detección de posibles agentes antidepresivos, pero ignora el inicio tardío de la acción de muchos antidepresivos. El MDL se estableció recientemente y representó una modificación de la prueba clásica con diferencias notables. Los ratones se ven obligados a nadar durante 5 días consecutivos, siguiendo la idea de que en los seres humanos, la depresión es inducida por el estrés crónico en lugar de por el estrés agudo. En un período de descanso de varios días (1-3 semanas), los animales desarrollan una desesperación conductual sostenida. El método estándar de lectura es la medición del tiempo de inmovilidad en una sesión de natación retrasada adicional, pero se proponen varios métodos alternativos para obtener una visión más amplia del estado de ánimo del animal. Se pueden utilizar múltiples herramientas de análisis dirigidas a cambios de comportamiento, moleculares y electrofisiológicos. El fenotipo deprimido es estable durante al menos 4 semanas, proporcionando una ventana de tiempo para estrategias de tratamiento antidepresivo rápidas pero también subcrónicas. Además, las alteraciones en el desarrollo de un estado depresivo se pueden abordar utilizando este enfoque. El MDL, por lo tanto, representa una herramienta útil para comprender mejor la depresión y desarrollar nuevas intervenciones de tratamiento.

Introducción

Los trastornos afectivos, como el trastorno depresivo mayor, se encuentran entre las enfermedades mentales más frecuentes y desafiantes y se asocian con un alto sufrimiento ^individual1, un aumento del riesgo de ^suicidio2 y causan una carga socioeconómica ^{considerable3} para la sociedad. A pesar de su impacto, las opciones de tratamiento son limitadas, y existe una necesidad urgente para el desarrollo de nuevas intervenciones antidepresivas, especialmente debido a la crisis de innovación en psicofarmacología en las últimas décadas. Para comprender la fisiopatología de la depresión y probar nuevos agentes potenciales, se necesitan urgentemente modelos animales racionales y ^válidos4. Durante casi medio siglo, la clásica prueba de natación forzada (FST), originalmente descrita por ^Porsolt5, se utilizó como inducción y lectura para la detección de posibles nuevos antidepresivos. Consiste en un período de natación forzada durante 5-15 minutos el día 1, la posterior aplicación única de medicamentos y la evaluación de la porción que los ratones pasan inmóviles en el agua en otro período de natación al día siguiente. Se consideró que el tiempo de inmovilidad representaba un comportamiento de escape natural faltante y se pensó que se correlacionaba con el grado de un estado similar a la depresión en los ^ratones5.

El FST clásico ha sido muy criticado, no sólo en la comunidad ^{científica6,7,8} sino también en los medios ^públicos8. La mayoría de las controversias en torno al FST se deben a los cortos períodos de inducción y tratamiento de solo 1 día en el paradigma clásico. Se argumentó que FST representa más bien un modelo de trauma agudo que un estado comparable a la depresión humana. Además, la prueba de Porsolt podría ser adecuada como una herramienta de detección de posibles agentes antidepresivos, pero ignora el inicio tardío de la acción de muchos antidepresivos.

El modelo de desesperación crónica (MDL)9,10,11,12,13,14,15, que se deriva del FST original, representa un modelo animal más apropiado para la depresión. En CDM, el estrés repetido de la natación durante 5 días consecutivos evita los efectos traumáticos agudos. Al no poder escapar de una situación estresante repetida y continua, se cree que los ratones desarrollan un estado de impotencia, entrega y, en última instancia, desesperación. Este paradigma es más comparable a las teorías psicológicas actuales para el desarrollo de la depresión en humanos que un solo trauma agudo, que se experimenta comúnmente al inicio de un trastorno de estrés postraumático. El estado similar a la depresión resultante en cdm es estable hasta por 4 ^semanas9 y, por lo tanto, abre la posibilidad de períodos de tratamiento más largos, que son mejor comparables a las condiciones clínicas, donde los antidepresivos generalmente necesitan de 2 a 4 semanas para mostrar un ^beneficio16.

