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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Describimos protocolos para medir el pH, los eventos oxidativos y la digestión de proteínas en macropinosomas individuales en células vivas. Se hace hincapié en la microscopía ratiométrica de fluoróforos duales y las ventajas que ofrece sobre las técnicas basadas en la población.

Resumen

En los últimos años, el campo de la macropinocitosis ha crecido rápidamente. La macropinocitosis ha surgido como un mecanismo central por el cual las células inmunes innatas mantienen la homeostasis y la inmunidad del organismo. Simultáneamente, y en contraste con su papel homeostático, también puede conducir a diversas patologías, incluyendo el cáncer y las infecciones virales. A diferencia de otros modos de endocitosis, las herramientas desarrolladas para estudiar la maduración de los macropinosomas permanecen subdesarrolladas. Aquí el protocolo describe herramientas recientemente desarrolladas para estudiar el entorno redox dentro de la luz de los macropinosomas tempranos y en maduración. Se describen metodologías para el uso de la microscopía de fluorescencia ratiométrica en la evaluación del pH, la producción de especies reactivas de oxígeno y la capacidad degradativa dentro de la luz de macropinosomas individuales en células vivas. Las mediciones de orgánulos individuales ofrecen la ventaja de revelar la heterogeneidad espaciotemporal, que a menudo se pierde con los enfoques basados en la población. Se hace hincapié en los principios básicos de la microscopía fluorófora dual, incluida la selección de sondas, la instrumentación, la calibración y los métodos de una sola célula frente a los basados en la población.

Introducción

La macropinocitosis se refiere a la absorción de grandes cantidades de líquido extracelular en orgánulos citoplasmáticos unidos a la membrana llamados macropinosomas1,2. Es un proceso altamente conservado realizado por organismos unicelulares de vida libre, como la ameba Dictyostelium spp. 3, así como antozoos4 y metazoos2. En la mayoría de las células, la macropinocitosis es un evento inducido. La ligadura de los receptores de la superficie celular induce la protrusión de extensiones de membrana plasmática impulsadas por actina conocidas como volantes. Una fracción de esos volantes, por algún mecanismo poco conocido, se sellan en sus puntas distales para formar macropinosomas (aunque más allá del alcance de este documento de métodos, para revisiones detalladas sobre la mecánica de la macropinocitosis, consulte las referencias1,2,5,6,7). El estímulo extracelular que induce la macropinocitosis es más a menudo un factor de crecimiento soluble5,8. En consecuencia, el evento macropinocítico permite la ingestión de un bolo de material extracelular del cual la célula puede derivar metabolitos útiles para facilitar el crecimiento. Desafortunadamente, esta vía para la entrega de nutrientes también puede impulsar la patología. Ciertas células cancerosas albergan mutaciones que resultan en macropinocitosis continua o constitutiva. La entrega continua de nutrientes facilita la proliferación incontrolada de células cancerosas y se ha relacionado con tumores particularmente agresivos9,10,11,12,13. Del mismo modo, los virus pueden inducir macropinocitosis para obtener acceso a las células huésped, impulsando así la patología viral14.

La macropinocitosis también funciona en el mantenimiento de la inmunidad a los patógenos. Ciertas células inmunes innatas como los macrófagos y las células dendríticas participan en el muestreo constitutivo y agresivo de líquido extracelular a través de la macropinocitosis6,15,16. Este modo de macropinocitosis es increíblemente activo, y una sola célula dendrítica puede congestionarse con un volumen de líquido extracelular equivalente a su propio peso cada hora17. A pesar de este muestreo constitutivo, los macrófagos y las células dendríticas no se replican incontrolablemente como lo hacen las células tumorales, sino que parecen procesar el material extracelular de tal manera que se puede extraer información para informar sobre la presencia, o incluso ausencia, de amenazas potenciales. La información se extrae como i) patrones moleculares asociados a patógenos que pueden ser leídos por receptores de reconocimiento de patógenos intracelulares y ii) tramos cortos de aminoácidos que pueden cargarse en las principales moléculas de histocompatibilidad para su detección por células del sistema inmune adaptativo16,18,19. En la actualidad, no está claro si los patógenos subvierten esta vía para el procesamiento de la información por parte de las células inmunes.

