Expresión de GFP inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120

Resumen

La optogenética es una herramienta poderosa con una amplia gama de aplicaciones. Este protocolo demuestra cómo lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul.

Resumen

Los sistemas de expresión génica inducibles son una herramienta invaluable para estudiar los procesos biológicos. Los sistemas de expresión optogenética pueden proporcionar un control preciso sobre el tiempo, la ubicación y la amplitud de la expresión génica utilizando la luz como agente inductor. En este protocolo, se utiliza un sistema de expresión optogenética para lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra. Este sistema se basa en un factor de transcripción diseñado llamado TAEL basado en un factor de transcripción activado por la luz natural de la bacteria E. litoralis. Cuando se ilumina con luz azul, TAEL se dimeriza, se une a su elemento regulador cognado llamado C120 y activa la transcripción. Este protocolo utiliza embriones transgénicos de pez cebra que expresan el factor de transcripción TAEL bajo el control del omnipresente promotor ubb. Al mismo tiempo, el elemento regulador C120 impulsa la expresión de un gen reportero fluorescente (GFP). Utilizando un panel LED simple para entregar luz azul activadora, la inducción de la expresión de GFP se puede detectar primero después de 30 minutos de iluminación y alcanza un pico de inducción de más de 130 veces después de 3 h de tratamiento de luz. La inducción de la expresión puede evaluarse mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y mediante microscopía de fluorescencia. Este método es un enfoque versátil y fácil de usar para la expresión génica optogenética.

Introducción

Los sistemas de expresión génica inducibles ayudan a controlar la cantidad, el momento y la ubicación de la expresión génica. Sin embargo, lograr un control espacial y temporal exacto en organismos multicelulares ha sido un desafío. El control temporal se logra más comúnmente^mediante la adición de compuestos de moléculas pequeñas 1 o la activación de promotores de choque^{térmico 2}. Aún así, ambos enfoques son vulnerables a problemas de tiempo, fuerza de inducción y respuestas de estrés fuera del objetivo. El control espacial se logra principalmente mediante el uso de promotores específicos de tejidos³, pero este enfoque requiere un promotor o elemento regulador adecuado, que no siempre está disponible, y no es propicio para la inducción a nivel de subsulares.

En contraste con tales enfoques convencionales, los activadores transcripcionales optogenéticos activados por la luz tienen el potencial de un control espacial y temporal más fino de la expresión^{génica 4}. El sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul fue desarrollado y optimizado para su uso en embriones de pez cebra^5,6. Este sistema se basa en un factor de transcripción endógeno activado por la luz de la bacteria E. litoralis^7,8. El sistema TAEL/C120 consiste en un activador transcripcional llamado TAEL que contiene un dominio de transactivación Kal-TA4, un dominio LOV (detección de luz-oxígeno-voltaje) sensible a la luz azul y un dominio de unión al ADN de hélice-giro-hélice (HTH)⁵. Cuando se iluminan, los dominios LOV sufren un cambio conformacional que permite que dos moléculas TAEL se dimericen, se unan a un promotor C120 sensible a TAEL e inicien la transcripción de un gen de interés aguas^{abajo 5,8}. El sistema TAEL/C120 exhibe una inducción rápida y robusta con una toxicidad mínima, y puede ser activado por varias modalidades diferentes de suministro de luz. Recientemente, se realizaron mejoras en el sistema TAEL/C120 agregando una señal de localización nuclear a TAEL (TAEL-N) y acoplando el elemento regulador C120 a un promotor basal cFos (C120F)(Figura 1A). Estas modificaciones mejoraron los niveles de inducción en más de 15 veces⁶.

En este protocolo, se utiliza un panel LED simple para activar el sistema TAEL/C120 e inducir la expresión ubicua de un gen reportero, GFP. La inducción de la expresión se puede monitorear cualitativamente observando la intensidad de la fluorescencia o cuantitativamente midiendo los niveles de transcripción utilizando PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Este protocolo demostrará el sistema TAEL/C120 como una herramienta versátil y fácil de usar que permite una regulación robusta de la expresión génica in vivo.

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Protocolo

Este estudio se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California Merced.

1. Cruce de peces cebra y recolección de embriones

1. Mantenga líneas separadas de pez cebra transgénico que contengan el activador transcripcional TAEL o el gen reportero controlado por C120 para minimizar la activación espuria.
2. Cruce de 6 a 8 peces cebra adultos de cada línea utilizando métodos estándar⁹ para producir embriones transgénicos dobles que contengan los componentes TAEL y C120(Figura 1B).
   NOTA: Alternativamente, ambos componentes pueden expresarse transitoriamente a través de la microinyección de ARNm o ADN plásmido utilizando métodos estándar¹⁰.
3. Recolectar embriones en placas de Petri que contengan agua de huevo (60 μg / ml de sal marina instantánea del océano disuelta en agua destilada), con aproximadamente 30 embriones por condición para ser probados.
4. Coloque los platos en una caja o cubierta a prueba de luz con papel de aluminio para minimizar la activación involuntaria por la luz ambiental (ver Tabla 1).

