Una ventana permanente para investigar la metástasis del cáncer en el pulmón

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanentemente permanente para el tórax murino, que permite obtener imágenes intravitales de alta resolución del pulmón. La permanencia de la ventana la hace muy adecuada para el estudio de los procesos celulares dinámicos en el pulmón, especialmente aquellos que evolucionan lentamente, como la progresión metastásica de las células tumorales diseminadas.

Resumen

La metástasis, que representa ~ 90% de la mortalidad relacionada con el cáncer, implica la propagación sistémica de las células cancerosas desde tumores primarios a sitios secundarios como el hueso, el cerebro y el pulmón. Aunque ampliamente estudiados, los detalles mecanicistas de este proceso siguen siendo poco conocidos. Si bien las modalidades de imágenes comunes, incluida la tomografía computarizada (TC), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (IRM), ofrecen diversos grados de visualización macroscópica, cada una carece de la resolución temporal y espacial necesaria para detectar la dinámica de las células tumorales individuales. Para abordar esto, se han descrito numerosas técnicas para la obtención de imágenes intravitales de sitios metastásicos comunes. De estos sitios, el pulmón ha demostrado ser especialmente difícil de acceder para las imágenes intravitales debido a su delicadeza y papel crítico en el mantenimiento de la vida. Aunque se han descrito previamente varios enfoques para la obtención de imágenes intravitales unicelulares del pulmón intacto, todos implican procedimientos altamente invasivos y terminales, lo que limita la duración máxima posible de la imagen a 6-12 h. Aquí se describe una técnica mejorada para la implantación permanente de una ventana óptica torácica mínimamente invasiva para imágenes de alta resolución del pulmón (WHRIL). Combinada con un enfoque adaptado a la microcartografía, la innovadora ventana óptica facilita la obtención de imágenes intravitales en serie del pulmón intacto a resolución de una sola célula en múltiples sesiones de imágenes y que abarcan varias semanas. Dada la duración sin precedentes durante el cual se pueden recopilar datos de imágenes, el WHRIL puede facilitar el descubrimiento acelerado de los mecanismos dinámicos subyacentes a la progresión metastásica y numerosos procesos biológicos adicionales dentro del pulmón.

Introducción

Responsable de ~ 90% de las muertes, la metástasis es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer¹. Entre los principales sitios de metástasis clínicamente observados (hueso, hígado, pulmón, cerebro)², el pulmón ha demostrado ser particularmente desafiante para las imágenes in vivo a través de microscopía intravital. Esto se debe a que el pulmón es un órgano delicado en movimiento perpetuo. El movimiento continuo de los pulmones, agravado aún más por el movimiento cardíaco intratorácico, representa una barrera sustancial para obtener imágenes precisas. Por lo tanto, debido a su relativa inaccesibilidad a las modalidades de imágenes ópticas intravitales de alta resolución, el crecimiento del cáncer dentro del pulmón a menudo se ha considerado un proceso oculto³.

En el entorno clínico, las tecnologías de imagen como la tomografía computarizada (TC), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (IRM) permiten la visualización en lo profundo de órganos vitales intactos como el pulmón⁴. Sin embargo, si bien estas modalidades proporcionan excelentes vistas del órgano grueso (a menudo incluso revelando patología antes de la aparición de los síntomas clínicos), son de resolución inadecuada para detectar células tumorales diseminadas individuales a medida que avanzan a través de las primeras etapas de la metástasis. En consecuencia, en el momento en que las modalidades antes mencionadas proporcionan cualquier indicación de metástasis al pulmón, los focos metastásicos ya están bien establecidos y proliferan. Dado que el microambiente tumoral juega un papel fundamental en la progresión del cáncer y la formación de metástasis^5,6, existe un gran interés en investigar los primeros pasos de la siembra metastásica in vivo. Este interés se alimenta aún más por la mayor apreciación de que las células cancerosas se diseminan incluso antes de que se detecte el tumor primario^7,8 y la creciente evidencia de que sobreviven como células individuales y en un estado latente durante años o décadas antes de crecer en macrometástasis⁹.

Anteriormente, la obtención de imágenes del pulmón a resolución unicelular ha implicado necesariamente preparaciones ex vivo o explante^10,11,12,13,limitando los análisis a puntos de tiempo únicos. Si bien estas preparaciones proporcionan información útil, no proporcionan ninguna idea de la dinámica de las células tumorales dentro del órgano conectado a un sistema circulatorio intacto.

