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  • Protocolo
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  • Discusión
  • Divulgaciones
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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, el protocolo presenta la preparación de la solución de naringenina para la administración intraperitoneal in vivo . Naringenina se disuelve completamente en una mezcla de dimetilsulfóxido, Tween 80 y solución salina. Los efectos osteoporóticos antidiabéticos de la naringenina se evaluaron mediante pruebas de glucosa en sangre, tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

Resumen

La preparación de una solución compuesta (fitoquímica) es un paso pasado por alto pero crítico antes de su aplicación en estudios como la detección de fármacos. La solubilización completa del compuesto es necesaria para su uso seguro y resultados relativamente estables. Aquí, se demuestra como ejemplo un protocolo para preparar solución de naringenina y su administración intraperitoneal en un modelo diabético inducido por estreptozotocina (STZ) y dieta alta en grasas y estreptozotocina. Se utilizó una pequeña cantidad de naringenina (3,52-6,69 mg) para probar su solubilización en disolventes, incluyendo etanol, dimetilsulfóxido (DMSO) y DMSO más Tween 80 reconstituido en solución salina fisiológica (PS), respectivamente. La solubilización completa del compuesto se determina observando el color de la solución, la presencia de precipitados después de la centrifugación (2000 x g durante 30 s) o dejando reposar la solución durante 2 h a temperatura ambiente (RT). Después de obtener un compuesto estable/solución fitoquímica, la concentración/cantidad final del compuesto requerida para los estudios in vivo puede prepararse en una solución madre de disolvente solamente (sin PS), y luego diluirse/mezclarse con PS según se desee. Los efectos osteoporóticos antidiabéticos de naringenina en ratones (administración intraperitoneal a 20 mg/kg p.v., 2 mg/ml) se evaluaron midiendo la glucosa en sangre, la masa ósea (micro-CT) y la tasa de resorción ósea (tinción TRAP y ELISA). Los investigadores que buscan preparaciones detalladas de soluciones orgánicas / fitoquímicas se beneficiarán de esta técnica.

Introducción

Con el aumento de los estudios sobre el uso de compuestos fitoquímicos para la detección de fármacos, vale la pena prestar atención a los enfoques para preparar soluciones fitoquímicas para evaluar sus efectos óptimos. Muchos aspectos, como la metodología de disolución, la dosis y la concentración, deben considerarse al preparar el compuesto1.

La disolución a base de solvente es ampliamente utilizada para la preparación de compuestos orgánicos1. Los disolventes comúnmente utilizados incluyen agua, aceite, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, etanol, ácido fórmico, Tween, glicerina, etc2. Aunque una suspensión con sustancias no disueltas es aceptable cuando el compuesto se administra por sonda gástrica, un soluto completamente disuelto es crítico para la administración intravenosa. Dado que la solución de aceite, la suspensión y la emulsión pueden causar embolias capilares, se sugiere una solución acuosa para la preparación del compuesto, especialmente cuando se administran inyecciones intravenosas, intramusculares e intraperitoneales3.

El rango de dosis efectivas varía entre compuestos e incluso entre enfermedades tratadas con el mismo compuesto. Las determinaciones de la dosis efectiva y segura y de la concentración dependen de la literatura y de los experimentos preliminares4. Aquí, la preparación del compuesto naringenina se demuestra como ejemplo.

