Estimulación dural y pruebas periorbitarias de von Frey en ratones como modelo preclínico de dolor de cabeza

Resumen

El síntoma más notable de la migraña es el dolor de cabeza severo, y se plantea la hipótesis de que esto está mediado por neuronas sensoriales que inervan las meninges. Aquí, presentamos un método para aplicar localmente sustancias a la duramadre de una manera mínimamente invasiva mientras se utiliza la hipersensibilidad facial como resultado.

Resumen

Se cree que las meninges craneales, compuestas por la duramadre, la aracnoidea y la piamadre, cumplen principalmente funciones estructurales para el sistema nervioso. Por ejemplo, protegen el cerebro del cráneo y anclan / organizan el suministro vascular y neuronal de la corteza. Sin embargo, las meninges también están implicadas en trastornos del sistema nervioso como la migraña, donde el dolor experimentado durante una migraña se atribuye a la inflamación estéril local y la posterior activación de las aferencias nociceptivas locales. De las capas en las meninges, la duramadre es de particular interés en la fisiopatología de las migrañas. Está altamente vascularizado, alberga neuronas nociceptivas locales y es el hogar de una amplia gama de células residentes, como las células inmunes. Los cambios sutiles en el microambiente meníngeo local pueden conducir a la activación y sensibilización de los nociceptores perivasculares durales, lo que conduce al dolor de migraña. Los estudios han tratado de abordar cómo los aferentes durales se activan / sensibilizan mediante el uso de electrofisiología in vivo, técnicas de imagen o modelos de comportamiento, pero estos comúnmente requieren cirugías muy invasivas. Este protocolo presenta un método para la aplicación comparativamente no invasiva de compuestos en la duramadre en ratones y un método adecuado para medir la sensibilidad táctil similar al dolor de cabeza utilizando pruebas de von Frey periorbitarias después de la estimulación dural. Este método mantiene la integridad de la duramadre y el cráneo y reduce los efectos de confusión de las técnicas invasivas mediante la inyección de sustancias a través de una cánula modificada de 0,65 mm en la unión de suturas sagitales y lambdoides no fusionadas. Este modelo preclínico permitirá a los investigadores investigar una amplia gama de estímulos durales y su papel en la progresión patológica de la migraña, como la activación de nociceptores, la activación de células inmunes, los cambios vasculares y los comportamientos de dolor, todo mientras se mantienen condiciones libres de lesiones en el cráneo y las meninges.

Introducción

El dolor de migraña sigue siendo un importante problema de salud pública en todo el mundo. La Organización Mundial de la Salud la clasifica como la sexta enfermedad más prevalente en el mundo, afectando a poco menos del 15% de la población de la Tierra¹ y causando una carga socioeconómica sustancial en la sociedad ^2,3. Las opciones de tratamiento y su eficacia han sido subóptimas y solo proporcionan alivio sintomático y no modifican significativamente los eventos fisiopatológicos que subyacen a la aparición de^{migrañas 4,5}. La falta de éxito del tratamiento se debe probablemente a que la migraña es un trastorno multifactorial cuya patología es poco conocida, lo que lleva a un número limitado de dianas terapéuticas. La migraña también es difícil de capturar completamente en modelos animales, especialmente dado que el diagnóstico de migraña se realiza en función de la comunicación verbal con pacientes que describen su experiencia con las características de la migraña como el aura, el dolor de cabeza, la fotofobia y la alodinia. No obstante, es importante tener en cuenta que los avances recientes en los tratamientos de la migraña actualmente están superando a los tratamientos para muchas afecciones neurológicas que han sido bien validadas por modelos preclínicos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales y las moléculas pequeñas que se dirigen al péptido relacionado con el gen de la calcitonina, o su receptor, han tenido mucho éxito en la mejora de la calidad de vida de los pacientes con migraña y pueden transformar potencialmente el tratamiento clínico de la migraña. Si bien ha habido avances en la comprensión de este trastorno, todavía hay mucho por dilucidar.

Sobre la base de modelos animales preclínicos y estudios en humanos, es ampliamente aceptado que las migrañas se inician por la activación aberrante de fibras nociceptivas dentro de las meninges que señalan a través de los ganglios trigémino y de la raíz dorsal cervical superior 6,7,8,9,10. A pesar de esta teoría, muchos estudios todavía utilizan la administración sistémica de medicamentos para comprender los mecanismos subyacentes que contribuyen a la migraña. Si bien la dosificación sistémica de medicamentos ha fortalecido sustancialmente nuestra comprensión, estos hallazgos no evalúan directamente si las acciones locales dentro del tejido objetivo de interés desempeñan un papel en la migraña. Por el contrario, varios estudios han adoptado un enfoque para estimular la duramadre; sin embargo, estos experimentos requieren la implantación de cánulas a través de una craneotomía invasiva y tiempos de recuperación prolongados^11,12. Debido a estas limitaciones, desarrollamos un enfoque mínimamente invasivo para estimular localmente la duramadre donde la falta de una craneotomía elimina la recuperación postquirúrgica y permite realizar pruebas inmediatas en animales despiertos 12,13,14. Estas inyecciones se realizan bajo anestesia ligera de isoflurano y se administran en la unión de las suturas sagital y lambdoide en ratones.

