Definición de las funciones genéticas en la tumorigénesis mediante la ablación ex vivo de alelos floxados en células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para realizar knockouts de genes que son embrionarios letales in vivo en tumores derivados de modelos de ratón genéticamente modificados y luego evaluamos el efecto que el knockout tiene sobre el crecimiento tumoral, la proliferación, la supervivencia, la migración, la invasión y el transcriptoma in vitro e in vivo.

Resumen

El desarrollo de nuevos fármacos que se dirigen con precisión a proteínas clave en los cánceres humanos está alterando fundamentalmente la terapéutica del cáncer. Sin embargo, antes de que estos medicamentos puedan ser utilizados, sus proteínas diana deben ser validadas como dianas terapéuticas en tipos específicos de cáncer. Esta validación a menudo se realiza eliminando el gen que codifica el objetivo terapéutico candidato en un modelo de cáncer de ratón genéticamente modificado (GEM) y determinando qué efecto tiene esto en el crecimiento del tumor. Desafortunadamente, los problemas técnicos como la letalidad embrionaria en los knockouts convencionales y el mosaicismo en los knockouts condicionales a menudo limitan este enfoque. Para superar estas limitaciones, se desarrolló un enfoque para ablacionar un gen letal embrionario floxed de interés en cultivos a corto plazo de tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST) generados en un modelo GEM.

Este artículo describe cómo establecer un modelo de ratón con el genotipo apropiado, derivar cultivos tumorales a corto plazo de estos animales y luego extirpar el gen letal embrionario floxed utilizando un vector adenoviral que expresa Cre recombinasa y proteína fluorescente verde mejorada (eGFP). A continuación, se detalla la purificación de las células transducidas con adenovirus mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la cuantificación de los efectos que la ablación génica ejerce sobre la proliferación celular, la viabilidad, el transcriptoma y el crecimiento del aloinjerto ortotópico. Estas metodologías proporcionan un enfoque eficaz y generalizable para identificar y validar dianas terapéuticas in vitro e in vivo. Estos enfoques también proporcionan una fuente renovable de células derivadas de tumores de bajo paso con artefactos de crecimiento in vitro reducidos. Esto permite estudiar el papel biológico del gen objetivo en diversos procesos biológicos como la migración, la invasión, la metástasis y la comunicación intercelular mediada por el secretoma.

Introducción

Antes de las últimas dos décadas, el tratamiento de los cánceres humanos se basaba en gran medida en la radioterapia y los agentes quimioterapéuticos que se dirigían ampliamente a las poblaciones celulares que proliferaban rápidamente al dañar el ADN o inhibir la síntesis de ADN. Aunque estos enfoques inhibieron el crecimiento de células cancerosas, también tuvieron efectos secundarios perjudiciales en los tipos de células normales que proliferan rápidamente, como las células epiteliales intestinales y las células del folículo piloso. Más recientemente, la terapia contra el cáncer ha comenzado a utilizar agentes quimioterapéuticos que se dirigen con precisión a las proteínas dentro de las vías de señalización que son de importancia crítica para el crecimiento de la neoplasia de un paciente individual. Este enfoque, comúnmente conocido como "Medicina de Precisión", ha llevado al desarrollo de un repertorio cada vez mayor de anticuerpos monoclonales y pequeños inhibidores moleculares. Estos agentes inhiben eficazmente la proliferación y supervivencia de las células tumorales, al tiempo que evitan los efectos secundarios nocivos en los tipos de células normales observados con los agentes quimioterapéuticos convencionales y la radioterapia. Los anticuerpos monoclonales utilizados para el tratamiento de los cánceres humanos se dirigen con mayor frecuencia a las moléculas de la superficie celular, como los receptores del factor de crecimiento¹ (por ejemplo, la gran familia de tirosina quinasas del receptor que abarca la membrana) y los moduladores de la respuesta inmune² (por ejemplo, proteína de muerte celular programada 1, ligando de muerte programada 1). Los inhibidores moleculares pequeños pueden inhibir las proteínas de la superficie celular o las proteínas de señalización que se encuentran intracelularmente³. Sin embargo, para emplear eficazmente estos nuevos agentes terapéuticos, se debe establecer que un cáncer en particular depende de la molécula a la que se dirige un agente terapéutico candidato.