A pesar de estos roles bien definidos y críticos para la macropinocitosis tanto en el mantenimiento de la inmunidad como en la homeostasis y en contraste con otros modos de endocitosis más comúnmente estudiados, se conoce poco del funcionamiento interno (luminal) de los macropinosomas. El desarrollo de protocolos y herramientas estandarizados para estudiar la bioquímica luminal de los macropinosomas no solo nos ayudará a comprender mejor su biología única, sino que también proporcionará información que se puede aprovechar para nuevas estrategias terapéuticas, incluida la administración de fármacos20. Este manuscrito del método se centrará en herramientas recientemente desarrolladas para diseccionar, a nivel de orgánulo único, varios aspectos de la bioquímica luminal de los macropinosomas.

Los fluoróforos se pueden utilizar para medir bioquímicas específicas de orgánulos si i) se dividen preferentemente en el compartimento de interés y/o ii) sufren cambios espectrales en respuesta al parámetro de interés. Por ejemplo, en el caso del pH, las bases débiles fluorescentes, como la naranja acridina, la violeta cresil y los colorantes LysoTracker se acumulan preferentemente en orgánulos ácidos. Por lo tanto, su intensidad relativa es una indicación aproximada de que el orgánulo etiquetado es ácido. Otros fluoróforos sensibles al pH, como la fluoresceína, pHrodo y cypHer5e, sufren cambios espectrales al unirse a protones(Figura 1A-C). Por lo tanto, los cambios en la emisión de fluorescencia de los fluoróforos sensibles al pH pueden proporcionar una aproximación útil del pH. El uso de fluoróforos individuales, sin embargo, presenta una serie de desventajas. Por ejemplo, los cambios en el plano focal, el fotobleaching y los cambios en el volumen de orgánulos individuales, una ocurrencia común en los macropinosomas21,pueden inducir cambios en la intensidad de fluorescencia de fluoróforos individuales, y esto no se puede corregir fácilmente para22. Las evaluaciones de longitud de onda única, aunque útiles para visualizar compartimentos ácidos, son, por lo tanto, puramente cualitativas.

Un enfoque más cuantitativo es apuntar al fluoróforo sensible a los parámetros junto con un fluoróforo de referencia al orgánulo de interés. El fluoróforo de referencia es idealmente insensible a los cambios bioquímicos dentro del orgánulo (Figura 1D-F) y, por lo tanto, se puede utilizar para corregir cambios en el plano focal, el volumen organelar y, hasta cierto punto, el fotobleaching23. Utilizando este enfoque, denominado fluorescencia ratiométrica de fluoróforo dual, se puede lograr la corrección generando una relación entre la emisión de fluorescencia del fluoróforo sensible a los parámetros y el fluoróforo de referencia.

Aquí, el protocolo utilizará el principio de imágenes ratiométricas de fluoróforo dual para medir el pH, los eventos oxidativos y la degradación de proteínas dentro de los macropinosomas. En cada caso, se seleccionará un fluoróforo que sea sensible al parámetro de interés y un fluoróforo de referencia. Para dirigir los fluoróforos específicamente a los macropinosomas, se acoplarán covalentemente al dextrano de 70 kDa, que se incorpora preferentemente a los macropinosomas24. Todos los ensayos se realizarán en células Raw264.7, pero se pueden adaptar a otros tipos de células. Siempre que sea posible, las relaciones de fluorescencia se calibrarán contra una curva de referencia para obtener valores absolutos. Es importante destacar que todas las mediciones se realizarán en células vivas para la evaluación dinámica y cuantitativa del entorno luminal de los macropinosomas.