Los recientes avances tecnológicos en imágenes han permitido la visualización intravital del pulmón intacto a resolución unicelular durante períodos de hasta 12 h^14,15,16. Esto se logró en un modelo murino utilizando un protocolo que involucró ventilación mecánica, resección de la caja torácica e inmovilización pulmonar asistida por vacío. Sin embargo, a pesar de ofrecer las primeras imágenes de resolución celular única del pulmón fisiológicamente intacto, la técnica es altamente invasiva y terminal, lo que impide más sesiones de imágenes más allá del procedimiento índice. Esta limitación, por tanto, impide su aplicación al estudio de pasos metastásicos que tardan más de 12 h, como la latencia y el reinicio del crecimiento^14,15,16. Además, los patrones de comportamiento celular observados utilizando este enfoque de imágenes deben interpretarse con cautela, dado que es probable que los diferenciales de presión inducidos por el vacío causen desviaciones en el flujo sanguíneo.

Para superar estas limitaciones, recientemente se desarrolló una Ventana mínimamente invasiva para imágenes de alta resolución del pulmón (WHRIL), que facilita la obtención de imágenes en serie durante un período prolongado de días a semanas, sin necesidad de ventilación mecánica¹⁷. La técnica consiste en la creación de una "caja torácica transparente" con una cavidad torácica sellada para la preservación de la función pulmonar normal. El procedimiento es bien tolerado, lo que permite que el ratón se recupere sin alteraciones significativas en la actividad y función basales. Para localizar de forma fiable exactamente la misma región pulmonar en cada sesión de imagen respectiva, se aplicó a esta ventana una técnica conocida como microcartografía¹⁸. A través de esta ventana, fue posible capturar imágenes de células a medida que llegan al lecho vascular del pulmón, cruzan el endotelio, se dividen celularmente y crecen en micrometástasis.

Aquí, el estudio presenta una descripción detallada de un protocolo quirúrgico mejorado para la implantación del WHRIL, que simplifica la cirugía al tiempo que aumenta su reproducibilidad y calidad. Si bien este protocolo fue diseñado para permitir la investigación de los procesos dinámicos subyacentes a la metástasis, la técnica puede aplicarse alternativamente a las investigaciones de numerosos procesos de biología y patología pulmonar.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se han realizado de acuerdo con las pautas y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluida la aprobación previa del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina Albert Einstein.

1. Pasivación de ventanas

1. Enjuague los marcos ópticos de las ventanas (Figura suplementaria 2) con una solución al 1% (p/v) de detergente enzimáticamente activo.
2. Dentro de un frasco de vidrio, sumerja los marcos ópticos de las ventanas en una solución de hidróxido de sodio al 5% (p/v) durante 30 min a 70 °C.
3. Retire y lave los marcos de las ventanas con agua desionizada.
4. Dentro de un frasco de vidrio nuevo, sumerja los marcos ópticos de las ventanas en una solución de ácido cítrico al 7% (p/v) durante 10 min a 55 °C.
5. Una vez más, retire y lave los marcos de las ventanas con agua desionizada.
6. Repita el paso 1.2; luego, retire y lave los marcos de las ventanas con agua desionizada.

2. Preparación para la cirugía

1. Realice la cirugía en una campana o gabinete de flujo laminar. Para evitar la contaminación del campo operatorio, asegure áreas distintas y separadas para la preparación, la cirugía y la recuperación, respectivamente.
2. Antes de la cirugía, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en un autoclave. Si se planean procedimientos posteriores, vuelva a esterilizar los instrumentos con un esterilizador de cuentas calientes. Para este procedimiento quirúrgico, se utiliza una técnica de solo puntas.
3. Encienda el esterilizador de cuentas y cuentas quirúrgicas calentadas.
4. Anestesiar al ratón con 5% de isoflurano en la cámara de anestesia.
5. Para eliminar el vello, aplique generosamente crema depilatoria en el sitio de la incisión torácica superior izquierda. Después de no más de 20 s, limpie firmemente el cabello y la crema depilatoria con papel de seda humedecido. Repetir según sea necesario para eliminar todo el vello del sitio quirúrgico.
6. Usando sutura de seda 2-0, ate un nudo en la base de un catéter de 22 G, dejando colas largas de 2 pulgadas (ver Figura 1A).