Se han desarrollado varios enfoques para evaluar las respuestas conductuales nociceptivas en roedores¹⁵. Se ha notificado alodinia cutánea en aproximadamente el 80% de los pacientes con migraña^16,17 y representa un posible criterio de valoración traslacional para su uso en roedores. En modelos preclínicos, la aplicación de filamentos de von Frey a la región plantar de la pata del roedor se ha utilizado para evaluar los comportamientos del dolor en modelos preclínicos de migraña. La principal limitación de este enfoque es que no prueba la región cefálica. La puntuación de la mueca facial se ha utilizado para capturar los comportamientos de dolor en roedores mediante el análisis de las expresiones faciales después de la inducción de estímulos de dolor^18,19. Sin embargo, sus limitaciones incluyen solo la captura de respuestas a estímulos agudos y no condiciones de dolor orofacial crónico. El aseo facial y la disminución de la crianza también se consideran salidas de respuestas conductuales en modelos preclínicos de migraña^20,21. Las limitaciones de los primeros incluyen dificultad para diferenciar las respuestas al dolor del aseo rutinario normal y otras sensaciones como la picazón. En el caso de este último, los comportamientos de cría generalmente disminuyen rápidamente después de la introducción de roedores en nuevos entornos. Aunque cada uno de estos criterios de valoración conductuales es valioso en la comprensión de varios mecanismos que contribuyen a las condiciones de dolor, existe una necesidad crítica de modelos preclínicos de trastornos del dolor como la migraña para incluir puntos finales que capturen específicamente las respuestas de hipersensibilidad cefálica. La evaluación de la hipersensibilidad táctil de la piel periorbitaria después de la estimulación dural es un método que puede proporcionar una mejor comprensión de los mecanismos que contribuyen a las migrañas donde los síntomas sensoriales son predominantemente de naturaleza cefálica. Aquí, describimos un método para administrar sustancias en la duramadre del ratón como un modelo preclínico de migraña. Después de la aplicación dural, también presentamos un método detallado para probar la hipersensibilidad táctil periorbitaria utilizando filamentos de von Frey calibrados aplicados en el método Dixon hacia arriba y hacia abajo.

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Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación previa del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Universidad de Texas en Dallas. En este estudio se utilizaron ratones ICR (CD-1) (30-35 g) y C57/BL6 (25-30 g) de 6 a 8 semanas de edad.

1. Infusor Dural

1. Cree los infusores/inyectores de ratón modificando una cánula interna e infusor disponible en el mercado para inyecciones unilaterales con una tapa de plástico de sílice fundida no metálica que es ajustable y se inserta en/se extiende por debajo de una cánula guía de 28 G con diámetro interior (I.D.) de 0,18 mm y un diámetro exterior (O.D.) de 0,35 mm (Figura 1A).
2. Use una pinza u otro dispositivo de medición para ajustar la tapa de plástico de sílice fundido en el infusor a una longitud de 0,6 mm; medido desde la punta del infusor hasta el borde de la tapa de plástico de sílice.
   1. Tenga cuidado de no doblar ni opacar el infusor al ajustar la tapa de plástico.
   2. Para otras cepas de ratón que no se han utilizado previamente para inyecciones durales, determine la longitud óptima del infusor estableciendo la longitud a 0,6 mm y realizando inyecciones piloto con tinta o tinte, ajustando la longitud del infusor hasta que se observe que el tinte está solo en la duramadre y no en el cerebro o el cráneo.
3. Conecte el extremo largo (o el extremo que no se midió para ser de 0,6 mm) del infusor ajustado a la tubería de plástico (tubería de la bomba, 2 pasos, I.D. 0,19 mm, longitud 406 mm).
   1. Corte el tubo a una longitud mínima de 8 pulgadas para asegurarse de que haya suficiente línea para sostener un volumen de 5 μL.
   2. Asegúrese de que el tubo cubra la parte metálica y la parte superior del tapón de plástico ubicado en el infusor. Esto ayudará a evitar que las burbujas de aire se acumulen en la línea.
4. Fije el otro extremo del tubo a una microjeringa de vidrio de 10 μL (hermética al gas; aguja cementada; 21 G con una proyección de 10 mm), nuevamente, asegurándose de tener un sello hermético sobre la parte metálica de la jeringa (Figura 1A).
5. Una vez que la línea esté conectada, rellene la jeringa con 5 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), líquido intersticial sintético (SIF) u otros vehículos de elección para evitar que se formen burbujas de aire.
   1. Si se observan burbujas de aire en la línea, inunde la línea con el vehículo hasta que las burbujas se hayan disipado.
      NOTA: Puede ser útil llenar la jeringa con el vehículo antes de conectarla a la línea y luego empujar el fluido a través de la línea una vez conectado.
6. Después de que la línea se vuelva a llenar con 5 μL del vehículo y funcione de manera eficiente, cargue 5 μL del medicamento / solución en la jeringa Hamilton (la tinta o el tinte se pueden usar como alternativa al medicamento / solución si aprende o practica esta técnica).
   1. Asegúrese de que todas las soluciones del vehículo administradas en la duramadre se mantengan a un pH 7.4 y se midan a una osmolalidad de 310. Esto reduce la activación potencial de los canales iónicos sensibles al ácido y otros canales osmosensibles dentro de la duramadre.
7. El volumen máximo probado en ratones que no causó fugas en el cerebro es de aproximadamente 10 μL. Los efectos conductuales después de las inyecciones con este volumen no se han probado. Por esta razón, administre solo 5 μL de la solución en la duramadre.
   NOTA: Estas observaciones se basan en las cepas de ratón / edades / pesos de ratones cd1 / ICR de 6-8 semanas de edad.