Aunque estos nuevos agentes terapéuticos tienen efectos más focalizados, muchos de ellos aún inhiben la acción de más de una proteína. Además, a menudo se dispone de múltiples agentes con eficacia y especificidad variables para atacar una proteína específica. En consecuencia, durante las investigaciones preclínicas, es aconsejable utilizar enfoques adicionales como la ablación genética para validar una proteína candidata como diana terapéutica. Un enfoque especialmente útil para validar una proteína como objetivo terapéutico es extirpar el gen que codifica la proteína candidata en un modelo animal genéticamente modificado que desarrolla el tipo específico de cáncer de interés. Este enfoque puede ser relativamente sencillo si los ratones con una mutación nula (ya sea una mutación natural, una mutación nula genéticamente modificada [un "knockout"] o una mutación nula introducida por una trampa genética) están disponibles, y los ratones son viables en la edad adulta. Desafortunadamente, los ratones con una mutación nula que cumplen con estos criterios a menudo no están disponibles, generalmente porque la mutación nula resulta en la muerte embrionariamente o en los primeros días de vida postnatal. En esta circunstancia, los ratones propensos a desarrollar el tipo de interés tumoral pueden cruzarse a ratones en los que los segmentos clave del gen de interés están flanqueados por sitios loxP ("floxed"), lo que permite que el gen se ablase mediante la introducción de un transgén que expresa Cre recombinasa en las células tumorales (un knockout condicional). Este enfoque proporciona varias ventajas. En primer lugar, si se dispone de un controlador de Cre que se expresa en el tumor pero no en el tipo de célula que condujo a la muerte en los knockouts convencionales, este enfoque puede validar potencialmente el objetivo terapéutico candidato. En segundo lugar, la ablación del gen que codifica la proteína candidata en las células tumorales, pero no en otros elementos intratumorales, como los fibroblastos asociados al tumor o las células inmunes, permite al investigador distinguir entre los efectos autónomos de las células y los efectos no autónomos de las células de la diana terapéutica. Finalmente, un controlador de Cre inducible por tamoxifeno (CreER^T2) permite al investigador eliminar el gen de interés en diferentes etapas en el desarrollo del tumor y definir la ventana en la que el agente terapéutico candidato tiene más probabilidades de ser efectivo.

Desafortunadamente, también hay problemas técnicos que pueden limitar el uso de knockouts condicionales en tumores que surgen en modelos GEM. Por ejemplo, un controlador de Cre que se expresa en las células tumorales y evita la eliminación de genes en las células normales esenciales para la vida puede no estar disponible. Otro problema, que puede estar subestimado, es que los conductores cre y CreER^T2 a menudo ablacionan de manera variable los alelos floxados en ratones, lo que resulta en mosaicismo para la mutación nula en un cáncer GEM. Cuando esto ocurre, las células tumorales en las que el gen objetivo no ha sido ablacionado continuarán proliferando rápidamente, sobrecreciendo las células tumorales con alelos ablacionados. El mosaicismo en las líneas conductoras de Cre puede ocurrir debido a la expresión no ubicua de Cre en el linaje objetivo y por recombinación fallida en células individuales independientes de la expresión de Cre⁴. Este es un fenómeno conocido de los controladores Cre que depende del tipo de célula y debe considerarse durante el diseño experimental y la interpretación de datos. El mosaicismo puede enmascarar el efecto del knockout y llevar a un investigador a concluir erróneamente que el gen de interés no es esencial para la proliferación y / o supervivencia de las células tumorales y, por lo tanto, no es un objetivo terapéutico válido.

Varios de estos problemas se encontraron en un estudio previo que intentó determinar si el receptor tirosina quinasa erbB4 era un objetivo terapéutico potencial en las células MPNST⁵. En estos estudios, se utilizaron ratones que expresan un transgén que codifica la isoforma neuregulina-1 (NRG1) factor de crecimiento glial-β3 (GGFβ3) bajo el control del promotor cero de la proteína mielina específica de la célula de Schwann (ratones P 0-GGFβ3). Los ratones P 0-GGFβ3 desarrollan múltiples neurofibromas plexiformes que progresan hasta convertirse en MPNST a través de un proceso que recapitula los procesos de patogénesis del neurofibroma y la progresión del neurofibroma-MPNST plexiforme observados en pacientes con el síndrome de susceptibilidad tumoral autosómica dominante neurofibromatosis tipo 1 (NF1)⁶. Cuando se cruza a ratones con una mutación nula Trp53, el resultado P 0-GGFβ3; Los ratones Trp53^+/- desarrollan MPNST de novo como se ve en cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- ratones.

Estos MPNST recapitulan la progresión de las lesiones de grado II de la Organización Mundial de la Salud (OMS) a las lesiones de grado IV de la OMS observadas en humanos⁷. En ratones P 0-GGFβ3, los MPNST surgen dentro de neurofibromas plexiformes preexistentes en el nervio trigémino (58%) y las raíces nerviosas dorsales espinales (68%)⁷; los MPNST que surgen en P 0-GGFβ3; Los ratones Trp53^+/- tienen una distribución muy similar. En los seres humanos, los MPNST surgen con mayor frecuencia en el nervio ciático seguido por el plexo braquial, las raíces nerviosas espinales, el vago, el femoral, la mediana, el plexo sacro, el obturador poplíteo y los nervios tibial y cubital posterior⁸. Esta distribución tumoral en estos modelos GEM es algo diferente de lo que se ve en humanos. Sin embargo, los MPNST que surgen en P 0-GGFβ3 y P_0-GGFβ3; Los ratones Trp53^+/- son histológicamente idénticos a los MPNST humanos, portan muchas de las mismas mutaciones observadas en los MPNST humanos y recapitulan el proceso de progresión del neurofibroma-MPNST observado en pacientes con NF1. La generación de P 0-GGFβ3 o P_0-GGFβ3; Los ratones Trp53^+/- que eran Erbb4^-/- no fueron factibles ya que los ratones con dos alelos nulos Erbb4 mueren en el útero en el día embrionario 10.5 secundario a defectos cardíacos⁹. Porque el rescate de la expresión de Erbb4 en el corazón mediante la introducción de un transgén Erbb4 específico del corazón (cadena pesada de α-miosina (MHC)-Erbb4) da como resultado ratones Erbb4^-/- viables¹⁰, la generación de ratones con un complicado P 0-GGFβ3; Trp53^+/-;α-MHC-Erbb4; Se intentó el genotipo Erbb4^-/-.