La naringenina (4,5,7-trihidroxiflavanona), un compuesto polifenólico, se ha estudiado en el tratamiento de enfermedades por sus actividades hepatoprotectoras5, antidiabéticas6, antiinflamatorias7 y antioxidantes8. Para aplicaciones in vivo, la administración oral de naringenina se utiliza comúnmente. Estudios previos informaron la preparación de una solución de naringenina en 0,5% -1% de carboximetilcelulosa, dosis de metilcelulosa al 0,5%, DMSO al 0,01% y solución salina fisiológica (PS) a 50-100 mg / kg, administrada por sonda oral 9,10,11,12. Además, otros estudios han reportado suplementar naringenina con comida al 3% (peso / peso) para la ingesta oral a una dosis de 3,6 g / kg / día13,14. Los estudios también han reportado el uso de etanol (0,5% v/v), PS y DMSO para disolver naringenina para inyección intraperitoneal a dosis de 10-50 mg/kg15,16,17,18. En un estudio de epilepsia del lóbulo temporal, los ratones recibieron una inyección de naringenina suspendida en carboximetilcelulosa al 0,25% disuelta en PS19. Aunque estos estudios informan el uso de diferentes disolventes para preparar soluciones de naringenina, no se han informado más detalles, como el estado de disolución y la respuesta animal.

Este protocolo introduce un procedimiento para preparar una solución de naringenina para su aplicación in vivo en la osteoporosis inducida por diabéticos. La preparación de la solución inyectable incluye la preparación de disolventes y compuestos, la estimación de la dosis, el proceso de disolución y la filtración. La dosis se determinó en base a la investigación bibliográfica y experimentos preliminares mediante el monitoreo de ratones después de administrar inyecciones todos los días durante 3 días y modificando la dosis de acuerdo con los comportamientos del ratón. La concentración final elegida (20 mg/kg p.v.) se administró por vía intraperitoneal 5 días a la semana durante 8 semanas en ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ)20,21. Los efectos de la naringenina en la osteoporosis diabética se evaluaron mediante pruebas de glucosa en sangre, micro-CT, tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

En general, se observó que la naringenina en un rango de concentración de 40-400 mg / ml no se disolvió completamente en etanol o DMSO o 5% (etanol o DMSO) más 95% PS (v / v). Sin embargo, la naringenina se disolvió completamente en una mezcla de 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 y 92,96% PS. El procedimiento detallado ayudará a los investigadores a preparar el compuesto como una solución de inyección para la aplicación in vivo .

Protocolo

Las investigaciones descritas se ajustaron a las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación y fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghai. Al realizar los experimentos, se requieren batas de laboratorio, guantes de nitrilo desechables y gafas para fines de seguridad.

1. Preparación de disolventes y estimación de naringenina necesaria para la aplicación in vivo

  1. Prepare los siguientes disolventes: Tween-80 (rango de concentración final: 0,5% -1%), DMSO, glicerina (rango de concentración final: 15% -20%), etanol (rango de concentración final: 12% para inyección intramuscular)22 y 0,9% PS.
  2. Calcule la cantidad de naringenina requerida en función de la dosis, el número de ratones y la frecuencia de inyección.
    1. Ordene 10 ratones (C57BL/6, macho, 5 semanas de edad, SPF) para administrar naringenina 5 días a la semana durante 8 semanas. Mantenga a los ratones en condiciones específicas libres de patógenos (SPF).
      NOTA: La dosis requerida para la inyección intraperitoneal es de 20 mg/kg p.v.23.
    2. Pesar 160 mg de naringenina según el siguiente cálculo: 20 mg/kg x 0,02 kg/ratón x 10 ratones x 5 días/semana x 8 semanas = 160 mg.
  3. Calcular la concentración de naringenina a inyectar in vivo.
    1. Prepare el volumen recomendado en función del peso corporal de los ratones. El volumen recomendado de naringenina aplicada a cada ratón es del 1% del peso corporal (0,3 ml). En este experimento, se utilizaron 0,2 ml por ratón.
    2. Calcule el volumen total: 0,2 ml por ratón x 10 ratones x 5 días/semana x 8 semanas = 80 ml.
    3. Calcular la concentración de Naringenina en stock: 160 mg/80 ml disolventes = 2 mg/ml.
    4. Calcule el volumen para cada día: 0,2 ml por ratón x 10 ratones = 2 ml.