3. Cirugía de la ventana pulmonar

1. Lávese las manos con jabón antiséptico.
2. Antes de cada nueva cirugía, póngase guantes estériles nuevos.
3. Para evitar el secado corneal y el daño a los ojos del ratón, aplique ungüento oftálmico en ambos ojos.
4. Diluir 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina en 90 μL de PBS estéril, y luego inyectar por vía subcutánea para asegurar la analgesia preoperatoria.
5. Intubar al ratón con el catéter de 22 G atado a sutura de seda¹⁵. Usando una bombilla de inflado, confirme la intubación exitosa observando el aumento bilateral del pecho al apretar la bombilla.
6. Asegure el catéter de intubación atando la sutura de seda 2-0 alrededor del hocico del ratón (ver Figura 1B).
7. Coloque el ratón en el soporte quirúrgico calentado y colóquelo en el decúbito lateral derecho para exponer el tórax izquierdo.
8. Conecte el ventilador al catéter de intubación.
9. Asegure una ventilación controlada y estable en el ventilador y luego reduzca el isofluorano al 3%. Al inicio del procedimiento y periódicamente durante toda la duración del procedimiento, evalúe la adecuación de la anestesia mediante la realización de una prueba de pellizco del dedo del pie.
10. Usando cinta de papel, asegure craneal y caudalmente las extremidades delanteras y traseras, respectivamente, a la etapa quirúrgica calentada. Coloque otro trozo de cinta adhesiva a lo largo de la espalda del ratón para maximizar la exposición al campo quirúrgico (ver Figura 1C).
11. Abra todos los instrumentos quirúrgicos debajo del capó para la preservación de la esterilidad.
12. Esterilizar el sitio quirúrgico mediante una generosa aplicación de antiséptico a la piel del ratón.
13. Usando fórceps, levante la piel y haga una incisión circular de ~ 10 mm, ~ 7 mm a la izquierda del esternón y ~ 7 mm superior al margen subcostal (Figura 1D).
14. Identifique cuidadosamente cualquier buque importante. Si es necesaria la división de vasos, cauterizar en ambos extremos con la pluma de electrocauterización para mantener la hemostasia.
15. Extirpar el tejido blando que recubre las costillas.
16. Eleve la^6ª o 7ª costilla usando^fórceps. Usando una sola cuchilla de las tijeras de microdisección roma, el lado redondeado hacia el pulmón, perfore cuidadosamente el músculo intercostal entre las costillas⁶ y⁷ para ingresar al espacio intratorácico(Figura 1E).
17. Descargue delicadamente el bote de aire comprimido en el defecto para colapsar el pulmón y separarlo de la pared torácica. Dispare el aire comprimido en ráfagas cortas para evitar lesiones pulmonares iatrogénicas.
18. Coloque la punción de biopsia sobre la herramienta de corte (Figura suplementaria 1) y maniobre cuidadosamente la base de la herramienta de corte a través de la incisión intercostal (Figura 1F).
19. Oriente la base de la herramienta de corte de tal manera que esté paralela a la pared torácica. Perforar un orificio circular de 5 mm a través de la caja torácica (Figura 1G).
    NOTA: Asegúrese de que el tejido pulmonar expuesto sea rosado, sin signos de daño.
20. Usando la sutura de seda 5-0, cree una puntada de cuerda de bolso ~ 1 mm desde el agujero, circunferencialmente, entrelazada con las costillas (Figura 1H).
21. Coloque el marco de la ventana de tal manera que los bordes del defecto circular se alineen dentro de la ranura de la ventana (consulte la Figura 1I).
22. Bloquee de forma segura la ventana implantada atando firmemente la sutura de seda 5-0.
23. Cargue 100 μL de adhesivo de gel de cianoacrilato en la jeringa de 1 ml.
24. Seque el pulmón aplicando un flujo suave y constante de aire comprimido durante ~ 10-20 s(Figura 1J).
25. Usando pinzas para agarrar el marco de la ventana por su borde exterior, levante suavemente para garantizar la separación del pulmón de la superficie inferior del marco de la ventana.
26. Dispensar una capa delgada de adhesivo de cianoacrilato a lo largo de la superficie inferior del marco óptico de la ventana(Figura 1K).
27. Aumente la presión positiva al final de la espiración (PEEP) en el ventilador para inflar el pulmón.
28. Sosteniendo durante 10-20 s, aplique una presión suave pero firme para fijar el marco de la ventana óptica al tejido pulmonar (Figura 1L).
29. Dispense una gota de 5 mm del adhesivo de gel de cianoacrilato restante en una funda rectangular.
30. Recoge la cubierta de 5 mm con pastillas de vacío. Sumerja la superficie inferior de la cubierta en el adhesivo y luego raspe el exceso de adhesivo tres veces contra el lado de la cubierta rectangular, de modo que solo quede una capa muy delgada(Figura 1M).
31. Coloque cuidadosamente la cubierta para que quepa dentro del hueco en el centro del marco de la ventana óptica y se mantenga por encima del tejido pulmonar en ángulo. Sujete brevemente el ventilador para generar presión positiva, hiperinflando el pulmón. Usando un movimiento giratorio, oriente la cubierta paralela al tejido pulmonar para crear una aposición directa entre la superficie del pulmón y la superficie inferior de la cubierta. Mantenga una presión suave, permitiendo que el adhesivo de cianoacrilato se fije (~ 25 s).
32. Utilice las pinzas para separar la cubierta de las pastillas de vacío (Figura 1N).
33. Usando sutura de seda 5-0, vuelva a crear una puntada de cuerda de bolso, esta vez <1 mm circunferencialmente desde el borde de corte de la incisión de la piel. Coloque cualquier exceso de piel debajo del borde exterior del marco de la ventana antes de atarlo firmemente con nudos de bloqueo.
34. Para asegurar un sellado hermético entre la cubierta y el marco de la ventana, dispense una pequeña cantidad de cianoacrilato líquido en la interfaz metal-vidrio (ver Figura 1O).
35. Coloque una aguja estéril en una jeringa de insulina de 1 ml. Inserte la aguja debajo de la apófisis xifoidea, avanzando hacia el hombro izquierdo, entrando en la cavidad torácica a través del diafragma. Retire suavemente la jeringa para eliminar el aire residual de la cavidad torácica (consulte la Figura 1P).
36. Retire la cinta del ratón.
37. Apague el isoflurano.
38. Continúe la ventilación con oxígeno al 100% hasta que el ratón parezca listo para despertar.
39. Corte cuidadosamente la sutura de seda 2-0 alrededor del hocico del ratón y extuba al ratón.
40. Transfiera el ratón a una jaula limpia y monitoree hasta que se recupere por completo. Eutanasiar al ratón si hay signos de dificultad para respirar.
41. Proporcionar analgesia postoperatoria inyectando por vía subcutánea 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina diluida en 90 μL de solución tamponada con fosfato estéril (PBS).