Sin embargo, los apareamientos no produjeron ratones en las proporciones mendelianas esperadas, lo que indica que el genotipo deseado era perjudicial. Por lo tanto, la generación de P 0-GGFβ3; Se intentaron ratones Trp53^+/- con alelos 11 Erbb4 floxed y un controlador CreER^T2 para permitir la eliminación de Erbb4 en los MPNST que surgen en estos ratones. En estos animales, numerosas células tumorales con alelos Erbb4 intactos todavía estaban presentes (mosaicismo). El mosaicismo observado podría ser el resultado de una administración ineficiente de tamoxifeno, lo que resultó en diferencias en la eficiencia de recombinación dentro del tejido. La posibilidad de mecanismos compensatorios espontáneos podría contribuir aún más al mosaicismo en la recombinación mediada por tamoxifeno al eludir el requisito de expresión de Erbb4. Es factible que la pérdida de Trp53 haga que las células tumorales sean susceptibles a mutaciones "permisivas" espontáneas adicionales que podrían confundir la interpretación de los datos. Como parecía probable que las células MPNST intactas de Erbb4 enmascararan las consecuencias de la ablación de Erbb4 en otras células tumorales, este enfoque fue abandonado.

Estos obstáculos condujeron al desarrollo de una metodología para la ablación de Erbb4 en células MPNST de paso muy temprano utilizando un adenovirus que expresa Cre recombinasa y eGFP. Estas células se pueden separar de las células no infectadas utilizando FACS, lo que reduce notablemente el mosaicismo para el gen Erbb4 ablacionado. A continuación, se describen los métodos utilizados para lograrlo, junto con los métodos utilizados para evaluar los efectos de la ablación génica in vitro e in vivo. El siguiente protocolo es un ejemplo de cómo producir ratones portadores de tumores que producen tumores portadores de alelos floxados de genes letales embrionarios de interés para la escisión ex vivo antes de la evaluación del crecimiento tumoral de aloinjerto in vivo . Esto incluye una descripción de los enfoques utilizados para analizar el efecto que la ablación de Erbb4 ejerce sobre la proliferación de células tumorales, la supervivencia y la expresión génica in vitro y la proliferación, supervivencia y angiogénesis en aloinjertos ortotópicos.

Protocolo

Antes de realizar cualquier procedimiento con ratones, todos los procedimientos deben ser revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. El protocolo descrito en este manuscrito fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur. Este protocolo fue realizado por personal debidamente capacitado siguiendo las pautas institucionales de cuidado de animales de MUSC.