La evaluación del estado depresivo debe ser entonces multidimensional. La medición del tiempo de inmovilidad, como en el FST clásico, es útil, pero no debe usarse como el único parámetro de resultado. Varios métodos, que se describen a continuación, deberían ser capaces de mapear diferentes dimensiones de un estado depresivo en línea con los síntomas que generalmente se encuentran en humanos deprimidos. Las evaluaciones de lectura adecuadas podrían incluir el comportamiento de escape (tiempo de inmovilidad9,10,17), la prueba de suspensión de la cola (TST)⁹, la anhedonia (prueba clásica de preferencia de sacarosa [SPT]¹⁸), el comportamiento orientado a la motivación (prueba de preferencia de sacarosa de nariz-poke [NPSPT]¹⁰), la expectativa/comportamiento de exploración (respuesta a una señal ^ambigua19; Prueba de laberinto en ^Y9), electrofisiología (mediciones de plasticidad a largo plazo (potenciación a largo plazo, LTP; depresión a largo plazo, LTD)²⁰), evaluaciones moleculares (patrones de activación de genes tempranos inmediatos (IEG); patrones de estrés ^{adicionales21}).

Teóricamente, una prueba de natación repetida se puede utilizar para inducir un estado depresivo sin ninguna evaluación del tiempo de inmovilidad. Sin embargo, se recomienda encarecidamente proporcionar al menos una serie experimental de prueba de concepto con tiempos de inmovilidad. Además, CDM representa un modelo adecuado para evaluar el desarrollo de un estado depresivo mediante la medición del tiempo de inmovilidad durante la fase de inducción. Las cepas específicas de ratón o ratones tratados antes de nadar se pueden evaluar con respecto a la resiliencia o vulnerabilidad al estrés y la inducción de la desesperación conductual.

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Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices europeas (UE 2010/63) y de acuerdo con la ley alemana de protección animal (TierSchG), FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php), la guía del organismo nacional de bienestar animal GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y fueron aprobados por el comité de bienestar animal de la Universidad de Friburgo y por el Comite d'Ethique en Matiere d'Experimentation Animale de Strasbourg (CREMEAS, CEEA35), así como las autoridades locales. Ambos sexos de ratones de tipo salvaje C57Bl6N de 10 a 14 semanas (70-98 días postnatales, PND) se utilizaron para experimentos indicados de tipo salvaje (WT). Como línea resistente al estrés, se utilizó la línea de ratón transgénico con expresión mejorada de receptores de adenosina _A1 bajo el promotor neuronal CaMKII del cerebro ^anterior9,15. Después de los experimentos, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical.

1. Preparación

1. Obtenga una licencia de investigación con animales, incluida una planificación experimental exhaustiva.
2. Llegada: A su llegada, criar a los animales en el animalario para realizar el MDL. Si los animales se compran a un proveedor externo, permítales al menos 2 semanas para adaptarse al nuevo entorno.
3. Alojamiento: Para alojar a los animales, asegúrese de que las jaulas no estén ocupadas con el máximo número de animales para evitar estrés adicional. Garantizar que las condiciones de la vivienda estén en línea con las recomendaciones internacionales de alojamiento para ratones (para más información, ^ver22) y mantenerlas constantemente en todo momento.
   NOTA: Las condiciones estándar de vivienda más importantes incluyen jaulas ventiladas individualmente con 25-120 cambios de aire por hora, ciclo de luz-oscuridad de 12 h, temperatura lo más estable posible (al menos constante entre 20-24 ° C), humedad lo más estable posible (al menos entre 45% -65%), material roedor y refugio presente, sin vivienda individual.
4. Punto de tiempo: Realice todos los experimentos a la misma hora del día.
   NOTA: No se ha realizado una evaluación directa para verificar la influencia del día en el MDL, pero la mayoría de las pruebas de comportamiento que evalúan estados depresivos muestran variaciones dependiendo de la hora del día23,24,25, y es muy probable que el día también influya en el MDL.
5. Material de anidación: Reduzca el material de anidación al mínimo. Asegúrese de que no haya ruedas de rodadura, etc., presentes en la jaula.
   NOTA: El ambiente enriquecido evita la inducción de un estado depresivo.
6. Composición del grupo: Permita que los animales permanezcan en el mismo grupo durante todo el experimento. Agrupe a los ratones hembra incluso de diferentes camadas; agrupar a los ratones machos junto con los animales machos compañeros de camada. Debido a la agresividad venidera, especialmente de los machos, morder y barberear puede convertirse en un problema, por lo tanto, dar especial énfasis a la composición del grupo. Evite la vivienda individual, ya que la privación es un factor estresante adicional importante.
7. Animales: Utilizar diferentes cepas de ratón, aunque se han observado diferencias ^{específicas9,10}. Una cepa de ratón de uso frecuente es C57Bl6N. Etiquete ratones para realizar análisis estadísticos pareados (ver paso 3.2.4).
8. Sexo animal: Utilice por igual ratones machos y hembras.
9. Edad del animal: Asegúrese de que los animales tengan al menos 10 semanas (70 PND) de edad. No utilice animales más jóvenes debido al agotamiento causado por la natación.
10. Equipo: Utilice un cilindro/vaso de precipitados de vidrio transparente con una capacidad de al menos 2 L, un diámetro de 24-26 cm y una altura mínima de 30 cm. Otros requisitos incluyen un termómetro para verificar la temperatura del agua, toallas de papel, lámpara de calefacción de luz roja / alfombra de calefacción o fuente comparable de calefacción, temporizador, cronómetro, entorno tranquilo. Graba en vídeo las sesiones de natación para el análisis y la documentación fuera de línea. Asegúrese de que la fecha y la hora sean continuamente visibles en la cinta / archivo, junto con un número de código de identificación para el animal individual. Almacene los archivos para su posterior análisis y referencia adicional. Filme desde el lado del cilindro de vidrio, no desde arriba, para facilitar el análisis.