2. Disolución

  1. Solución de etanol
    1. Para preparar una solución de naringenina a 2 mg/ml, pesar 3,52 mg de naringenina y añadirla a un tubo de 2,0 ml.
      NOTA: Para alcanzar una concentración de 2 mg/ml, el volumen total requerido será de 1760 μL (cálculo: 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/ml).
    2. Gire rápidamente hacia abajo (2000 x g durante 30 s) para que el polvo de naringenina se asiente en el fondo del tubo (Figura 1A).
    3. Añadir 8,8 μL de etanol al 100% al tubo para preparar una solución al 0,5% (v/v) con respecto al volumen total requerido2. La naringenina no se disuelve completamente (Figura 1B).
    4. Continúe agregando 79.2 μL de etanol al 100% al tubo para preparar una solución al 5% (v / v) con respecto al volumen total requerido (cálculo: (79.2 μL + 8.8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). La naringenina no se disuelve completamente (Figura 1B).
    5. Añadir 1672 μL de PS al 0,9% al tubo que contiene etanol al 5% como se describe en el paso 2.1.4. Esto producirá una emulsión (Figura 1D). Centrifugar (2000 x g durante 30 s) la solución para comprobar si la naringenina está completamente disuelta en la solución. Aparecen precipitados blancos de naringenina no disuelta en la solución (Figura 1E).
  2. Solución DMSO
    1. Para preparar la solución de naringenina a 2 mg/ml, pesar 3,95 mg de naringenina y añadir en un tubo de 2,0 ml.
      NOTA: Para alcanzar una concentración de 2 mg/ml, el volumen total requerido será de 1975 μL (cálculo: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/ml).
    2. Gire rápidamente hacia abajo (2000 x g durante 30 s) para que el polvo de naringenina se asiente en el fondo del tubo.
    3. Añadir 9,8 μL de DMSO al tubo para preparar una solución al 0,5% (v/v) (cálculo: 9,8 μL/1975 μL x 100% = 5%). La naringenina se disuelve completamente (Figura 2A).
    4. Añadir 88,2 μL de DMSO al tubo para preparar una solución al 5% (v/v) con respecto al volumen total requerido (cálculo: (88,2 μL + 9,8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). La naringenina se disuelve completamente (Figura 2B).
    5. Añadir 1877 μL de PS al 0,9% (v/v por ciento del 95%) a la solución preparada en el paso 2.2.4. Se produce una emulsión (Figura 1C). Centrifugar (2000 x g durante 30 s) la solución para comprobar si la naringenina está completamente disuelta en la solución. Precipitados blancos de naringenina no disuelta aparecen en la solución (Figura 1D).
  3. Solución Tween-80 y DMSO
    1. Para preparar la solución de naringenina a 2 mg/ml, pesar 6,69 mg de naringenina y añadir en un tubo de 5,0 ml.
      NOTA: Para alcanzar la concentración final de 2 mg/ml, el volumen total de solución requerido será de 3345 μL (cálculo: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/ml).
    2. Gire rápidamente hacia abajo (2000 x g durante 30 s) para que el polvo de naringenina se asiente en el fondo del tubo.
    3. Añadir 117,7 μL de DMSO para preparar una solución al 3,5% (v/v) con respecto al volumen total requerido (cálculo: 117,7 μL /3345 μL x 100% = 3,5%). La naringenina se disuelve completamente (Figura 3A)
    4. Añadir 117,7 μL de Tween 80 a la solución preparada en la etapa 2.3.3 para alcanzar el 3,5% (v/v) de Tween 80 y el 3,5% (v/v) de DMSO. Observe la disolución completa de la naringenina (Figura 3B)
    5. Añadir lentamente la solución preparada en el paso 2.3.4 a un tubo de 5,0 ml que contenga 3109,6 μL de PS al 0,9% (v/v por ciento del 93%) y agitar bien para obtener una solución aparente de naringenina (Figura 3C).
    6. Deje que la solución preparada en el paso 2.3.5 permanezca a temperatura ambiente (RT) durante 2 h. La solución sigue siendo aparente sin precipitados visibles (Figura 3D).
  4. Preparación de solución de naringenina para administración in vivo
    1. De acuerdo con el paso 1.2.2, pesar 160 mg de naringenina (160 mg / 2 mg / ml = 80 ml).
    2. Agregue 2.8 ml de DMSO para alcanzar una solución al 3.5% (v / v) (cálculo: 2.8 ml / 80 ml x 100% = 3.5%)
    3. A continuación, añadir 2,8 ml de Tween 80 a la solución preparada en el paso 2.4.2 para alcanzar el 3,5% (v/v) de Tween 80 y el 3,5% (v/v) de DMSO.
    4. Alícuota la solución preparada en la etapa 2.4.3 en cuatro tubos, 1,4 ml por tubo [(2,8 ml + 2,8 ml) / 4 = 1,4 ml].
    5. Alícuota 18,6 mL de 0,9% PS a cinco tubos de 15 mL.
    6. Conservar la solución preparada en la etapa 2.4.3 (solución madre) y 2.4.5 a 4 °C (2,8 ml + 2,8 ml + 18,6 ml x 4 = 80 ml).
    7. Tomar 140 μL de la solución madre (paso 2.4.3) y mezclarla con 1860 μL de PS al 0,9% para preparar 2 ml de solución de naringenina para 1 día de administración.
    8. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 μm.