2. Inducción de luz global

1. Utilice un panel LED de luz azul (465 nm) para administrar luz azul activadora a varios embriones a la vez.
2. Coloque el panel LED en relación con las placas de Petri que contienen embriones de modo que la potencia real de la luz recibida por los embriones sea de aproximadamente 1,5 mW / cm² medida por un medidor de potencia y energía de la luz (Figura 2A).
3. Pulsar la luz a intervalos de 1 h encendido/1 h apagado utilizando un relé temporizador si se ilumina durante más de 3 h para reducir el riesgo de fotodaje al activador transcripcional TAEL^5,8.
   NOTA: Es posible que sea necesario optimizar la duración exacta de la iluminación para aplicaciones específicas. En este protocolo, se proporcionan ejemplos de duración de iluminación de 30 min, 1 h, 3 h y 6 h.
4. Retire las tapas de las placas de Petri para minimizar la dispersión de la luz de la condensación.
5. Coloque las placas de Petri que contienen embriones de control en una caja a prueba de luz o cubra con papel de aluminio para controles oscuros.

3. Evaluación cuantitativa de la inducción por qRT-PCR

1. Retire los embriones de la iluminación después de la duración de activación deseada.
2. Extraiga el ARN total de 30-50 embriones activados por la luz y 30-50 embriones oscuros utilizando un kit de aislamiento de ARN siguiendo las instrucciones del kit.
   1. Transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y elimine el exceso de agua de huevo. Añadir tampón de lisis y homogeneizar los embriones con un mortero de plástico.
   2. Transfiera el lisate a una columna proporcionada por el kit y continúe con las instrucciones del kit. Proceda inmediatamente al paso 3.3 o almacene el ARN purificado a -20 °C a -80 °C.
3. Utilice 1 μg de ARN total para la síntesis de ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc siguiendo las instrucciones del kit.
   1. Tome un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml, agregue 1 μg de ARN a 4 μL de mezcla maestra de reacción de ADNc 5x (que contiene tampón optimizado, oligo-dT y cebadores aleatorios, y dNTP), 1 μL de solución de transcriptasa inversa 20x y agua libre de nucleasa a un volumen total de 20 μL.
   2. Coloque el tubo en un termociclador programado de la siguiente manera: 22 °C durante 10 min, 42 °C durante 30 min, 85 °C durante 5 min, y luego manténgalo a 4 °C. Proceda inmediatamente al paso 3.4 o almacene el ADNc a -20 °C.
4. Prepare reacciones de qPCR que contengan una mezcla maestra de enzimas verdes SYBR, ADNc diluido 5 veces (paso 3.3) y 325 nM de cada imprimación para GFP.
   NOTA: Los cebadores utilizados en este protocolo de la siguiente manera. GFP adelante: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP reverso: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a forward 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a reverso: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').
5. Realizar reacciones de qPCR en una máquina de PCR en tiempo real.
   NOTA: Programa de PCR: activación inicial a 95 °C durante 10 min, seguida de 40 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C y 1 min a 72 °C.
6. Realice un análisis de la curva de fusión una vez que se complete la PCR para determinar la especificidad de la reacción. Realice tres réplicas técnicas para cada muestra.
7. Calcular la inducción activada por la luz como cambio de pliegue en relación con los embriones mantenidos en la oscuridad utilizando el método^{2 -ΔΔCt 11}. La significación estadística se puede determinar con un paquete de software de estadísticas.

4. Evaluación cualitativa de la inducción por microscopía de fluorescencia

1. Retire los embriones de la iluminación después de la duración deseada de la activación.
2. Inmovilizar embriones para obtener imágenes en metilcelulosa al 3% que contiene 0,01% de tricaína en portaobjetos de depresión de vidrio.
3. Adquiera imágenes de fluorescencia y campo brillante en un estereomicroscópica fluorescente conectado a una cámara digital utilizando la configuración estándar del filtro GFP. Utilice una configuración de adquisición de imágenes idéntica para todas las muestras.
4. Fusione imágenes de campo brillante y fluorescencia después de la adquisición con el software de procesamiento de imágenes.

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Resultados

Para esta demostración, se cruzó una línea reportera GFP sensible aC120 ( Tg (C120F: GFP)^ucm107) )con una línea transgénica que expresa TAEL-N ubicuamente desde el promotor de ubiquitina b (ubb) (Tg (ubb: TAEL-N)^ucm113)) para producir embriones transgénicos dobles que contienen ambos elementos. 24 h después de la fertilización, los embriones fueron expuestos a la activación de la luz azul, pulsados a una frecuencia de 1 h encendido / 1 h apagado. La induc...

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Discusión

Este protocolo describe el uso del sistema optogenético TAEL/C120 para lograr la expresión génica inducible por la luz azul. Este sistema consiste en un activador transcripcional, TAEL, que se dimeriza al iluminar con luz azul y activa la transcripción de un gen de interés aguas abajo de un elemento regulador C120. La expresión inducida de un reportero GFP se puede detectar después de tan solo 30 minutos de exposición a la luz, lo que sugiere que este enfoque posee una cinética relativamente rápida y receptiva....

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioRender web-based science illustration tool	BioRender		https://biorender.com/
Color CCD digital camera	Lumenara	755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD	Thorlabs	PM100D
Excitation filter, 545 nm	Olympus	ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit	GE Healthcare	95017-491
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)	Amazon	B017GWDF7E
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW Programmable digital timer switch	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mix	Quantabio	101414-286
Photoshop image procesing software	Adobe
Prism graphing and statistics software	GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	A28137
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light source	Excelitas	010-00326R	Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+