Uso de placas base y un miniscopio preanclado con una lente objetiva para la investigación transitoria de calcio en ratones

Resumen

La contracción del cemento dental durante el curado desplaza la placa base. Este protocolo minimiza el problema al crear una base inicial del cemento dental que deja espacio para cementar la placa base. Semanas más tarde, la placa base se puede cementar en posición en este andamio con poco cemento nuevo, reduciendo así la contracción.

Resumen

Los neurocientíficos usan microscopios en miniatura (miniscopios) para observar la actividad neuronal en animales que se comportan libremente. El equipo de Miniscopios de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA) proporciona recursos abiertos para que los investigadores construyan miniscopios ellos mismos. El V3 UCLA Miniscope es uno de los miniscopios de código abierto más populares actualmente en uso. Permite obtener imágenes de los transitorios de fluorescencia emitidos por neuronas modificadas genéticamente a través de una lente objetiva implantada en la corteza superficial (un sistema de una lente), o en áreas cerebrales profundas a través de una combinación de una lente de relé implantada en el cerebro profundo y una lente objetiva que está preanclada en el miniscopio para observar la imagen transmitida (un sistema de dos lentes). Incluso en condiciones óptimas (cuando las neuronas expresan indicadores de fluorescencia y la lente del relé se ha implantado correctamente), un cambio de volumen del cemento dental entre la placa base y su unión al cráneo tras el curado con cemento puede causar una desalineación con una distancia alterada entre el objetivo y las lentes del relé, lo que resulta en una mala calidad de imagen. Una placa base es una placa que ayuda a montar el miniscopio en el cráneo y fija la distancia de trabajo entre el objetivo y las lentes del relé. Por lo tanto, los cambios en el volumen del cemento dental alrededor de la placa base alteran la distancia entre las lentes. El presente protocolo tiene como objetivo minimizar el problema de desalineación causado por los cambios de volumen en el cemento dental. El protocolo reduce la desalineación mediante la construcción de una base inicial de cemento dental durante la implantación de lentes de relé. El tiempo de convalecencia después de la implantación es suficiente para que la base del cemento dental cure completamente la placa base, por lo que la placa base se puede cementar en este andamio utilizando la menor cantidad de cemento nuevo posible. En el presente artículo, describimos estrategias para el recubrimiento de base en ratones para permitir la obtención de imágenes de la actividad neuronal con una lente objetiva anclada en el miniscopio.

Introducción

Los reporteros de actividad fluorescente son ideales para obtener imágenes de la actividad neuronal porque son sensibles y tienen grandes rangos dinámicos ^1,2,3. Por lo tanto, un número creciente de experimentos están utilizando microscopía de fluorescencia para observar directamente la actividad neuronal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. El primer microscopio de fluorescencia miniaturizado de un fotón (miniscopio) fue diseñado en 2011 por Mark Schnitzer et ^al.5. Este miniscopio permite a los investigadores monitorear la dinámica de fluorescencia de las células cerebelosas en animales que se comportan libremente⁵ (es decir, sin ninguna restricción física, restricción de la cabeza, sedación o anestesia para los animales). Actualmente, la técnica se puede aplicar para monitorear áreas cerebrales superficiales como la corteza 6,8,15,16; áreas subcorticales como el hipocampo dorsal 8,11,13,14 y el cuerpo estriado ^6,17; y áreas cerebrales profundas como el hipocampo ventral 14, la amígdala 10,18 y el hipotálamo ^8,12.