2. Fase de inducción

1. Antes de empezar
   1. Observe visualmente a los animales en busca de anomalías, incluidos signos de mordedura o barbería. Excluya toda la jaula de la serie experimental si un animal muestra lesiones mínimas. Asegúrese de que un veterinario esté disponible en cualquier momento, ya que las lesiones empeorarán durante el experimento y evitarán la continuación a medida que los ratones se vuelvan más agresivos bajo la influencia del estrés.
   2. Obtenga el peso corporal de cada animal antes de comenzar el experimento. Asegúrese de que la pérdida de peso a menudo observada no exceda el 20% del peso corporal inicial. Excluir a los animales con una pérdida de peso de más del 20% e inmediatamente sacrificarlos debido al supuesto alto sufrimiento.
   3. Llene un vaso de precipitados o cilindro con agua a temperatura ambiente (22-23 ° C) a una altura de al menos 20 cm desde el fondo, dejando un mínimo de 10 cm entre la superficie del agua y el borde superior del recipiente.
2. Rendimiento
   1. Transfiera suavemente los animales al agua. Durante la fase de natación, mantenga al animal bajo observación continua para evitar ahogamientos. Observe desde una posición en la que el animal no pueda ver al experimentador (por ejemplo, observación en video desde una habitación de al lado).
   2. Establezca un cronómetro al comienzo del experimento. Saque a los animales del agua después de 10 minutos simplemente agarrando sus colas. Sécalos suavemente con una toalla de papel y colócalos bajo una luz de calefacción o en una alfombra calefactora.
   3. Evalúe solo un animal a la vez. Asegúrese de que los animales no puedan verse entre sí (por ejemplo, separe la jaula de alojamiento de la configuración experimental mediante un divisor de habitaciones).
   4. Realice la sesión de natación forzada durante 10 minutos cada día durante 5 días consecutivos.
3. Acabado
   1. Transfiera a los animales de regreso a sus jaulas domésticas después de cinco sesiones de natación y permítales descansar durante al menos 2 días. Iniciar intervenciones de tratamiento específicas posteriormente.