Al seleccionar fluoróforos sensibles al pH, se deben sopesar una serie de consideraciones. El primero es el pKa del fluoróforo, que indica el rango de valores de pH en el que la sonda será más sensible. Si se asume que poco después de la formación, el pH del macropinosoma será cercano al del medio extracelular (~pH 7.2) y que se acidificará progresivamente a través de interacciones con endosomas tardíos y lisosomas (~pH 5.0), entonces se debe seleccionar una sonda con un pKa que sea sensible dentro de ese rango (Figura 2C). La fluoresceína fluorófora, que tiene un pKa de 6.4, es óptimamente sensible dentro de ese rango. Se ha utilizado ampliamente para medir otros orgánulos similares, como los fagosomas, y será el fluoróforo de elección en este manuscrito22,25. Como fluoróforo de referencia, se utilizará tetrametilrodiamina, que es insensible al pH(Figura 1E). Otros fluoróforos, como pHrodo y cypHer5e pueden ser sustituidos por fluoresceína donde las propiedades espectrales de la fluoresceína coinciden con otras variables experimentales. Algunos fluoróforos de referencia sugeridos para pHrodo y cypHer5e se muestran en la Figura 1.

Una segunda consideración es el método por el cual los dos fluoróforos se dirigirán específicamente a los macropinosomas. El dextrano del tamaño 70 kDa, que tiene un radio hidrodinámico de aproximadamente 7 nm, no se adhiere específicamente a las células y se incorpora a los macropinosomas, pero no a los hoyos recubiertos de clatrina o caveolas, y por lo tanto marca los macropinosomas(Figura 2A y Figura 3A,B)16,24,26. En este protocolo, se utilizarán dextrano de 70 kDa dextrano y tetrametilrodamina (TMR) de 70 kDa etiquetados con fluoresceína como sondas sensibles al pH y de referencia, respectivamente.

En las células inmunes innatas, la macropinocitosis y la fagocitosis representan las dos vías principales para la internalización del material exógeno para su procesamiento y posterior presentación a las células de la respuesta inmune adaptativa27. El control cuidadoso y coordinado de la química redox de la luz de los fagosomas y macropinosomas es fundamental para el procesamiento específico del contexto del material exógeno. Quizás el regulador más estudiado de los eventos oxidativos en los fagosomas es la NADPH oxidasa, un gran complejo multi-subunidad que produce grandes cantidades de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la luz de los fagosomas28. De hecho, su actividad es fundamental para el procesamiento apropiado de antígenos dentro de los fagosomas29,30. Sin embargo, la actividad de la NADPH oxidasa en las membranas macropinosómicas no se ha explorado.

En este protocolo, el éster de succinimidil H2DCFDA se utiliza para medir eventos oxidativos dentro del macropinosoma. Esta es una forma modificada de fluoresceína (2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato), que es mínimamente fluorescente en su forma reducida. Tras la oxidación, su emisión de fluorescencia aumenta significativamente. Sin embargo, vale la pena señalar una advertencia significativa de H2DCFDA: ya que se basa en la fluoresceína fluoróforo, su fluorescencia también se apaga en compartimentos ácidos y se debe tener cuidado para controlar esta variable al diseñar experimentos28. Similar al enfoque para medir el pH, el éster de succinimidil H2DCFDA se unirá covalentemente al dextrano de 70 kDa y el dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR se utilizará como fluoróforo de referencia(Figura 3A).

La ovoalbúmina fluorescente se utilizará para medir la degradación de proteínas dentro de los macropinosomas. La ovoalbúmina utilizada aquí está densamente etiquetada con un tinte FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indáceno (BODIPY) que se autoexpresa. Tras la digestión, se liberan péptidos fuertemente fluorescentes etiquetados con colorantes. Como la ovoalbúmina no se puede conjugar fácilmente con 70 kDa dextrano, las células con dextrano de 70 kDa y ovoalbúmina en fase fluida se coincuban. La señal TMR se utilizará para generar una máscara de macropinosoma durante el análisis posterior a la obtención de imágenes, y la señal liberada de la ovoalbúmina digerida se medirá dentro de la máscara(Figura 3B).

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Protocolo

1. Preparación de las células

  1. Cultive células Raw264.7 a 37 °C y 5% de CO2 a 70% de confluencia en RPMI suplementado con 10% de suero inactivado por calor.
  2. Un día antes del ensayo, semuela células Raw264.7 a una densidad de 5 x 104 células por pozo en una placa de 96 pozos. Asegúrese de que cada pozo contenga 100 μL de medio de crecimiento. Asegúrese de que la placa de 96 pozos tenga lados negros y un fondo de vidrio para obtener imágenes.
    NOTA: Aquí, se utilizaron placas de 96 pozos para la obtención de imágenes. Las placas de 96 pozos permiten el uso de cantidades más pequeñas de células y reactivos en relación con las cámaras de imágenes más grandes. Sin embargo, se puede utilizar cualquier cámara diseñada para obtener imágenes de células vivas, y los reactivos se pueden ampliar en consecuencia.
  3. El día del ensayo, verifique si los pozos son al menos 70% confluentes.