En los últimos años, se han desarrollado varios miniscopios de código abierto.^{4,5,6,7,11,13,17,19}. El miniscopio puede ser ensamblado económicamente por los investigadores si siguen las pautas paso a paso proporcionadas por el equipo de Miniscopio de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA).^4,7,11,13. Porque el monitoreo óptico de la actividad neuronal está restringido por las limitaciones de la transmisión de la luz⁷ hacia y desde la población neuronal de interés, se diseñó un miniscopio que requiere que una lente de índice de refracción de gradiente objetivo (GRIN) (o lente objetiva) se ancle previamente en la parte inferior del miniscopio para ampliar el campo de visión que se transmite desde una lente GRIN de relé (o lente de relé)^{6,7,8,10,16,17}. Esta lente de relé se implanta en la región del cerebro objetivo de tal manera que la actividad de fluorescencia de la región del cerebro objetivo se transmite a la superficie de la lente de relé.^{6,7,8,10,16,17}. Aproximadamente 1/4 de un período sinusoidal completo de luz viaja a través de la lente GRIN del objetivo (~ 0.25 tono) (Figura 1A1), lo que da como resultado una imagen de fluorescencia ampliada^6,7. La lente del objetivo no siempre se fija en la parte inferior del miniscopio ni es necesaria la implantación de la lente del relé^6,7,11,13,15. Específicamente, hay dos configuraciones: una con una lente de objetivo fijo en el miniscopio y una lente de relé implantada en el cerebro.^{8,10,12,14,16} (Figura 1B1) y otro con solo una lente de objetivo extraíble^6,7,11,13,15 (Figura 1B2). En el diseño basado en el objetivo fijo y la combinación de lente de relé implantada, las señales de fluorescencia del cerebro se llevan a la superficie superior de la lente de relé (Figura 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. Posteriormente, la lente del objetivo puede ampliar y transmitir el campo visual desde la superficie superior de la lente del relé (Figura 1A2). Por otro lado, el diseño de la lente GRIN de objetivo extraíble es más flexible, lo que significa que la preimplantación de una lente de relé en el cerebro no es obligatoria (Figura 1B2)^6,7,11,13,15. Cuando se usa un miniscopio basado en un diseño de lente objetivo extraíble, los investigadores aún necesitan implantar una lente en la región del cerebro objetivo, pero pueden implantar una lente objetiva.^6,7,11,13,15 o una lente de relé en el cerebro^6,7. La elección de un objetivo o una lente de relé para la implantación determina la configuración del miniscopio que el investigador debe utilizar. Por ejemplo, el V3 UCLA Miniscope se basa en un diseño de lente GRIN objetivo extraíble. Los investigadores pueden elegir entre implantar directamente una lente objetiva en la región del cerebro de interés y montar el miniscopio "vacío" en la lente del objetivo.^6,7,11,13,15 (un sistema de una lente; Figura 1B2) o para implantar una lente de relé en el cerebro y montar un miniscopio que está preanclado con una lente objetiva^6,7 (un sistema de dos lentes; Figura 1B1). El miniscopio luego funciona como una cámara de fluorescencia para capturar imágenes en vivo de la fluorescencia neuronal producida por un indicador de calcio codificado genéticamente.^1,2,3. Después de conectar el miniscopio a una computadora, estas imágenes de fluorescencia se pueden transferir a la computadora y guardar como videoclips. Los investigadores pueden estudiar la actividad neuronal analizando los cambios relativos en la fluorescencia con algunos paquetes de análisis.^20,21 o escribir sus códigos para futuros análisis.

El V3 UCLA Miniscope proporciona flexibilidad para que los usuarios determinen si desean obtener imágenes de la actividad neuronal con un sistema de una o dos lentes⁷. La elección del sistema de grabación se basa en la profundidad y el tamaño del área del cerebro objetivo. En resumen, un sistema de una lente solo puede obtener imágenes de un área superficial (menos de aproximadamente 2.5 mm de profundidad) y relativamente grande (más grande que aproximadamente 1.8 x 1.8 mm²) porque los fabricantes solo producen un cierto tamaño de lente objetiva. Por el contrario, se puede aplicar un sistema de dos lentes a cualquier área del cerebro objetivo. Sin embargo, el cemento dental para pegar la placa base tiende a causar desalineación con una distancia alterada entre el objetivo y las lentes del relé, lo que resulta en una mala calidad de imagen. Si se utiliza el sistema de dos lentes, es necesario orientar con precisión dos distancias de trabajo para lograr la calidad de imagen óptima (Figura 1A). Estas dos distancias críticas de trabajo son entre las neuronas y la superficie inferior de la lente del relé, y entre la superficie superior de la lente del relé y la superficie inferior de la lente del objetivo (Figura 1A1). Cualquier desalineación o colocación incorrecta de la lente fuera de la distancia de trabajo da como resultado una falla de imagen (Figura 1C2). Por el contrario, el sistema de una lente requiere solo una distancia de trabajo precisa. Sin embargo, el tamaño de la lente del objetivo limita su aplicación para el monitoreo de regiones cerebrales profundas (la lente del objetivo que se ajusta al miniscopio es aproximadamente 1.8 ~ 2.0 mm 6,11,13,15). Por lo tanto, la implantación de una lente objetiva es limitada para la observación de la superficie y regiones cerebrales relativamente grandes, como la corteza 6,15 y la cornu ammonis dorsal 1 (CA1) en ratones^11,13 . Además, se debe aspirar una gran área de la corteza para apuntar al CA1 dorsal^11,13. Debido a la limitación de la configuración de una lente que impide la obtención de imágenes de regiones cerebrales profundas, los sistemas de miniscopio comerciales ofrecen solo un diseño combinado de lente / lente de relé objetivo (dos lentes). Por otro lado, el miniscopio V3 UCLA se puede modificar en un sistema de una o dos lentes porque su lente objetivo es extraíble 6,11,13,15. En otras palabras, los usuarios del miniscopio V3 UCLA pueden aprovechar la lente extraíble implantándola en el cerebro (creando un sistema de una lente), al realizar experimentos que involucran observaciones cerebrales superficiales (menos de 2.5 mm de profundidad), o preanclarla en el miniscopio e implantar una lente de relé en el cerebro (creando un sistema de dos lentes), al realizar experimentos que involucran observaciones cerebrales profundas. El sistema de dos lentes también se puede aplicar para observar superficialmente el cerebro, pero el investigador debe conocer las distancias de trabajo precisas entre la lente del objetivo y la lente del relé. La principal ventaja del sistema de una lente es que hay una menor probabilidad de perder las distancias de trabajo que con un sistema de dos lentes, dado que hay dos distancias de trabajo que deben orientarse con precisión para lograr una calidad de imagen óptima en el sistema de dos lentes (Figura 1A). Por lo tanto, recomendamos usar un sistema de una lente para observaciones cerebrales superficiales. Sin embargo, si el experimento requiere imágenes en el área profunda del cerebro, el investigador debe aprender a evitar la desalineación de las dos lentes.