Resultados

Los pasos del procedimiento quirúrgico descritos en este protocolo se resumen e ilustran en la Figura 1. Brevemente, antes de la cirugía, los ratones son anestesiados y se elimina el vello sobre el tórax izquierdo. Los ratones son intubados y ventilados mecánicamente para permitir la supervivencia tras la ruptura de la cavidad torácica. Se extirpa el tejido blando que recubre las costillas y se crea un pequeño defecto circular, que abarca las costillas⁶ y^7. El ma...

Discusión

En sitios de metástasis a distancia, como el pulmón, las imágenes ópticas de alta resolución proporcionan información sobre la dinámica elaborada de la metástasis de las células tumorales. Al permitir la visualización in vivo de células cancerosas individuales y sus interacciones con el tejido huésped, las imágenes intravitales de alta resolución han demostrado ser fundamentales para comprender los mecanismos subyacentes a la metástasis.

Aquí se describe un protocolo q...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	N/A	concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning
2 µm fluorescent microspheres	Invitrogen	F8827
5 mm coverslip	Electron Microscopy Sciences	72296-05
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
5% Isoflurane	Henry Schein, Inc	29405
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle	Ethicon, Inc.	774B
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275
8 mm stainless steel window frame	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 2
9 cm 2-0 silk tie	Ethicon, Inc.	LA55G
5 mm disposable biopsy punch	Integra	33-35-SH
Blunt micro-dissecting scissors	Roboz	RS-5980
Brass window tool holder	N/A	N/A	Custom-made, Supplemental Figure 3
Buprenorphine	Hospira	0409-2012-32
Cautery pen	Braintree Scientific	GEM 5917
Chlorhexidine gluconate	Becton, Dickinson and Company	260100	ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12
Cyanoacrylate adhesive	Henkel Adhesives	LOC1363589
Fiber-optic illuminator	O.C. White Company	FL3000
Bead sterilizer	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Germinator 500
Graefe forceps	Roboz	RS-5135
Infrared heat lamp	Braintree Scientific	HL-1
Insulin syringes	Becton Dickinson	329424
Isoflurane vaporizer	SurgiVet	VCT302
Jacobson needle holder with lock	Kalson Surgical	T1-140
Long cotton tip applicators	Medline Industries	MDS202055
Nair	Church & Dwight Co., Inc.	40002957
Neomycin/polymyxin B/bacitracin	Johnson & Johnson	501373005	Antibiotic ointmen
Ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
Paper tape	Fisher Scientific	S68702
Murine ventilator	Kent Scientific	PS-02	PhysioSuite
Rectangular Cover Glass	Corning	2980-225
Rodent intubation stand	Braintree Scientific	RIS 100
Small animal lung inflation bulb	Harvard Apparatus	72-9083
Stainless steel cutting tool	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic	Hi-Tech Pharmacal Co.	50383-823-16
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming	Kent Scientific	SURGI-M02	Heated surgical platform
Tracheal catheter	Exelint International	26746	22 G catheter
Vacuum pickup system metal probe	Ted Pella, Inc.	528-112