2. Medición del pH del macropinosoma

  1. Prepare las celdas como en la sección 1.
  2. Lavar todos los pozos con 100 μL de HBSS a 37 °C.
  3. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS que contengan 0,025 mg/ml de dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR y 0,025 mg/ml de dextrano de 70 kDa etiquetado con fluoresceína.
  4. Coloque las células en una incubadora a 37 °C durante 15 min.
  5. Retire las células de la incubadora y lave las células 6 veces con 100 μL de HBSS.
  6. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS a 37 °C.
  7. Coloque la placa en el microscopio con una etapa y una cámara calentadas.
  8. Ajuste los parámetros de excitación/emisión para cada fluoróforo según sea necesario.
    NOTA: Las condiciones ideales para la adquisición de imágenes variarán con los fluoróforos utilizados y las configuracións individuales del microscopio. Aquí, las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal de barrido láser Leica SP5. TMR se excedió con una línea láser 543 y la emisión se recolectó de 610 nm a 650 nm. La fluoresceína se excedió con una línea láser 488 y la emisión se recolectó de 500 nm a 550 nm. Se utilizó un objetivo de inmersión en aceite de 63x y se adquirió un volumen Z de 10 μm a intervalos de 0,5 μm.
  9. Adquirir una imagen de cada pozo, alternando entre fluoróforos entre cada pozo.
  10. Después de la primera adquisición, verifique si todos los pozos permanecieron enfocados en toda la placa.
  11. Adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de 1-15 minutos durante el tiempo deseado.

3. Calibración in situ del pH del macropinosoma

  1. Durante la adquisición de la imagen, prepare 1 L de solución rica en potasio (K+-rich) que contenga 140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2y 5 mM de glucosa. Complemente un volumen de 400 ml de la solución rica en K+con HEPES de 25 mM (de una solución madre de 1 M, pH 7.2) y un volumen separado de 400 ml con MES de 25 mM (de una solución madre de 0.5 M, pH 6.0).
  2. Ajuste una alícuota de 50 ml de la solución rica en K+almacenada en búfer con HEPES de 25 mM a pH 7.5 usando 10 M HCl o 10 M KOH según sea necesario.
  3. Ajuste tres alícuotas separadas de 50 ml de la solución rica en K+almacenadas en búfer con 25mM MES a pH 6.5, pH 5.5 y pH 5.0 usando 10 M HCl o 10 M KOH según sea necesario.
    NOTA: Un tampón de ácido acetato-acético puede ser preferible para soluciones de pH más bajo.
  4. Después de completar la adquisición de imágenes, retire el HBSS de la placa de 96 pozos que contiene las células y reemplácelo con la solución rica en K+que está a pH 7.5.
  5. Añadir nigericina a una concentración final de 10 μg/ml.
    NOTA: Nigericina es un ionóforo que intercambia K+ por H+. Al establecer la concentración K+ de la solución rica en K+a un valor que se aproxima a la concentración K+ del citosol, se puede garantizar que la nigericina sujetará el pH del macropinosoma al del citosol, que a su vez refleja el pH del tampón de calibración.
  6. Vuelva a colocar la placa en el microscopio y adquiera imágenes de cada pozo utilizando los mismos ajustes de adquisición que los anteriores.
  7. Repita los pasos 3.5 y 3.6 para cada búfer de calibración.