3. Administración de la solución Naringenin

  1. Manipulación y sujeción
    1. Rocíe la jaula y las manos con alcohol al 70-75% antes de abrir la tapa. Levante el ratón por la base de la cola y colóquelo sobre una superficie sólida para colocar su cola suavemente hacia atrás.
    2. Agarre el cuello detrás de las orejas con el pulgar izquierdo y el índice y coloque la cola entre el dedo meñique y el anular. Mantenga el ratón en posición supina con su extremo posterior ligeramente elevado.
  2. Inyección
    1. Agarre la piel posterior del ratón para que la piel abdominal esté tensa.
    2. Empuje la aguja (jeringa de insulina) en un ángulo de 10° entre la aguja y la superficie abdominal, en el cuadrante inferior derecho o izquierdo del abdomen para evitar golpear la vejiga, el hígado u otros órganos internos.
    3. Pase la aguja por vía subcutánea en dirección craneal durante 3-5 mm, y luego insértela en un ángulo de 45° en la cavidad abdominal.
    4. Cuando la aguja pase a través de la pared abdominal y la resistencia desaparezca, realice una aspiración para confirmar que no se retira material de reflujo. Luego, empuje lentamente la solución.
    5. Después de la inyección, saque lentamente la aguja y gírela ligeramente para evitar fugas. El volumen recomendado es de 50-100 μL/10 g.
    6. Deseche las sobras de Naringenin en un recipiente de riesgo biológico.

4. Prueba de glucosa en sangre

NOTA: Pruebe la glucosa en sangre 1 día antes de la inyección y 1 y 2 meses después de la inyección.

  1. Ayune los ratones durante 15 h antes de la prueba de glucosa en sangre. El agua puede seguir siendo proporcionada.
  2. Abra las tiras reactivas y marque la fecha. Una vez abiertas, use las tiras reactivas dentro de los 3 meses. Conservar las tiras reactivas a 2-30 °C. Cierre herméticamente la tapa después de retirar la tira para evitar la formación de humedad.
  3. Coloque al animal en la cámara de inducción. Encienda el vaporizador a un nivel de inducción del 4% para el isoflurano y 4 L/min para el oxígeno. Después de que el animal esté completamente anestesiado, mantener el anestésico con el cono de la nariz y la administración del anestésico a un nivel de 1.5% para isoflurano y 0.4 L / min para oxígeno.
  4. Limpie la cola con bolas de algodón / hisopos empapados en alcohol al 70% -75%.
  5. Comenzando desde el punto más bajo de la cola, haga una pequeña punción en la vena lateral de la cola con un pinchazo de aguja 25G y exprima una gota de sangre.
  6. Limpie la gota de sangre con un pañuelo de papel.
  7. Exprima otra gota de sangre y recójala en el borde de una tira reactiva.
  8. Lea y registre el resultado que se muestra en el medidor de glucosa.
  9. Para detener el sangrado, pellizque la cola del ratón con una gasa estéril y limpie el área con alcohol al 75%.
  10. Se pueden obtener muestras adicionales mediante una técnica similar que sube cranealmente por la cola.