3. Evaluación de un tratamiento antidepresivo

1. Curso de tiempo
   1. Evaluar los tratamientos agudos y subcrónicos con el MDL. Dependiendo de la pregunta científica, adapte el período de descanso entre la fase de inducción y la lectura.
   2. Para evaluar la potencia aguda y de acción rápida de la ketamina, elija un corto período de descanso (unos días) después de la fase de inducción de CDM. Aplique el tratamiento (es decir, inyección intraperitoneal) y luego realice la evaluación (sesión de natación adicional o método de evaluación diferente) poco después.
   3. Para evaluar los efectos de un tratamiento subcrónico, aumente el período de tratamiento hasta 4 semanas (no hay datos disponibles para períodos de tratamiento más largos). Por ejemplo, administrar el tratamiento oral con imipramina a los animales durante 4 semanas después de la fase de inducción y evaluar a partir de entonces.
   4. Comience a evaluar el estado depresivo justo después del final del período de tratamiento, por ejemplo, al día siguiente. Elija siempre un período de tiempo idéntico para las condiciones de control y experimentales.
2. Tiempo de inmovilidad
   1. Prueba de concepto
      1. Para utilizar el tiempo de inmovilidad como método de lectura, evalúe cada día de la fase de inducción y el día de prueba para proporcionar una prueba de concepto (ver Figura 1). Para otras series experimentales, reduzca las evaluaciones al día 1, al día 5 y al día de prueba (consulte la Figura 1C).
      2. Graba en vídeo cada experimento. Permita que dos observadores entrenados que están cegados a las condiciones experimentales realicen el análisis de forma independiente. El análisis de video permite al experimentador observar el comportamiento desde una habitación diferente, minimizando así la interferencia con la prueba (por ejemplo, ver el archivo de video en el material complementario).
   2. Condiciones: Observe e identifique las tres condiciones de comportamiento diferentes durante la prueba de natación: lucha, natación e inmovilidad. La mayoría de los investigadores se centran en la inmovilidad; una diferenciación adicional entre luchar y nadar rara vez es útil y aumenta drásticamente la complejidad y la duración del análisis.
      1. Lucha: El animal trata activamente de escapar de la situación amenazante. Esto implica patear el lado del cilindro con la cabeza orientada hacia la pared y los movimientos de todas las extremidades. La superficie del agua suele ser ligeramente turbulenta.
      2. Natación: El animal mueve al menos ambas patas traseras y recorre una distancia por todo el agua. Busca activamente una salida, pero no intenta superar la pared de vidrio de la embarcación. Nadar no implica levantar las patas por encima de la superficie del agua, y el cuerpo generalmente está orientado paralelo a las paredes del cilindro. En esta condición, los animales con frecuencia se dan la vuelta o se mueven en círculos.
      3. Inmovilidad: El animal se mantiene quieto, en una posición similar a la congelación, y no se mueve en absoluto o solo mueve la cola, o las patas delanteras para mantener su cabeza por encima de la superficie del agua. No se recorre activamente ninguna distancia, excepto la flotación pasiva, y no se observa ningún movimiento dirigido de las patas delanteras.
   3. Seguimiento
      1. Realice la evaluación utilizando grabaciones de video sin conexión. Utilice calificaciones cegadas por dos examinadores independientes y experimentados y calcule los promedios entre las dos calificaciones.
      2. Repita las clasificaciones si los resultados de los dos evaluadores difieren por encima de un rango previamente determinado. Observe continuamente a los ratones ya que las diferentes condiciones cambian con frecuencia entre la lucha, la natación y la inmovilidad.
      3. Use un cronómetro para medir el tiempo total que pasa en una etapa enfocada (generalmente inmovilidad) durante los 10 minutos que el ratón permanece en el agua. Considere una latencia corta de aproximadamente un segundo antes de cambiar la medición de tiempo en curso (por ejemplo, si un animal permanece durante 20 s en inmovilidad y solo se mueve una vez por menos de un segundo y vuelve a la inmovilidad durante otros 10 s, el tiempo total de inmovilidad es de 30 s).
   4. Estadísticas: Debido a la desviación estándar interindividual relativamente alta (probablemente causada por una transferencia del comportamiento dependiente de la jerarquía de la jaula a la prueba de natación), marque o etiquete a los animales para realizar pruebas paramétricas pareadas (en lugar de no emparejadas) después. Evaluar la distribución de la normalidad y, dependiendo de la pregunta específica, realizar análisis de varianza (ANOVA) con pruebas t post-hoc o pruebas t pareadas para comparar los diferentes grupos. Realizar el análisis utilizando valores absolutos de tiempo(s) de inmovilidad o como valores normalizados.
      1. Valores absolutos: Indique los valores medios del tiempo de inmovilidad desde el día 1 hasta el día 5 y para el día de prueba ± SEM (ver Figura 1A). Compare los valores promediados para el día 1 y el día 5, preferiblemente utilizando una prueba t pareada para validar la inducción de un estado depresivo. Si hay una diferencia significativa entre el día 1 y el 5, compare los valores medios del día 5 con los resultados promediados del día de prueba. Asegúrese de que el tamaño típico de un grupo en un experimento sea de entre 6 y 10 animales y espere diferencias significativas entre los tiempos de inmovilidad basales y posteriores a la inducción en animales de tipo salvaje. La comparación de diferentes grupos con una prueba t no apareada es difícil si se utilizan valores absolutos debido a las diferencias basales; por lo tanto, utilice valores normalizados.
      2. Valores relativos/normalizados: Compare los diferentes efectos del tratamiento por normalización con el resultado individual del día 5, y luego exprese los valores como un porcentaje del día 5 (ver Figura 1B).
   5. Experimentos de control
      NOTA: El rendimiento de la natación puede estar correlacionado con la locomoción. Las sustancias que causan una hiper locomoción podrían inducir resultados falsos positivos (es decir, una disminución del tiempo de inmovilidad); así como los agentes sedantes podrían aumentar artificialmente el tiempo de inmovilidad.
      1. Evalúe los cambios en la locomoción para sustancias desconocidas antes de realizar el análisis de natación. Use la prueba de campo abierto (OFT) en un grupo separado de animales durante al menos 10 minutos.
      2. Elija el mismo tiempo de observación (10 min) en el OFT que en el MDL para detectar efectos hipermotores inespecíficos del compuesto probado que podrían influir en la lectura del MDL a través de la medición del tiempo de inmovilidad con alta validez.
      3. En caso de efectos hipermotores significativos, no evalúe la sesión de natación para evaluar la potencia antidepresiva, sino que utilice diferentes métodos de lectura (por ejemplo, preferencia de sacarosa, prueba de suspensión de cola, etc.).