4. Análisis de datos para el pH del macropinosoma

  1. Usando el software FIJI, reste el fondo tanto del TMR como del canal de fluoresceína.
  2. Genere una máscara en el canal TMR. Para generar una máscara, convierta la imagen en una imagen binaria seleccionando Ajustar > umbral > Aplicar. A continuación, resalte la imagen binaria y seleccione Editar > Selección > Crear máscara.
  3. Aplíquelo tanto a las imágenes de TMR como a las de fluoresceína. Para ello, resalte la máscara y seleccione Editar > Selección > Crear selección. Haga clic en la imagen TMR y presione Mayús + E para aplicar la máscara al canal TMR. Del mismo modo, haga clic en la imagen de fluoresceína y presione Mayús + E para aplicar la máscara al canal OB.
  4. Registre la intensidad de TMR y fluoresceína para cada macropinosoma dentro de las máscaras.
  5. Repita los pasos 4.1-4.3 para cada punto de tiempo del curso de tiempo.
  6. Repita los pasos 4.1-4.3 para las imágenes capturadas en la calibración in situ.
  7. Divida la intensidad de la fluoresceína por la intensidad de TMR para generar la relación fluoresceína:TMR.
  8. Trazar el pH contra las relaciones fluoresceína:TMR para las imágenes de calibración.
  9. Ajuste una curva a los datos de calibración.
  10. Interpole los datos para cada punto de tiempo del curso de tiempo para obtener valores absolutos de pH.

5. Medición de eventos oxidativos dentro de macropinosomas

  1. Prepare las celdas como en la sección 1.
  2. Un día antes del ensayo, prepare el éster de succinimidil H2DCFDA etiquetado como 70 kDa dextrano resuspiendo 10 mg de 70 kDa dextrano-amino en 1 ml de solución de bicarbonato de sodio de 0,1 M (pH 8,3). Añadir 1 mg del éster de succinimidil H2DCFDA a la solución de dextrano-amino e incubar durante 1 h. Dializar el dextrano de 70 kDa etiquetado con H2DCFDA contra PBS. No lo almacene durante más de 1 día, ya que el dextrano de 70 kDa etiquetado con H2DCFDA se oxidará al almacenarlo.
  3. El día del ensayo, lavar todos los pozos con 100 μL de HBSS a 37 °C.
  4. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS que contengan 0,025 mg/ml de dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR y 0,025 mg/ml de dextrano de 70 kDa etiquetado con H2DCFDA.
  5. Coloque las células en una incubadora a 37 °C durante 15 min.
  6. Retire las células de la incubadora y lave las células 6 veces con 100 μL de HBSS.
  7. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS a 37 °C.
  8. Coloque la placa en el microscopio con una etapa y una cámara calentadas y ajuste los parámetros de excitación / emisión para cada fluoróforo según sea necesario.
    NOTA: Las condiciones ideales para la adquisición de imágenes variarán con los fluoróforos utilizados y las configuracións individuales del microscopio. Aquí las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal de barrido láser Leica SP5. TMR se excedió con una línea láser 543, y la emisión se recolectó de 610 nm a 650 nm. H2DCFDA se exció con una línea de láser 488 y la emisión se recolectó de 500 nm a 550 nm. Se utilizó un objetivo de inmersión en aceite de 63x y se adquirió un volumen Z de 10 μm a intervalos de 0,5 μm.
  9. Adquirir una imagen de cada pozo, alternando entre fluoróforos entre cada pozo.
  10. Después de la primera adquisición, verifique si todos los pozos permanecen enfocados en toda la placa.
  11. Adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de 1-15 minutos durante el tiempo deseado.

6. Análisis de datos para eventos oxidativos dentro de macropinosomas

  1. Usando el software FIJI, reste el fondo de los canales TMR y H2DCFDA.
  2. Genere una máscara en el canal TMR. Para generar una máscara, convierta la imagen en una imagen binaria seleccionando Ajustar > umbral > Aplicar. A continuación, resalte la imagen binaria y seleccione Editar > Selección > Crear máscara.
  3. Aplique la máscara a las imágenes TMR y H2DCFDA. Para ello, resalte la máscara y seleccione Editar > Selección > Crear selección. Haga clic en la imagen TMR y presione Mayús + E para aplicar la máscara al canal TMR. Del mismo modo, haga clic en la imagen H2DCFDA y presione Mayús + E para aplicar la máscara al canal H2DCFDA.
  4. Registre la intensidad de TMR y H2DCFDA para cada macropinosoma dentro de las máscaras.
  5. Repita los pasos 4.1-4.3 para cada punto de tiempo del curso de tiempo.
  6. Divida la intensidad de H2DCFDA por la intensidad de TMR para generar una relación H2DCFDA: TMR.
  7. Traza la relación H2DCFDA: TMR contra el tiempo.