El protocolo básico para la configuración de dos lentes de miniscopios para experimentos incluye la implantación de lentes y el revestimiento base 8,10,16,17. El recubrimiento base es el pegado de una placa base en la cabeza de un animal para que el miniscopio pueda montarse eventualmente en la parte superior del animal y grabar en video las señales de fluorescencia de las neuronas (Figura 1B). Este procedimiento implica el uso de cemento dental para pegar la placa base en el cráneo (Figura 1C), pero la contracción del cemento dental puede causar cambios inaceptables en la distancia entre la lente de relé implantada y la lente del objetivo ^8,17. Si la distancia desplazada entre las dos lentes es demasiado grande, las células no se pueden enfocar.

Ya se han publicado protocolos detallados para experimentos de imágenes profundas de calcio cerebral utilizando miniscopios^8,10,16,17. Los autores de estos protocolos han utilizado el sistema Inscopix^8,10,16 u otros diseños personalizados¹⁷ y han descrito los procedimientos experimentales para la selección viral, la cirugía y la fijación de la placa base. Sin embargo, sus protocolos no se pueden aplicar con precisión a otros sistemas de código abierto, como el sistema V3 UCLA Miniscope, NINscope.⁶, y Finchscope¹⁹. La desalineación de las dos lentes puede ocurrir durante la grabación en una configuración de dos lentes con un miniscopio UCLA debido al tipo de cemento dental que se utiliza para cementar la placa base al cráneo.^8,17 (Figura 1C). El protocolo actual es necesario porque la distancia entre la lente de relé implantada y la lente del objetivo es propensa a cambiar debido a la contracción indeseable del cemento dental durante el procedimiento de recubrimiento base. Durante el recubrimiento base, la distancia de trabajo óptima entre la lente de relé implantada y la lente del objetivo debe encontrarse ajustando la distancia entre el miniscopio y la parte superior de la lente del relé, y la placa base debe pegarse en esta ubicación ideal. Después de ajustar la distancia correcta entre la lente del objetivo y la lente de relé implantada, se pueden obtener mediciones longitudinales a resolución celular (Figura 1B; in vivo grabación). Dado que el rango óptimo de distancias de trabajo de una lente de relé es pequeño (50 - 350 μm)^4,8, la contracción excesiva del cemento durante el curado puede dificultar mantener la lente del objetivo y la lente de relé implantada dentro del rango apropiado. El objetivo general de este informe es proporcionar un protocolo para reducir los problemas de contracción.^8,17 que ocurren durante el procedimiento de recubrimiento base y para aumentar la tasa de éxito de las grabaciones de miniscopio de señales de fluorescencia en una configuración de dos lentes. La grabación exitosa de miniscopios se define como la grabación de una transmisión en vivo de cambios relativos notables en la fluorescencia de neuronas individuales en un animal que se comporta libremente. Aunque las diferentes marcas de cemento dental tienen diferentes tasas de contracción, los investigadores pueden seleccionar una marca que haya sido probada previamente.^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. Sin embargo, no todas las marcas son fáciles de obtener en algunos países / regiones debido a las regulaciones de importación de materiales médicos. Por lo tanto, hemos desarrollado métodos para probar las tasas de contracción de los cementos dentales disponibles y, lo que es más importante, proporcionar un protocolo alternativo que minimice el problema de contracción. La ventaja sobre el protocolo de recubrimiento base actual es un aumento en la tasa de éxito de las imágenes de calcio con herramientas y cemento que se pueden obtener fácilmente en los laboratorios. El miniscopio UCLA se utiliza como ejemplo, pero el protocolo también es aplicable a otros miniscopios. En este informe, describimos un procedimiento de revestimiento base optimizado y también recomendamos algunas estrategias para ajustar el sistema de dos lentes del miniscopio UCLA (Figura 2A). Tanto los ejemplos de implantación exitosa (n = 3 ratones) como los ejemplos de implantación fallida (n = 2 ratones) para la configuración de dos lentes con el miniscopio UCLA se presentan junto con las discusiones sobre las razones de los éxitos y fracasos.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Nacional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Taiwán (Nº de aprobación: NTU-109-EL-00029 y NTU-108-EL-00158).