2. Inyecciones durales

1. Una vez que se prepara la jeringa y se carga el medicamento, coloque un ratón plano sobre su abdomen y anestéselo bajo un breve isoflurano al 3% con un caudal de oxígeno de 0.5-1 L / min a través de nosecone.
   1. Después de que el ratón ya no muestre un reflejo de pellizco, ajuste la anestesia y manténgala a un 1,5% de isoflurano.
2. Una vez anestesiado, aplique ungüento oftalmológico estéril en los ojos y afeite la cabeza del animal, luego desinfecte la piel con povidona yodada y etanol. Después de esto, póngase en una posición propicia para una inyección exitosa.
3. Use una mano para estabilizar la cabeza del animal y sostenga el infusor con la otra mano.
4. Sondee cuidadosamente y localice la unión de las suturas sagital y lambdoidal en el cráneo del ratón (Figura 1B, C).
   1. Para localizar esta unión discreta a través de la piel, use las características topográficas del cráneo y sondee suavemente la ubicación general de la unión con el infusor.
   2. Verifique la posición de la unión volviendo a colocar el infusor a lo largo del cráneo y sintiendo la ubicación exacta.
5. Una vez que la sutura esté ubicada y el infusor esté en su lugar, mueva muy lenta y suavemente el infusor hacia adelante y hacia atrás hasta que perfore la piel y caiga hacia abajo en la unión hasta el tapón de plástico.
   NOTA: Asegúrese de insertar toda la punta de 0,6 mm del infusor en la unión.
6. Para verificar la precisión, use tinta o tinte como solución inyectable y eutanasia y decapita al ratón.
   1. Retire la tapa del cráneo para visualizar el tinte dentro de la duramadre (Figura 1C).
      NOTA: El tinte no debe observarse en el cerebro o en el exterior del cráneo. Del mismo modo, los ratones en cualquier experimento deben ser revisados post mortem para verificar la precisión de la inyección, así como para garantizar que la integridad de la duramadre no se dañe.
7. Después de la inyección, retire al ratón de la anestesia, espere a que recupere la conciencia y luego regrese a su jaula o colóquelo en una cámara de prueba para comenzar los ensayos deseados.
   NOTA: Permita que el ratón se recupere de la anestesia durante un mínimo de 30 minutos antes de realizar cualquier experimento de comportamiento.