1. Generación de ratones que desarrollan MPNST homocigotos para alelos flox Erbb4

1. Producir la generación F1 de P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4^fl/+ animales por apareamiento P 0-GGFβ3; Ratones Trp53^{+/- 7} con ratones Erbb4^{fl/fl 11}. Utilice un cuadrado de Punnett (Figura 1) para guiar el esquema de reproducción para garantizar que se generen suficientes crías F1 macho y hembra con el P 0-GGFβ3 deseado; Trp53^+/-; Genotipo Erbb4^fl/+.
2. Descendencia del genotipo F1 aislando el ADN genómico de un recorte de cola recogido de acuerdo con las directrices de la IACUC y luego realizar PCR utilizando cebadores previamente descritos para detectar el transgén P 0-GGFβ3¹², Trp53 de tipo salvaje (+) y alelos nulos (-)⁷, y Erbb4^flox y Erbb4 wild-type alleles¹³.
   1. Aislar el ADN de la cola utilizando métodos detallados en jacks-lab.mit.edu/protocols.
   2. Haga que la reacción de PCR se mezcle con 25 ng de ADN, 0,25 nM dNTP, 0,02 U/μL Taq, 0,5 μM de cada imprimación y 1x tampón de PCR. Realizar una reacción de PCR con una sola incubación de 95 °C (para fundir el ADN genómico y activar Taq) durante 1 min seguido de 35 ciclos de PCR de 94 °C, 10 s (fusión); 55 °C, 30 s (recocido); 72 °C, 40 s (extensión) seguido de un solo 72 °C (extensión) durante 5 min. Guarde las reacciones a 4 °C hasta que estén listas para funcionar con un gel de agarosa al 1,2-1,5%.
      NOTA: La temperatura de recocido depende del sistema tampón de PCR utilizado; se recomienda realizar un gradiente de temperatura de recocido para determinar la temperatura de recocido adecuada.
3. Producir la generación F2 de P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4^fl/fl animales apareando la progenie F1 apropiada (P 0-GGFβ3; Trp53^-/+; Erbb4^fl/+) entre sí.
   NOTA: La Figura 1 ilustra las predicciones cuadradas de Punnet utilizadas para calcular el número esperado de descendientes F2 con el genotipo deseado.
4. Identificar animales con el P 0-GGFβ3 deseado; Trp53^-/+; Genotipo Erbb4^fl/fl descrito en el paso 1.2.
5. Mate F2 progenie entre sí para mantener el P 0-GGFβ3; Trp53^-/+; Erbb4^fl/fl colonia y genotipo todos los cachorros. Confirme que el alelo floxed recién introducido no compromete la supervivencia o la latencia del tumor. Lograr esto mediante el establecimiento de cohortes (20 ratones/cohorte) de P 0-GGFβ3; Trp53^+/- y P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Erbb4^fl/fl ratones y siguen su supervivencia y frecuencia de aparición de tumores.
6. Monitoree a los animales varias veces por semana hasta que se alcance el punto final experimental (tamaño máximo permitido del tumor / criterio de valoración humano aprobado por IACUC).
   1. Durante el monitoreo semanal, evalúe el peso corporal, el comportamiento social y de aseo normal, y las mediciones del tamaño del tumor. Organice una evaluación veterinaria en caso de pérdida de peso del >10% del peso corporal, aislamiento social y encorvamiento.
   2. Cuando se identifica un ratón portador de tumor y ha alcanzado su punto final humanitario, sacrifice humanamente al animal mediante inhalación de dióxido de carbono seguido de dislocación cervical y extirpe estérilmente el tumor con un cuchillo de bisturí. Tome medidas del tumor midiendo la longitud, el ancho y la profundidad con una pinza y un tumor de peso (masa y volumen). Trabaje rápidamente para evitar la autolisis.
7. Seccione el tumor en tres secciones utilizando cortes estilo pan de pan con un cuchillo de bisturí en condiciones estériles para generar segmentos de tejido para la fijación de formalina / incrustación de parafina (FFPE), la generación temprana de cultivos de paso y el material congelado por flash (Figura 2A).
   1. Asegúrese de que la Sección 1 (para la generación temprana de cultivos de paso, paso 1.7.2) es aproximadamente el 10% del volumen total del tumor, la Sección 2 (para la fijación y la IHC, paso 1.7.3) es el 70% del volumen total del tumor y la Sección 3 (para la congelación del flash, el paso 1.7.4) es el 20% del volumen total del tumor.
   2. Tome la sección 1 del tumor para la preparación de cultivos de paso temprano (ver más abajo).
   3. Fije la sección 2 del tumor en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 °C y luego incruste en parafina (parafina fijada en formalina (FFPE) para el análisis de diagnóstico.
   4. Sección 3 de flash-freeze para análisis analíticos (por ejemplo, inmunoblots para verificar que la proteína codificada por el gen floxed dirigido se expresa adecuadamente).
8. Teñir secciones de tejido FFPE de 5 μm de espesor con hematoxilina y eosina (H&E) para confirmar el diagnóstico del tumor por un patólogo calificado. Si es apropiado, realice una tinción inmunohistoquímica (IHC) para confirmar el diagnóstico del tumor.
   1. MPNST de inmunotinción para la proteína B de unión al calcio S100 (S100β), la nestina y la región determinante del sexo Y (SRY)-Factor de transcripción de caja 10 (Sox10)-tres marcadores que se expresan tanto en MPNST como en células de Schwann (origen de células tumorales)5,6,14,15. Teñir los tumores con anticuerpos que reconozcan erbB4, la proteína codificada por el gen objetivo de la ablación en los pasos posteriores.
   2. Para confirmar el diagnóstico, haga que un patólogo veterinario o humano calificado evalúe todos los portaobjetos de tumores teñidos siguiendo los criterios de diagnóstico y clasificación de la OMS 5,6,7,16.