1. Evaluación de la alteración volumétrica del cemento dental

NOTA: Los cambios en el volumen de cemento dental ocurren durante el proceso de curado. Pruebe los cambios de volumen del cemento dental antes de la implantación y el revestimiento base. Los investigadores pueden probar cualquier marca de cemento dental y usar la marca con el cambio de volumen más bajo para cementar la placa base. En la figura 3 se muestra un ejemplo.

1. Pesar 0,5 g de cada polvo de cemento dental y mezclarlo con su solución adecuada (1 ml).
   NOTA: La proporción de polvo / líquido recomendada en las instrucciones del cemento dental es de 0,5 g de polvo a 0,25 ml de la solución para obtener una forma sólida. Este protocolo de prueba diluye la proporción a 0,5 g / ml para que la mezcla pueda aspirarse en forma líquida para medir el cambio de volumen en las puntas de las pipetas.
2. Use puntas de pipeta de 0.1-10 μL para eliminar 2.5 μL de la mezcla de cemento dental y luego selle la punta de la pipeta con un pegamento de curado ligero.
3. Coloque las puntas en una rejilla, marque los niveles superiores de la mezcla de cemento dental y mida el nivel de la mezcla de cemento dental después de 40 minutos (video complementario S1).
4. Además de monitorear los cambios de nivel durante el curado del cemento dental en las puntas, mida la densidad restante del cemento dental seco. Para calcular la densidad, mida el peso del cemento dental y mida el volumen con el principio de Arquímedes.
   1. En resumen, coloque el cemento dental seco restante en una taza llena de agua y pese el agua que se desborda.
5. Utilice el cemento dental con la menor contracción para todos los protocolos detallados a continuación.