4. Evaluación del desarrollo de un estado depresivo

1. Para evaluar el desarrollo de un trastorno depresivo, evalúe cada día de la fase de inducción para medir el tiempo de inmovilidad.
   NOTA: En este caso, un aumento menor del tiempo de inmovilidad entre cada día describe la resiliencia, mientras que un aumento más fuerte y temprano en comparación con los animales no tratados o de tipo salvaje representa una mayor vulnerabilidad a la desesperación inducida por el estrés. Al tratar a los ratones antes del evento de natación, se pudo evaluar la intervención preventiva o las líneas de ratones transgénicos con respecto al desarrollo de la desesperación conductual.

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Resultados

En la primera sesión de natación de la fase de inducción de CDM, los ratones suelen mostrar un tiempo medio de inmovilidad entre 190 s y 230 s, que aumenta constantemente con cada sesión de natación adicional (Figura 1A). Este aumento es más pronunciado en los primeros 3 días y alcanza una fase similar a una meseta durante los últimos 2-3 días. El tiempo de inmovilidad medido en el día 5 permanece estable durante hasta 4 semanas, lo que indica una d...

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Discusión

El modelo MDL representa un modelo relevante y establecido para probar la potencia antidepresiva de nuevas intervenciones y abre una ventana de tiempo extendida para experimentos moleculares o electrofisiológicos para dilucidar la fisiopatología de la depresión. Especialmente cuando se combina con otras pruebas para evaluar un estado similar a la depresión, CDM tiene una alta validez de cara y concepto. Combina el estrés subcrónico y la impotencia adquirida para la inducción y produce un estado depresivo de larga ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker, 2000 mL	Kimble Kimax	14000-2000	any vessel >2000ml and diameter of 24-26 cm possible
Digital Thermometer	Hanna Instruments	846-4708	any digital thermometer possible
Digitalwaage 200 g Dipse	DIPSE	tp200	any digital scale possible
Lenovo ThinkCentre V50a-24IMB AiO 11FJ00DVGE - 60,5 cm	Lenovo	A 908278	any standard Personalcomputer possible
Logitech PTZ Pro	Logitech	1000005246	any high resolution camera possible
Stopwatch ROTILABO	Carl Roth	L423.1	any stopwatch possible
Timer ROTILABO	Carl Roth	A802.1	any timer possible