2. Ablación ex vivo de alelos Erbb4 floxados en células MPNST

1. Establecer cultivos de paso temprano a partir de tejido MPNST recién recolectado colocando el tejido de la sección 1 (paso 1.7.3) en 10 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) helada sobre hielo y luego transfiriéndolo a un área de trabajo estéril (Figura 2B)¹⁶.
   NOTA: Todos los procedimientos posteriores deben realizarse en una campana de cultivo de tejidos estériles.
2. Picar el tejido tumoral en trozos de 2-4 mm y triturar 8-10 veces en una placa de cultivo de tejido tratada de 10 cm² con 10 ml de medio de crecimiento. Cultive estas preparaciones en un medio de crecimiento DMEM-10 con alto contenido de glucosa (el medio de eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero fetal de ternero, 1% de glutamina, 10 μg/ml de estreptomicina y 10 UI/ml de penicilina) suplementado con 10 nM de neuregulina-1β (NRG1β) y 2 μM de forskolina. Agregue forskolina en esta etapa para inhibir el crecimiento de tipos de células contaminantes comunes, como los fibroblastos.
3. Mantenga el tejido y las células disociados mecánicamente durante un máximo de 3 días a 37 °C en una atmósfera de CO₂ al 5% para establecer un cultivo de paso temprano. No separe las células dispersas y los fragmentos de tejido restantes en este punto.
4. Refresque las culturas con un nuevo medio cada 3-4 días. Permita que las células tumorales proliferen hasta que sean confluentes.
5. Expanda las primeras culturas de paso dividiendo las culturas confluentes en varios platos. Retire el medio de crecimiento y lave las células con 1x dPBS. Luego, agregue 1 ml de tripsina al 0.25% durante 2-5 min a temperatura ambiente por 10 cm² platos de cultivo celular tratados. Triturar suavemente el cultivo para facilitar el desprendimiento y generar una suspensión unicelular.
   1. Termine la tripsinización agregando 2 ml de medio de crecimiento DMEM-10. Recoja la mezcla de células tripsinizadas y transfiérala a un tubo de centrífuga estéril de 5 ml. Pellet las células por centrifugación durante 5 min a 500 × g a temperatura ambiente.
   2. Resuspend el pellet celular en 5 mL de DMEM-10. Divida las células en dos a cuatro placas de cultivo celular de 10 cm, cada una conteniendo 10 ml de medios de crecimiento (aproximadamente 1 × 10⁶ células por plato).
6. Después de 5 pasajes (repitiendo pasos en 2.5), use medio de crecimiento sin NRG1β y forskolina. Inmunotincionar una muestra del cultivo con un anticuerpo anti-S100β para verificar que el cultivo está compuesto únicamente de células tumorales. Mantenga las células en el medio de crecimiento DMEM-10 en todos los pasajes posteriores.
7. En el siguiente pasaje, cuente las células y congele una porción de P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Células Erbb4^fl/fl MPNST recogidas de cultivos confluentes (3 × 10⁶ células/vial).
8. Placa P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Células MPNST de paso temprano Erbb4^fl/fl a una densidad de 1,5 × 10⁶ células por plato de cultivo celular tratado de 10 cm en medio de crecimiento DMEM-10.
9.  Día 0: (Aproximadamente 12-16 h después del emplatado), lavar los cultivos adherentes con 2-4 mL de dPBS e infectar con Ad5CMV-Cre/eGFP o Ad5CMV-eGFP a aproximadamente 400 unidades formadoras de placa (pfu)/célula en 10 mL de DMEM sin suero (es decir, 30 μL de 2 × 10¹⁰ pfu de virus por plato de 10 cm). Ablate los alelos Erbb4 floxed utilizando el adenovirus a la concentración máxima tolerada del virus (multiplicidad de infección, MOI), según se determine empíricamente. Consulte la Figura 2C para obtener un esquema del flujo de trabajo para esta ablación.
10. Día 1: Aproximadamente 16 h después, rescata los cultivos añadiendo 10 ml de DMEM-10 al cóctel de infección.
11. Día 2 - 3: FACS clasifica las células infectadas siguiendo el protocolo recomendado de la instalación central para clasificar las células eGFP positivas aproximadamente 48 h después de la infección. Antes de la clasificación de FACS, verifique brevemente las células en busca de señal eGFP en un microscopio de fluorescencia para asegurarse de que los cultivos se hayan infectado de manera eficiente (~ 50-100% de células positivas). Devolver las células recuperadas después de FACS a platos de cultivo de tejido de 10 cm; reservar un plato para el aislamiento del ADN genómico.
12. Día 4 - 5: Después de la clasificación FACS, deje que las células se recuperen en una incubadora de cultivo de tejidos durante al menos 24-48 h y luego prepare las células para análisis in vitro basados en células o injertos in vivo . Confirme la eliminación de Erbb4 mediante PCR utilizando ADN genómico aislado de una parte de las células eGFP positivas clasificadas. Verificar que las células eGFP positivas sean ErbB4-negativas por PCR o mediante inmunotinción de una muestra del cultivo con un anticuerpo anti-erbB4.
    1. Aislar el ADN genómico de las células utilizando el método estándar de aislamiento de ADN a base de ácido-guanidinio-fenol y cloroformo¹⁷.
    2. Realice PCR estándar para distinguir los alelos Erbb4 floxados y los alelos Erbb4 ablatados. Realizar 40 ciclos con 2 ng de ADN, 20 μM de cebadores 1+2 para producir un producto Erbb4-null de 250 pb y un producto floxed de 350 pb¹³. Realice enfoques basados en PCR y anticuerpos para confirmar la eliminación cuando no haya anticuerpos confiables disponibles.
       NOTA: Las células están listas para ensayos in vitro basados en células como se describe a continuación. Muchos tipos de análisis posteriores se pueden realizar con células preparadas de esta manera. El propósito de los protocolos que se presentan a continuación es proporcionar algunos ejemplos de aplicaciones in vitro e in vivo de estas células tumorales después de la ablación del gen Erbb4 .