5. Tinción TRAP

  1. Preparación de diapositivas
    1. Realice pruebas de glucosa en sangre en ayunas en los ratones una vez a la semana. Cuando los niveles de glucosa en sangre están ≥ 11.1 mmol / L (indicativo de ratones exitosos con diabetes tipo II modelo 24), eutanasia a los ratones usando CO2, seguido de disclocación cervical, y recolecte el Lumbar 4 th-6th (L4-L6) (no se realiza eutanasia mientras se realiza la prueba de glucosa en sangre en ayunas).
    2. Fijar las muestras L4-L6 con paraformaldehído al 4% durante 24 h (asegúrese de que el volumen de paraformaldehído sea >20 veces el volumen del tejido), y luego lavar durante 2 h en flujo continuo de agua del grifo.
    3. Para descalcificar las muestras, sumérjalas en una solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 10% durante 2 semanas en RT en condición estática hasta que las muestras se ablanden. Asegúrese de que el volumen de la solución descalcificante sea 20-30 veces el volumen del tejido / muestra. Cambie la solución EDTA cada dos días.
    4. Deshidratar la muestra con un deshidratador.
      1. Coloque las muestras en casetes de incrustación de procesamiento de tejidos. Numere el casete con un lápiz.
      2. Ajuste el programa de deshidratación de la siguiente manera: alcohol al 75% durante 2 h, alcohol al 85% durante 1 h, alcohol al 95% durante 1 h, alcohol al 95% durante 2 h, etanol anhidro (I) durante 2 h, etanol anhidro (II) durante 2 h, etanol anhidro (III) durante 2 h, xileno (I) durante 1 h, xileno (II) durante 1 h, xileno (III) durante 1 h, cera de parafina (I) durante 2 h, y cera de parafina (II) durante 2 h, a RT.
    5. Incrustar las muestras en cera de parafina.
      1. Añadir cera de parafina a la bandeja de cassette de la estación de incorporación de parafina y calentar a 60 °C. Sumerja los ejemplares deshidratados durante al menos 2 h.
      2. Coloque el cassette de pañuelos de papel en la bandeja de cassette y precaliente.
      3. Añadir cera de parafina al depósito de parafina y calentar a 60 °C.
      4. Después de 2 h, lleve tanto el casete de tejido como las muestras al área de trabajo. Vierta la cera de parafina precalentada del depósito de parafina en el casete de tejido. Coloque la muestra en la cera de parafina, asegúrese de que la cera de parafina cubra completamente el tejido y luego mueva inmediatamente el casete a una estación de formación de hielo.
      5. Use un micrótomo para cortar las muestras incrustadas en parafina en secciones de 5-6 μm. Desplegar las secciones en agua caliente a 40 °C durante menos de 10 s. Recoja las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos APS (amino silano). Secar los portaobjetos a RT durante 1 h y, a continuación, trasladar los portaobjetos a un horno a 60 °C durante la noche.
  2. Preparación del reactivo TRAP
    1. Preparar la solución básica de incubación madre: Disolver 9,2 g de acetato de sodio anhidro, 11,4 g de ácido L-(+) tartárico y 2,8 ml de ácido glacial en 1000 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 4.7-5.0 y guárdelo en RT hasta por 6 meses.
    2. Preparar solución de éter naftol: Disolver 0,1 g de fosfato as-BI de naftal en 5 ml de éter monoetílico de etilenglicol. Conservar a 4 °C durante un máximo de 5 semanas.
    3. Preparar solución de nitrito de sodio: Disuelva 1 g de nitrito de sodio en 25 ml de agua destilada. Conservar a 4 °C.
    4. Prepare el colorante de pararosanilina: Agregue 1 g de base de pararosanilina a 20 ml de HCl 2N (83 ml de HCl en 417 ml de agua). Use una placa de agitación para disolver la base y filtrarla antes de usarla.
  3. Tinción TRAP
    1. Llenar dos frascos de Coplin con 50 ml de solución básica de incubación y colocar en un horno a 37 °C durante 2 h.
    2. Tome un frasco de Coplin y agregue 0.5 ml de solución de éter de natol.
    3. Colocar los portaobjetos en el frasco de Coplin e incubar a 37 °C durante 1 h.
      NOTA: Prepare al menos tres diapositivas para cada grupo.
    4. Unos minutos antes de que termine el tiempo de incubación, agregue 1 ml de solución de nitrito de sodio y 1 ml de colorante de pararosanilina. Mezclar suavemente durante 30 s y dejar actuar durante 2 min.
    5. Añadir la solución preparada en el paso 5.2.2 al otro frasco de Coplin precalentado que contiene la solución madre básica. Mezclar bien la solución e introducir los portaobjetos del frasco de Coplin en el paso 5.3.3.
    6. Incubar durante 15-20 min en RT.
    7. Enjuague las rodajas en otro frasco de Coplin con 200 ml de PBS durante 5 minutos.
    8. Contra-manchar las rodajas con hematoxilina 100% durante 30 s en un frasco de Coplin.
    9. Deshidrate las rodajas con 85%, 95% y 100% de alcohol (200 ml) durante 2 minutos cada una y trátelas en xileno (200 ml) durante 2 minutos durante 3x. Use frascos de Coplin para realizar cada paso.
    10. Asegure la sección en el vidrio de la cubierta con un cubreobjetos con resina. Asegúrese de evitar la captura de burbujas de aire.