7. Medición de la digestión de proteínas dentro de los macropinosomas

  1. Prepare las celdas como en la sección 1.
  2. El día del ensayo, lavar todos los pozos con 100 μL HBSS a 37 °C.
  3. Disolver la ovoalbúmina marcada con BODIPY a una concentración de 4 mg/ml en HBSS.
  4. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS que contengan 0,025 mg/ml de dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR y 0,2 mg/ml de ovoalbúmina etiquetada con BODIPY.
  5. Coloque las células en una incubadora a 37 °C durante 15 min.
  6. Retire las células de la incubadora y lave las células 6 veces con 100 μL de HBSS.
  7. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS a 37 °C.
  8. Coloque la placa en el microscopio con una etapa y una cámara calentadas y ajuste los parámetros de excitación / emisión para cada fluoróforo según sea necesario.
    NOTA: Las condiciones ideales para la adquisición de imágenes variarán con los fluoróforos utilizados y las configuracións individuales del microscopio. Aquí, las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal de barrido láser Leica SP5. TMR se excedió con una línea láser 543, y la emisión se recolectó de 610 nm a 650 nm. BODIPY se excedió con una línea láser 488, y la emisión se recolectó de 500 nm a 550 nm. Se utilizó un objetivo de inmersión en aceite de 63x y se adquirió un volumen Z de 10 μm a intervalos de 0,5 μm.
  9. Adquirir una imagen de cada pozo, alternando entre fluoróforos entre cada pozo.
  10. Después de la primera adquisición, verifique si todos los pozos permanecen enfocados en toda la placa.
  11. Adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de 1-15 minutos durante el tiempo deseado.

8. Análisis de datos para la digestión de proteínas dentro de macropinosomas

  1. Usando el software FIJI, reste el fondo de los canales TMR y BODIPY.
  2. Genere una máscara en el canal TMR y aplíquela tanto a las imágenes TMR como a BODIPY como en los pasos 6.2 y 6.3 anteriores(Figura 3B).
  3. Registre la intensidad de TMR y BODIPY para cada macropinosoma dentro de las máscaras.
  4. Repita los pasos 4.1-4.3 para cada punto de tiempo del curso de tiempo.
  5. Divida la intensidad bodipy por la intensidad TMR para generar la relación BODIPY:TMR.
  6. Traza la relación BODIPY:TMR contra el tiempo.

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Resultados

Al medir el pH del macropinosoma, hay un período de tiempo durante el cual no se puede medir la dinámica de la acidificación. Este período corresponde a la fase de carga de dextrano (cuadro gris en la Figura 2C y Figura 3C,D)y variará según el tipo de celda utilizada. La duración de la fase de carga variará con (i) la actividad macropinocítica de las células y (ii) la sensibilidad del instrumento utilizado. Se recomienda ajustar este p...

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Discusión

Aunque hay una serie de protocolos para mediciones de bajo y alto rendimiento de la captación macropinocítica en macrófagos, fibroblastos e incluso Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, muy pocos intentos se han hecho para medir la bioquímica luminal de estos compartimentos dinámicos. Esto probablemente se deba a una escasez de sondas que puedan dirig...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a la Universidad de Calgary por su apoyo. También nos gustaría agradecer al Dr. Robin Yates por el acceso a reactivos, equipos y discusiones útiles.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Black-walled 96 well platePerkinElmer6005430
CypHer5e, NHS esterCytivaPA15401
Dextran-amino 70 kDaInvitrogenD1862
DQ-ovalbuminInvitrogenD12053
FITC-dextran 70 kDaInvitrogenD1823
HBSSGibco14287
NigericinSigma AldrichN7143
OxyBurst Green-SEInvitrogenD2935
pHrodo Red, SEInvitrogenP36600
Raw264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI mediumGibco11875093
SP5 Confocal MicroscopeLeica-
TRITC-dextran 70 kDaInvitrogenD1819
u-DishIbidi81156

Referencias

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