2. Anestesia, implantación quirúrgica, inyección viral y recubrimiento base ficticio

1. Anestesia
   NOTA: El presente informe tiene como objetivo optimizar la cirugía y el procedimiento de placa base para el miniscopio de UCLA; Por lo tanto, se asumió que se conocía el título viral óptimo para infectar las regiones cerebrales objetivo. Los métodos para encontrar el título viral óptimo se pueden encontrar en los pasos 1 a 5 de Resendez et al.⁸. Una vez optimizada la dilución viral, se puede iniciar la implantación quirúrgica.
   1. Coloque el ratón en un recipiente de inducción y proporcione oxígeno (100% a una tasa de flujo de aire de 0,2 L / min). Preoxigenar el ratón durante 5 a 10 min.
   2. Administrar isoflurano al 5% mezclado con oxígeno al 100% (caudal de aire: 0,2 L/min) hasta que el ratón comience a perder el equilibrio y finalmente sea anestesiado.
   3. Retirar el ratón de la cámara de inducción e inyectar atropina (0,04 mg/kg; inyección subcutánea), para evitar la acumulación de saliva y buprenorfina (0,03 mg/kg; inyección subcutánea) como analgésico.
   4. Afeite la cabeza del ratón.
   5. Use una máscara, bata estéril y guantes. Preparar un espacio estéril e instrumentos quirúrgicos estériles para la cirugía. Estabilizar la cabeza del ratón (mantener la anestesia con isoflurano al 3 a 2,5% durante este paso) en el aparato estereotáxico. Después de los procedimientos analgésicos y anestésicos, asegúrese de que las barras para los oídos estabilicen firmemente la cabeza. Proporcionar soporte térmico.
   6. Asegúrese de que la cabeza esté en posición recta, esterilice la cabeza afeitada con betadina y luego rocíe la cabeza con xilocaína (10%), un analgésico local.
   7. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad.
      NOTA: Use ungüento oftálmico para la protección ocular durante todos los eventos anestésicos para prevenir lesiones oculares.
   8. Prueba el reflejo de dolor profundo del animal pellizcando su pata trasera. Una vez que el animal no muestre reflejo de abstinencia de la pata, proceda con los procedimientos quirúrgicos.
   9. Haga una pequeña incisión a lo largo del plano sagital medio del cráneo (comenzando desde aproximadamente 2 mm anterior al bregma y terminando aproximadamente 6 mm posterior al bregma). Luego, limpie el tejido conectivo en el cráneo y ancle tres tornillos de acero inoxidable en los huesos frontales e interparietales izquierdos.
      1. En este punto, reduzca el isoflurano al 1-2%. Controle la frecuencia respiratoria durante todo el procedimiento quirúrgico. Si la frecuencia respiratoria es demasiado lenta (aproximadamente 1/s, dependiendo del animal), disminuya la concentración de isoflurano.
   10. Ejecute una craneotomía para la implantación de la lente del relé bajo un microscopio quirúrgico o estereomicroscopio mediante el uso de un taladro de rebabas con un diámetro de punta de 0,7 mm. Use un microtaladro para agarrar la broca de rebabas y dibuje un contorno del área del círculo prevista (no es necesario penetrar todo el grosor del calvario).
       NOTA: La lente de relé utilizada en el presente protocolo tenía un diámetro de 1.0 mm, una longitud ~ 9.0 mm un paso de 1 y un rango de distancia de trabajo de ~100 μm - 300 μm; por lo tanto, la craneotomía tenía un diámetro de 1,2 mm.
       1. Profundice suavemente el contorno hasta que la duramadre quede expuesta.
       2. Prepare 3 ml de solución salina estéril en una jeringa de 3 ml y enfríela en un cubo de hielo. Enjuague con frecuencia el área expuesta con 0.1 ml de solución salina de la jeringa para enfriar el área y evitar daños por calor y hemorragia.
   11. Recoge y despega ligeramente la duramadre con una aguja de 27G.
   12. Coloque una marca en una aguja roma de 27 G a 1 mm de la punta y úsela para aspirar cuidadosamente la corteza cerebral con el fin de crear una ventana para la implantación de lentes 8,11,13,17 (Figura 2B1). Si es necesario, haga una aguja roma moliendo la punta de una aguja de inyección de 27 G con papel de lija. Luego, conecte la aguja a una jeringa, conecte la jeringa a un tubo y conecte el tubo a una fuente de succión para crear un vacío.
       NOTA: La lente del relé es roma y comprimirá el tejido cerebral cuando se coloque en el área profunda del cerebro. Por lo tanto, la aspiración de la corteza reduce el daño tisular debido a la implantación de lentes de relé. La corteza tiene aproximadamente 1 mm de espesor en ratones, pero es difícil de visualizar bajo un microscopio estereoscópico. La marca crea un punto de referencia para permitir que la profundidad de la aguja se determine con mayor precisión que con un microscopio estereoscópico solo. Además, se puede determinar si la región de la corteza ha sido alcanzada o pasada dependiendo de la resistencia; La parte superior de la corteza se siente relativamente suave, mientras que la región subcortical se siente densa. Por lo tanto, una vez que la textura comience a sentirse más densa, detenga la aspiración (Figura 2B3).