6. ELISA

  1. Preparación de muestras
    1. Retire los tejidos blandos del fémur y la tibia del ratón. Limpie los huesos con una gasa.
    2. Colocar las muestras óseas en un tubo de microcentrífuga de 1 ml y almacenar los tubos de muestra a -80 °C.
      NOTA: Las muestras también se pueden almacenar en un tanque de nitrógeno líquido por no más de 6 meses.
    3. Pesar la muestra de hueso. Diluir con 0.9% PS en una proporción de 1:10. Por ejemplo, diluir 0,1 g de hueso con 1 ml de PS.
    4. Añadir perlas de zirconia de 3 mm en el tubo y moler las muestras 3x a 70 Hz durante 30 s con 20 s de descanso en el medio.
    5. Centrifugar las muestras a 4 °C y 12.000 x g durante 5 min. Recoge el sobrenadante.
  2. Kit de ensayo ELISA
    NOTA: Realice ELISA de acuerdo con el protocolo de ensayo especificado por el fabricante.
    1. Agregue 100 μL de cada dilución de pocillos estándar, en blanco y de muestra en los pocillos apropiados. Incubar durante 90 min a 37 °C.
    2. Decantar el líquido de cada pocillo y añadir 100 μL de solución de trabajo de anticuerpos de detección biotinilados. Incubar durante 1 h a 37 °C.
    3. Decantar la solución, añadir 350 μL de tampón de lavado a cada pocillo. Remojar durante 1 min, repetir 3x.
    4. Agregue 100 μL de solución de trabajo conjugada HRP a cada pocillo. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    5. Decantar la solución. Repita el proceso de lavado 5 veces como se describe en el paso 6.2.3.
    6. Añadir 90 μL del reactivo de sustrato. Incubar durante 15 min a 37 °C protegido de la luz.
    7. Añadir 50 μL de la solución de parada.
  3. Utilice un lector de placas para registrar la absorbancia de cada pocillo a 450 nm.
  4. Generación de curvas estándar
    1. Trazar los respectivos valores medios de absorbancia contra las concentraciones de proteínas diluidas en serie.
    2. Une los puntos para crear la curva de mejor ajuste. Utilice cualquier aplicación informática apropiada (hoja de cálculo) para generar la ecuación de curva estándar.
  5. Sustituya el valor de absorbancia de cada muestra en la ecuación de curva estándar para obtener la concentración de la muestra respectiva.