3. Ensayos de proliferación y viabilidad en células MPNST con alelos Erbb4 ablacionados

1. Realice ensayos de proliferación durante los próximos siete días en células MPNST clasificadas chapadas en una placa multipozo utilizando un citómetro automatizado basado en imágenes.
   1. Día 6: Placa 2.000 células por pozo en un volumen final de 150 μL (~13.300 células/ml) de medio de crecimiento en una placa de 96 pocillos. Realizar mediciones por triplicado para cada cohorte experimental y 4 lecturas diarias de endpoints (3 réplicas x 2 condiciones x 4 días).
   2. Días 7, 9, 11, 13: Tiñe las células con colorantes hoechst y yoduro de propidio (PI) e imagene de ellas en un lector de placas automatizado para contar el número de células vivas y muertas en cada pozo. Para lograr esto, tiñe simultáneamente las células con tinte Hoechst para teñir los núcleos de las células vivas y muertas y con yoduro de propidio (PI) para etiquetar las células muertas. Realice todas las lecturas a la misma hora todos los días o cada dos días.
      1. Añadir 50 μL de una solución de tinción 4x PI/Hoechst (4 μg/mL cada una) a cada pozo bien cuantificado ese día (por ejemplo, solo el día 7) e incubar durante 30 min a 37 °C en la incubadora de cultivo de tejidos. Mantenga la placa protegida de la luz.
         NOTA: La concentración de tinción de Hoechst debe determinarse empíricamente y puede variar de 1 a 10 μg / ml dependiendo del tipo de célula.
      2. Lea los pocillos teñidos después de la incubación utilizando el canal fluorescente apropiado en el generador de imágenes celulares automatizado. Después de leer, devuelva la placa a la incubadora para futuras lecturas en los días posteriores (es decir, días 9, 11, 13).
      3. Cuantificar las intensidades de tinción en función del sistema de imágenes utilizado y calcular el número de células muertas, células vivas y células totales utilizando los siguientes ajustes: canal azul (377/50 nm, Hoechst): células totales (vivas y muertas); canal rojo (531/40 nm, PI): solo células muertas; azul - rojo (total - muerto) = células vivas.
2. Realice el ensayo de viabilidad celular durante tres días, si lo desea, siguiendo el protocolo de los fabricantes del ensayo.
   NOTA: Los ensayos de viabilidad se pueden combinar con ensayos de proliferación mediante la realización de una tinción triple que incluye calceína AM (488/32 nm; canal verde, específicamente etiqueta células vivas), PI y Hoechst. También se puede realizar un ensayo de apoptosis utilizando cultivos establecidos como se describió anteriormente; el protocolo específico dependerá del sistema de imágenes.
   1. Día 6: Placa 4.000 células por pozo en un volumen final de 150 μL en una placa de 96 pocillos por triplicado.
   2. Días 7 - 9: Agregue reactivos de ensayo de viabilidad de células bioluminiscentes 2,000x (Tabla de Materiales), devuelva la placa a la incubadora y lea la placa 1 h más tarde. Realice lecturas posteriores a la misma hora todos los días. Para los ensayos de bioluminiscencia (MTT), realice el ensayo exactamente como se describe en las instrucciones del fabricante cada 24 h durante 72 h utilizando un lector de placas de luminómetro.

4. Análisis de ARN-Seq e identificación de genes cuya expresión se ve alterada por la pérdida de Erbb4

1. Día 6: Aísle el ARN total de las células MPNST clasificadas utilizando métodos estándar basados en ácido-guanidinio-fenol y cloroformo. Para experimentos diseñados para detectar cambios en los niveles de ARNm entre dos cohortes, prepare el ARN total de al menos tres réplicas biológicas en cada cohorte.
   1. Para eliminar los eventos causados por el vector adenoviral o la expresión de eGFP en lugar de la pérdida de Erbb4, aísle el ARN de tres réplicas biológicas de P 0-GGFβ3; Trp53^+/-; Células MPNST Erbb4^fl/fl transducidas con Ad5CMV-Cre/eGFP y tres réplicas biológicas transducidas con Ad5CMV-eGFP.
      NOTA: El ARN aislado debe tener una puntuación de número de integridad de ARN (RIN) ≥ 8 para el análisis de ARN-Seq. Asegúrese de que el núcleo de secuenciación determine el RIN de todas las muestras antes de construir bibliotecas.
2. Utilice 100-200 ng de ARN total de alta calidad de cada muestra para preparar bibliotecas de ARN-Seq (trabaje con la instalación de secuenciación central para este paso). Realice secuenciaciones de alto rendimiento utilizando un secuenciador de ADN de próxima generación. Para la cuantificación de ARNm, realice una secuenciación de un solo extremo para generar archivos Fastq. Asegurar un mínimo de 50 millones de lecturas para cada muestra.
   NOTA: Consulte la Figura 3 para obtener un esquema que ilustre el flujo de trabajo utilizado para procesar datos de RNA-Seq y cuantificar la expresión de transcripciones expresadas diferencialmente. Los datos de secuencia, en forma de archivos Fastq, se someten a procedimientos de control de calidad; >80% de las lecturas deben arrojar una puntuación Phred de 30 para ser considerada apropiada para su posterior análisis. Las secuencias también se preprocesan (recortan) utilizando Trimmomatic¹⁸ para eliminar secuencias de adaptadores y filtrar lecturas de baja calidad.