   13. Prepare 3 ml de solución salina estéril en una jeringa de 3 ml y enfríela en un cubo de hielo. Enjuague el área con solución salina para detener el sangrado y disminuir la posibilidad de edema cerebral.
2. Inyección de virus adenoasociado (AAV)
   NOTA: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE se utilizó en el presente experimento. jGCaMP7s es un indicador de calcio codificado genéticamente que emite fluorescencia verde³. Debido a que el presente estudio utilizó un ratón de tipo salvaje como sujeto, se necesitó un vector viral para transfectar las neuronas con el gen indicador de calcio verde-fluorescente y permitir la expresión. Los investigadores que utilizan ratones transgénicos que expresan el indicador de calcio verde-fluorescente como sus sujetos pueden omitir el protocolo 2.2.
   1. Monte la aguja interna de un catéter intravenoso (i.v.) de 20 G en el brazo estereotáxico y perfore lentamente (~100 - 200 μm/min) el cerebro en las coordenadas apropiadas (las mismas coordenadas utilizadas durante la implantación de lentes de relé) (Figura 2B3).
   2. Baje la aguja de microinyección a una velocidad de 100-200 μm/min en el CA1 ventral e infunda (~ 25 nL/min) 200 nL del vector viral en la región diana (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML y -3,50 mm DV desde el bregma).
   3. Espere 10 minutos para permitir que el virus se difunda y minimizar el flujo de retorno.
   4. Extraiga (~100-200 μm/min) la aguja de microinyección.
3. Implantación de lentes de relé
   1. Desinfectar la lente del relé con alcohol al 75%^10,16 y luego enjuagar con solución salina sin pirógenos. Remoje la lente en solución salina fría sin pirógenos hasta la implantación.
      NOTA: Una lente fría minimiza el edema cerebral cuando se coloca en el cerebro.
   2. Sostenga la lente del relé con una abrazadera micro bulldog (Figura 2B3) cuyos dientes hayan sido cubiertos con tubos termorretráctiles.
      NOTA: La abrazadera bulldog puede sostener firmemente la lente sin dañarla. Consulte Resendez et ^al.8 para el método para hacer la abrazadera de bulldog cubierta de tubos.
   3. Coloque lentamente (~100 - 200 μm/min) la lente del relé en la parte superior de la región objetivo (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML y -3,50 mm DV desde el bregma) y estabilícela con cemento dental.
4. Base ficticia
   NOTA: El propósito del "revestimiento base ficticio" durante la cirugía de implantación es crear una base de cemento dental para reducir la cantidad de cemento dental que debe aplicarse durante el procedimiento de recubrimiento base real varias semanas después. De esta manera, se minimiza el riesgo de un cambio en el volumen del cemento dental.
   1. Fije la lente del objetivo en la parte inferior del miniscopio y ensamble la placa base en el miniscopio (en este paso, el ensamblaje de la lente del objetivo anclado, la placa base y el miniscopio aún no se han colocado sobre el cráneo del ratón).
   2. Envuelva 10 cm de película de parafina alrededor del exterior de la placa base (Figura 4A).
   3. Sostenga el miniscopio con la sonda de brazo estereotáxica utilizando arcilla adhesiva reutilizable.
   4. Alinee la lente del objetivo en la parte superior de la lente del relé con el menor espacio posible entre las lentes (Figura 4B).
   5. Use cemento dental para asegurar la posición de la placa base (de modo que el cemento toque solo la película de parafina).
   6. Cuando el cemento dental se haya secado, retire la película.
   7. Retire la placa base y el miniscopio. La base de cemento dental es hueca (Figura 4B).
   8. Para proteger la lente del relé de las actividades diarias y de ser rayada por el mouse, selle la lente del relé con un poco de caucho de silicona moldeada hasta que la lente del relé esté cubierta, y cubra la goma de silicona con una capa delgada de cemento dental (Figura 4B).
   9. Desenganche el ratón de los instrumentos estereotáxicos y colóquelo en una cámara de recuperación.
   10. Inyecte carprofeno (5 mg/kg; inyección subcutánea) o meloxicam (1 mg/kg; inyección subcutánea) para analgesia y ceftazidima (25 mg/kg; inyección subcutánea) para prevenir la infección.
       NOTA: El uso de antibióticos no es una alternativa a una técnica aséptica. Los antibióticos perioperatorios (es decir, ceftazidima) pueden estar indicados en ciertas circunstancias, como cirugías de larga duración o colocación de implantes crónicos.
   11. Observe al animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
   12. Alojar ratones individualmente e inyectar meloxicam (1 mg/kg; inyección subcutánea; cada 24h) durante una semana para aliviar el dolor posquirúrgico. Revise al animal todos los días después de la cirugía para asegurarse de que está comiendo, bebiendo y defecando normalmente.
   13. Realice el recubrimiento base después de 3 o más semanas.