Resultados

Se encontró que el peso corporal de los ratones diabéticos alimentados con dieta alta en grasas e inducidos por STZ disminuyó en comparación con el de los grupos de control de 0 a 8 semanas después del tratamiento con STZ. La pérdida de peso de los ratones tratados con naringenina fue significativa en comparación con los ratones no tratados (grupo STZ) en la semana 4. Los grupos control y STZ fueron administrados con el mismo volumen de PS (Tabla 1). El nivel de glucosa en sangre en ratones diabé...

Discusión

La preparación de la solución fitoquímica es la base para su aplicación in vivo. En este protocolo, la preparación de la solución de naringenina se demostró mediante el uso de diferentes disolventes, como etanol, DMSO, Tween 80 y PS al 0,9%. La solución en estado completamente disuelto debe controlarse aún más permitiendo que permanezca a temperatura ambiente durante algunas horas prolongadas y luego filtrada antes de usarse in vivo.

La determinación del disolvente...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81973607 y 81573992).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL  microtubesCorning Science (Wujiang) Co.23218392Holding liquid
Automatic DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA ASP 300SDehydrate samples
Blood glucose test stripsJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.4130392
CentrifugeMIULABMinute centrifugeCentrifugal solution
DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA  ASP300SDehydration
DMSOSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E918BA0041Co-Solvent
ELISA assay kitElabscience Biotechnology Co.,LtdMouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c
Mouse  CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c
Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c
Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c
Ethanol absoluteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218Co-Solvent
Ethylene glycol monoethyl etherSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.A501118-0500TRAP staining
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009617Decalcification
FilterMerck Millpore LTD.Millex-GP, 0.22 µmfilter solution
Glacial acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218TRAP staining
Glucose meterJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.One Touch Ultra VueSerial number:COJJG8GW
GrinderShanghaijingxin Experimental TechnologyTissuelyser-24
HematoxylinNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteD005TRAP staining
Insulin syringeShanghai Kantaray Medical Devices Co.0.33 mm x 13 mm, RW LBIntraperitoneal injection
L-(+) tartaric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd100220008TRAP staining
MicroscopeOLYMPUSsz61Observation
MicrotomeLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA RM 2135Section
Mini centrifugeHangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. Mini-6KCCentrifuge
Naphthol AS-BI phosphateSIGMA-ALDRICHBCBS3419TRAP staining
NaringeninJiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd102764Solute
Paraffin Embedding stationLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA  EG 1150 H, LEICA  EG 1150 CEmbed  samples
Pararosaniline baseBBI Life SciencesE112BA0045TRAP staining
Pipetteseppendorf2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL  transferre Liquid
Plate readerBioTek Instruments USA, Inc.BioTek CYTATION 3 imaging readerELISA
ResinShanghai Yyang Instrument Co., Ltd.Neutral balsamTRAP staining
saline (0.9 PS)Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,LtdA6E1323Solvent
Sodium acetate anhydrousSinopharm Chemical ReagentCo., LtdMerck-1.06268.0250 | 250gTRAP staining
Sodium nitriteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10020018TRAP staining
Tween-80Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E819BA0006Emulsifier
Zirconia beadsShanghaijingxin Experimental Technology11079125z 454gGrinding

Referencias

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