3. Realice la alineación y el análisis de RNA-Seq en los archivos generados por fastq utilizando cualquier programa de software capaz (por ejemplo, DNAStar^19,20 o Partek²¹). Siga los pasos específicos del programa utilizando la configuración predeterminada para alinear los archivos fastq con el genoma de referencia del ratón (GRCm38/mm10).
   NOTA: Usando DNAStar como ejemplo, el flujo de trabajo general se describe a continuación (Figura suplementaria 1).
   1. Seleccione el método de análisis, RNA-Seq.
   2. Seleccione el genoma de referencia, Ratón.
   3. Cargue el archivo BED si el núcleo de secuenciación le proporciona uno.
   4. Cargue los archivos de secuenciación fastq, asignándoles nombres de réplica únicos.
   5. Replique en grupo los archivos fastq y designarlos a un conjunto de réplicas (es decir, GFP, CRE)
      NOTA: Cada programa de alineación tiene sus pasos específicos, y el usuario debe consultar con la guía del usuario del programa para el protocolo específico del programa. Luego, el programa generará datos de recuento bruto específicos de genes a partir de estos archivos Fastq.
4. Realizar análisis estadísticos y de normalización (DESeq2, EdgeR) en los datos de conteo bruto utilizando cualquier programa de software capaz, como se describe en 4.3, con el conjunto de muestras Ad5CMV-eGFP como conjunto de datos de control y el conjunto Ad5CMV-Cre como el conjunto de datos de prueba para identificar señales diferenciales de expresión génica con potencia estadística robusta^22,23.
   1. Seleccione los archivos GFP fastq como conjunto de datos de control.
   2. Seleccione DESeq2 como método estadístico y de normalización.
   3. Iniciar montaje y análisis.
      NOTA: Cada programa de alineación tiene sus pasos específicos, y el usuario debe consultar con la guía del usuario del programa para el protocolo específico del programa. Luego, el programa generará datos de recuento bruto específicos de genes a partir de estos archivos Fastq. El análisis estadístico y de normalización es un paso incorporado en muchos programas, como se muestra en el ejemplo aquí, dentro del protocolo de alineación de secuencia. Si se utiliza un programa de software de alineación de secuencia alternativo que no ofrece este paso incorporado posterior, realice el análisis estadístico y de normalización en los datos de recuento sin procesar a nivel de terminal utilizando los paquetes de codificación DESeq2 o EdgeR escritos en R, disponibles gratuitamente para su descarga en Bioconductor.org.
5. Utilice estos enfoques para identificar cambios que representen al menos un aumento o disminución de 1,5 veces en relación con el control (en este caso, células transducidas con el virus Ad5CMV-eGFP). Utilice solo aquellos genes expresados diferencialmente (DEG) que se determine que son estadísticamente significativos y que muestren cambios ≥1,5 veces y un valor p 0,05 o un padj de 0,1 para el análisis posterior del enriquecimiento funcional.
   NOTA: Esto generará una lista de genes DEG y su poder estadístico para el análisis de enriquecimiento funcional.
6. Realizar análisis de enriquecimiento funcional en DEG mediado por Erbb4 estadísticamente significativo identificado en 4.4 con un archivo de lista de genes clasificado utilizando cualquiera de las herramientas basadas en la web disponibles gratuitamente. Determinar la importancia biológica y de la vía de la pérdida del gen Erbb4 a través de conjuntos de datos de ontología génica integrados en estas herramientas de análisis de enriquecimiento funcional de acceso abierto 24,25,26,27 (consulte la Tabla de materiales para ejemplos y la Figura 3 para un flujo de trabajo de ejemplo utilizando Panther).
   1. Exporte los datos obtenidos en el paso 4.4 como una hoja de cálculo.
   2. Clasifique los datos por log2 fold change, p/padj value, o ambos.
   3. Asegúrese de eliminar todos los datos no estadísticamente significativos.
   4. Exporte la lista de genes clasificados con ID de gen solo como un archivo de .txt y cárguelo en el sitio web.
      NOTA: Utilice solo DEG estadísticamente significativo (valores de p/padj < 0,05 o 0,1, respectivamente) para generar una lista de genes de entrada clasificada utilizando los cambios log2 fold (de mayor a menor), los valores de p/padj (de menor a mayor) o ambos [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. Existen varios enfoques para generar una lista de genes clasificada y se determina empíricamente para el conjunto de datos y la pregunta que se está haciendo. El tipo específico de herramienta de análisis de enriquecimiento funcional que se utiliza también puede ayudar a determinar el tipo apropiado de lista de genes de rango. Para obtener recursos adicionales sobre RNA-Seq, consulte los siguientes documentos 28,29,30.