3. Revestimiento base

NOTA: Por lo general, el procedimiento de placa base (Figura 5) no se puede realizar dentro de las 2-3 semanas del procedimiento inicial debido al tiempo de recuperación e incubación viral. Los procedimientos de inducción para el recubrimiento de base son similares a los descritos en los pasos 2.1.1 a 2.1.8. Sin embargo, el revestimiento de base no es un procedimiento invasivo, y el animal solo requiere sedación ligera. Por lo tanto, el isoflurano al 0,8-1,2% es suficiente, siempre y cuando el animal no pueda moverse en el marco estereotáxico. Además, la anestesia con isoflurano relativamente ligero también puede ayudar a facilitar la expresión de los transitorios de fluorescencia de las neuronas durante el monitoreo⁸ (Video suplementario S2).

1. Corte cuidadosamente la capa delgada del techo de cemento dental con un rongeur de hueso y retire la goma de silicona. Limpie la superficie de la lente del relé con un 75% de alcohol.
2. Sujete un tornillo de ajuste al lado de la placa base para fijarlo a la parte inferior del miniscopio (Figura 5A1).
   NOTA: La placa base debe apretarse firmemente debajo de la parte inferior del miniscopio porque la diferencia entre una placa base apretada y ligeramente sujeta puede causar una distancia inconsistente.
3. Ajuste la diapositiva de enfoque para que esté aproximadamente a 2,7 - 3 mm de la carcasa principal (Figura 5A2).
   NOTA: Aunque la longitud se puede ajustar aún más durante el procedimiento de base, fíjela a aproximadamente 2,7 mm, ya que ajustar simultáneamente la longitud del miniscopio y la longitud óptima entre la lente de relé implantada y la lente de objetivo preanclada es muy confuso.
4. Conecte el miniscopio a la placa de adquisición de datos y conéctelo a un puerto USB 3.0 (o versión superior) en una computadora.
5. Ejecutar el software de adquisición de datos desarrollado por el equipo de UCLA.
6. Ajuste la exposición a 255, la ganancia a 64x y el LED de excitación al 5%. Estos ajustes se recomiendan para el revestimiento base inicial; La configuración específica variará dependiendo de las regiones cerebrales y los niveles de expresión del indicador de calcio codificado genéticamente.
7. Haga clic en el botón Conectar para conectar el miniscopio al software de adquisición de datos y ver la transmisión en vivo.
8. Alinee la lente del objetivo del miniscopio con la lente del relé con la mano y comience a buscar las señales de fluorescencia (Figura 5B₁).
   NOTA: Inicialmente, la búsqueda manual de la señal de fluorescencia facilita los ajustes. Debido a que se utilizó un sistema AAV para expresar el indicador de calcio codificado genéticamente, tanto el tipo promotor como el serotipo AAV afectaron la eficiencia de la transfección^23,24. Los investigadores deberían necesitar verificar la expresión del indicador de calcio encontrando neuronas individuales que muestren cambios en la fluorescencia antes de proceder con futuros experimentos.
9. Perfore el cemento dental en cualquier lugar donde bloquee el miniscopio (opcional).
10. Vea la transmisión en vivo del software de adquisición de datos y use el margen de la lente del relé como punto de referencia (video complementario S2). El margen de la lente del relé aparece como un círculo gris similar a una luna en el monitor (Figura 5B1; flechas blancas).
11. Una vez que se encuentre la lente del relé, ajuste cuidadosamente los diversos ángulos y distancias del miniscopio hasta que se encuentren las señales de fluorescencia.
    NOTA: Las imágenes de las neuronas son más blancas que el fondo. Una forma neuronal precisa indica que las neuronas se encuentran perfectamente en el plano focal de la lente del relé. Las neuronas redondas sugieren que estaban cerca del plano focal. La forma neuronal es diferente en todo el cerebro, aquí se muestra CA1 ventral como ejemplo.
12. Si ninguna neurona individual muestra cambios en la fluorescencia en función del tiempo, vuelva a sellar la base con caucho de silicona. No se observa fluorescencia porque el período de incubación también depende de la propiedad del virus^23,24. Realice los pasos 3.1-3.12 después de una semana adicional. (Esto es opcional).
13. Sostenga el miniscopio en la posición óptima y mueva el brazo estereotáxico con una arcilla adhesiva reutilizable hacia el miniscopio (Figura 5B2). Adhiera el miniscopio al brazo estereotáxico con arcilla adhesiva reutilizable.
14. Ajuste ligeramente los brazos x, y y z para buscar la mejor vista (video complementario S2). A continuación, ajuste el ángulo entre la superficie de la lente del objetivo y la lente del relé girando la barra del oído, la barra de dientes o la arcilla adhesiva reutilizable en el eje z. La expresión viral y la implantación del cristalino son exitosas cuando al menos una célula muestra transitorios de fluorescencia (Figura 6A; Video suplementario S2) durante el basal (que también depende del área del cerebro, como el CA1).
    NOTA: Si el monitor sólo muestra glóbulos blancos pero no transitorios, hay otra causa (consulte la Figura 6B,C, Videos suplementarios S4,S5, la sección Resultados y la sección de solución de problemas).
15. Cementar la placa base (Figura 5B2) con el cemento dental.
16. Controle la región de interés durante la cementación para asegurarse de que la posición óptima no cambie.
17. Utilice la menor cantidad posible de cemento mientras pega firmemente la placa base a la base de cemento dental (Figura 5B2). Aplique una segunda y tercera capa de cemento alrededor de la placa base, pero tenga cuidado de no afectar la lente GRIN.
    NOTA: La aplicación de cemento a la placa base es más fácil en este paso ya que la base de la placa base se formó durante el procedimiento de chapado ficticio.
18. Separe cuidadosamente el miniscopio de la placa base cuando el cemento esté curado. Luego, atornille una tapa protectora.
19. Mueva al animal a una jaula de recuperación. Observe al animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
20. Ratones domésticos individualmente. Asegúrese de que está comiendo, bebiendo y defecando normalmente todos los días. Espere 5 días para que el ratón se recupere completamente y luego verifique las imágenes de calcio.
    NOTA: Solo hay una pequeña cantidad de cemento dental que sostiene la placa base. Por lo tanto, si la placa base se ha desplazado considerablemente desde el procedimiento de recubrimiento base, retire el cemento dental con un taladro y realice el procedimiento de recubrimiento base nuevamente.
21. Anestesiar (mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (87 mg/kg)/xilazina (13 mg/kg)) y perfundir²⁵ al animal cuando se realicen todos los experimentos.

Resultados

Evaluación de la alteración del volumen de cemento dental
Dado que el volumen del cemento dental cambia durante el proceso de curado, puede afectar significativamente la calidad de la imagen, dado que la distancia de trabajo de una lente GRIN es de aproximadamente 50 a 350 μm ^4,8. Por lo tanto, se probaron dos cementos dentales disponibles comercialmente en este caso, Tempron y Tokuso, antes del procedimiento de implantación y recubrimient...

Discusión

El presente informe describe un protocolo experimental detallado para los investigadores que utilizan el sistema de miniscopio UCLA de dos lentes. Las herramientas diseñadas en nuestro protocolo son relativamente asequibles para cualquier laboratorio que desee probar imágenes de calcio in vivo . Algunos protocolos, como la inyección viral, la implantación de lentes, el recubrimiento base ficticio y el recubrimiento base, también podrían usarse para otras versiones del sistema de miniscopio para mejorar la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7-mm drill bit	#19008-07	Fine Science Tools; USA	for surgery
0.1–10 μl pipette tips	104-Q; QSP	Fisher Scientific; Singapore	for testing dental cement
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
27 G needle	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1.5*10^13	Addgene viral prep; MA, USA	for viral injection
Atropine sulfate		Astart; Hsinchu, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Baseplate	V3	http://miniscope.org	for dummy baseplating/baseplating
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA	Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Germany	for baseplating
Buprenorphine		INDIVIOR; UK	for surgery
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgesia
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwan	prevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		for baseplating
Dental cement set	Tempron	GC Corp; Tokyo, Japan	for testing dental cement
Dental cement set	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan	for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors	#51673	Stoelting Co; Illinois, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointment		Alcon; Geneva, Switzerland	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Ibuprofen		YungShin; Taiwan	analgesia
Isoflurane		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	for comparison with V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	for euthanasia
Normal saline			for surgery
Micro bulldog clamps	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Germany	for lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge	#88400	Hamilton; Bonaduz, Switzerland	for viral injection
Molding silicone rubber	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italy	for dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	for dummy baseplating/baseplating
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	for dummy baseplating
Portable Suction	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	for surgery
Relay GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	for dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws	1.00 mm diameter, total length 3.00 mm		for surgery
Stereo microscope	#SL720	Sage Vison; New Taipei City, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus	#51673	Stoelting; IL, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive	#3321	Loctite; Düsseldorf, Germany	for testing dental cement
V3 UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		for surgery/dummy baseplating/baseplating
Xylazine	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	for euthanasia
Xylocaine pump spray 10%		AstraZeneca; Södertälje, Sweden	for surgery