5. Aloinjerto ortotópico de células MPNST con alelos Erbb4 ablatados y análisis de los efectos de la ablación Erbb4

1. Antes de realizar el aloinjerto ortotópico de células MPNST clasificadas, asegúrese de que todos los procedimientos sean revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, y que todos los procedimientos sean realizados por personal debidamente capacitado.
2. El día de la inyección, retire las células de paso bajo (aproximadamente el 85% de confluencia) de las placas o matraces de cultivo celular utilizando una solución de disociación celular no enzimática (por ejemplo, una mezcla de quelantes; consulte la Tabla de materiales) y cuente las células con un hemocitómetro. Para las inyecciones ortotópicas en el nervio ciático, reconstituir las células a 16.667 células/ml (50.000 células por 3 μL para cada animal) en DMEM-10³¹. Mantenga las células en hielo.
   NOTA: Algunos cultivos no establecerán con éxito injertos a menos que las células se inyecten en la matriz de membrana basal de bajo factor de crecimiento. El requisito de una matriz de membrana basal (10-50%) debe determinarse empíricamente.
3. Evaluar el potencial de crecimiento del aloinjerto in vivo en células post-infectadas inyectando células MPNST en el nervio ciático de 8-10 ratones Hsd anestesiados: Athymic Nude-Foxn1^nu por cohorte (de 4 a 8 semanas de edad). Para la inyección ortotópica de células tumorales, consulte Turk et al³¹. Aquí, se demuestra una inyección subcutánea.
   NOTA: Para determinar el número de animales de experimentación necesarios para la significación estadística, consulte con un bioestadístico o se recomienda utilizar G*Power3, un software disponible gratuitamente³².
4. Controle a los animales de cerca dos veces al día durante la primera semana después de la inyección para detectar cualquier signo de dolor. A partir de entonces, monitoree a los ratones injertados tres veces por semana para mediciones de calibradores y evalúe las puntuaciones de condición corporal (BCS) como se describió anteriormente ^5,31. Como se describe en las pautas de la IACUC, eutanasia a los animales con un BCS de 2 o menos.
5. A medida que las células injertadas crecen a diferentes velocidades, determine empíricamente los tiempos de injerto utilizando células de control (no modificadas) antes de realizar los experimentos descritos en esta sección. Para recolectar los injertos en el punto final experimental, sacrificar a los ratones humanamente utilizando la inhalación de dióxido de carbono seguida de dislocación cervical como medida secundaria. Registre el volumen final y las mediciones de masa de cada injerto.
   NOTA: Como P 0-GGFβ3 no modificado; Trp53^+/-; Las células MPNST Erbb4^fl/fl generalmente alcanzan el tamaño máximo permitido por IACUC dentro de los 30-45 días, una línea de tiempo típica es de alrededor de 30-45 días después de la inyección.
6. Aislar y seccionar el tejido como se describe en los pasos 1.6-1.8. Fije parte del tejido del injerto durante la noche en paraformaldehído al 4% (Figura 2) y luego intégrelo en parafina. Prepare secciones de 5 μm del tejido FFPE y móntelas en portaobjetos. Realizar tinción de H&E y otras inmunotinciones necesarias para confirmar que el tejido del injerto está compuesto de células tumorales como se describe en 1.8.1. Congelar el resto del tejido tumoral para análisis posteriores, como validar la pérdida de la expresión de Erbb4 y evaluar los efectos de la pérdida de Erbb4 en la expresión de otros miembros de la familia Erbb .
   NOTA: La confirmación de las células tumorales en el tejido del injerto debe hacerse porque los ratones inmunodeficientes son propensos a desarrollar neoplasias. En el caso de injertos pequeños, es importante asegurarse de que el tejido cicatricial o la inflamación no se confundan con una neoplasia.
   1. Realizar tinción estándar de IHC en el tejido FFPE para comparar la expresión de proteínas de interés en aloinjertos cultivados a partir de células tratadas con Ad5CMV-eGFP y Ad5CMV-Cre/eGFP. Teñir el tejido del injerto extirpado utilizando anticuerpos específicos de erbB4 para confirmar las diferencias en la expresión in vivo de erbB4 entre las dos condiciones experimentales. Determinar el índice proliferativo a través de la tinción de Ki67 y el nivel de apoptosis a través de la tinción terminal de etiquetado de extremo de dUTP (TUNEL) mediada por desoxinucleotidil transferasa (TUNEL).
      NOTA: Cualquier objetivo de proteína de interés también se puede evaluar a través de IHC. Por ejemplo, evaluar la densidad vascular mediante la inmunotinción de aloinjertos con un anticuerpo anti-CD31 (dilución 1:50) para determinar las diferencias de microambiente vascular in vivo mediadas por la ablación génica. El número de perfiles vasculares por campo 40x se puede contar para la cuantificación. Para estos ensayos basados en IHC, siga los protocolos estándar de IHC para los procedimientos de tinción y el protocolo del fabricante para la tinción tunel. Para la cuantificación de imágenes, utilice el complemento ImageJ "conteo automatizado de imágenes de un solo color".

Resultados

La Figura 4 ilustra un resultado típico obtenido al transducir P 0-GGFβ3; Trp53^-/+; Células MPNST Erbb4^fl/fl con el adenovirus Ad5CMV-eGFP o el adenovirus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figura 4A). Los cultivos se observan con microscopía de fluorescencia para identificar células que expresan eGFP y mediante microscopía de contraste de fase para determinar el número total de células presentes en el mismo campo a 10x (...

Discusión

Los métodos detallados presentados aquí se desarrollaron utilizando un modelo GEM de MPNST. Sin embargo, si el tejido tumoral de interés se puede dispersar en células individuales, estas metodologías son fácilmente adaptables para varios tipos de tumores que surgen en los GEM. Es importante asegurarse de que el alelo floxed no resulte en i) disminución de la supervivencia que puede dificultar la obtención de suficientes ratones para detectar tumores, o ii) aumento de la latencia tumoral que puede dificultar la ob...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad5CMV-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody	Thermo/Fisher	GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics	Bioconductor	http://www.bioconductor.org	alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31	Abcam	ab28364
Celigo Image Cytometer	Nexcelom Bioscience	N/A
Cell Stripper	Corning	25-056-Cl	mixture of chelators
DAB staining kit	Vector Labs	MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)	DAVID	https://david.ncifcrf.gov	functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM	Corning	15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)	Thermo/Fisher	EP0701 and K1072
erbB4 antibodies	Santa Cruz	sc-284
erbB4 antibodies	Abcam	ab35374
erbB4 antibodies	Millipore	HFR1: 05-1133
FACS Sorter	BD Biosciences	Aria II
Forskolin	Sigma	F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources	GenomeSpace	https://genomespace.org/support/tools/	general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine	Corning	25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool	Gorilla	N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il	functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis	Broad Institute	N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp	functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice	Envigo (Previously Harlan Labs)	69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)	Illumina	Hi Seq 2500	DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis	DNAStar LaserGene software	N/A	software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly	software alignment used for step 4.3	N/A	software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix	Corning	354230
NRG1-beta	In house	Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342	Thermo	62249
Panther Gene Ontology Classification System	Panther	http://pantherdb.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)	Partek, Ver 7	N/A	software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine	Fisher	51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays	R&D Systems	ARY003B
Real time glo	Promega	G9712	bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite	ToppGene	https://toppgene.cchmc.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)	Invitrogen	15596026
Tyramide Signal Amplification Kit	Perkin Elmer	NEL721001EA