3. Periorbital von Frey

1. Comience el estudio con una cohorte de aproximadamente 16-20 ratones.
2. Uno el día anterior a la habituación, manipule cada ratón durante al menos 5 minutos.
3. Aproximadamente 24 h después de la manipulación, habitúe a los ratones a las condiciones de la sala de pruebas y al aparato de prueba de von Frey (Figura 2A).
   NOTA: El aparato de prueba de acrílico consiste en compartimentos individuales con tapas que son aproximadamente 3 en x 3.5 en x 5 in (W x H x D) y están soportados por soportes de aluminio conectados a través de 0.25 en alambre de malla de acero galvanizado cuadrado de 19 G.
   1. Coloque los ratones dentro de un vaso de papel blanco de 4 onzas colocado horizontalmente que sea inodoro y no contenga cera de polietileno o parafina.
      NOTA: Se prefieren estos tipos de tazas porque reducen el malestar gastrointestinal en los ratones si se ingieren (Figura 2B).
4. Mientras los animales están en sus respectivas cámaras, coloque un pellet de la dieta normal de chow en la cámara individual de cada ratón para calmar a los animales y evitar cualquier estrés innecesario para los animales. Haga esto durante 3 días antes de cualquier prueba de comportamiento de von Frey.
   1. Asegúrese de que cada vez que los ratones estén en la cámara haya acceso a los alimentos.
   2. Numere y asigne a cada animal al mismo espacio en el bastidor de prueba. Coloque el ratón en la misma taza todos los días del período de prueba para asegurarse de que cada animal se aclimate a su entorno de prueba.
      NOTA: Los ratones roerán las copas y posteriormente destruirán las tazas. Si esto sucede, reemplace la taza y etiquétela con el número de mouse correspondiente.
5. Después de los 3 días iniciales de habituación, coloque a los ratones en sus cámaras individuales.
   1. Permita que los animales se aclimaten a la sala de pruebas y las cámaras durante al menos 1 h antes de cualquier prueba de von Frey para permitir que los ratones se calmen y, posteriormente, sean más fáciles de probar.
6. Después de aclimatarse a la habitación el día de la prueba, retire un ratón mientras aún está en su taza de su cámara respectiva.
   1. Mantenga la copa en posición horizontal para que el ratón esté en las patas delanteras y traseras para ayudar a mantener su peso distribuido uniformemente.
      NOTA: La distribución desigual del peso puede alterar las respuestas de los animales e incluso evitar que los animales respondan.
7. Coloque la taza con el ratón dentro de la mesa debajo del bastidor de prueba en la almohadilla absorbente.
8. Para las pruebas periorbitarias de von Frey, coloque el filamento von Frey de 0,07 g directamente en el centro de la cara y entre los ojos.
9. Aplique suficiente presión sobre el filamento para hacer que el cabello de von Frey se doble en una formación en forma de "C".
   1. Mantenga el contacto con la región al menos 3 s pero no más de 5 s o hasta que el ratón retire la cabeza y golpee el filamento con su pata.
      NOTA: Si el filamento se desliza o más que la punta del filamento toca al animal durante la prueba, no se deben contar las respuestas. Estas respuestas pueden ser en respuesta al cepillo que son activadas por diferentes mecanorreceptores y, por lo tanto, pueden no reflejar resultados precisos.
   2. Aplicar filamentos von Frey según el método "arriba-abajo" de Dixon^22,23.
      1. Inicialmente, aplique el filamento von Frey que tiene un peso de 0,07 g. El filamento más bajo posible y el filamento más alto probado en este estudio son filamentos con pesos de 0,008 g y 0,6 g, respectivamente.
      2. Utilice los filamentos de peso 0.008 g, 0.02 g, 0.04 g, 0.07 g, 0.16 g, 0.4 g y 0.6 g para realizar este ensayo.
      3. En este método, si un animal no exhibe una respuesta al filamento, aplique el filamento del siguiente gramo de peso más alto.
      4. Si el ratón responde a un filamento, considere que el ratón responde a ese filamento. Si este es el caso, aplique el filamento del siguiente gramo de peso más bajo.
      5. Repita este patrón hasta que el animal sea probado 4 veces después de la respuesta inicial o se determine que el animal no responde a los filamentos probados en el ensayo.
         NOTA: Abstenerse de aplicar cualquier presión adicional derivada del brazo o la muñeca. Se puede utilizar una escala para practicar la aplicación del filamento.

4. Comprobación de los umbrales de retirada de referencia

1. Antes de su inclusión en un experimento, asegúrese de que los ratones alcancen un umbral de abstinencia basal entre 0,5-0,6 g.
   1. Un ratón alcanza la línea de base si no responde a ningún filamento probado en la serie mencionada en el paso 3.9.2.2 (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g y 0,6 g).
2. Pruebe a los ratones diariamente al establecer los umbrales de abstinencia basales.
   1. Las pruebas permiten a los animales aclimatarse a las condiciones de prueba y a la presión de los filamentos von Frey.
   2. Si los ratones todavía son extremadamente hipersensibles después del tercer día de prueba, intente esperar 1 o 2 días antes de volver a probar.
      NOTA: Demasiado tiempo entre los días de prueba puede resultar en que el animal no se ajuste al peso del filamento en su región periorbitaria, por lo que no alcanza el umbral de retirada objetivo.
3. Pruebe ratones durante aproximadamente 7 días antes de determinar qué animales no cumplen con los criterios de inclusión para un experimento.
   NOTA: Aproximadamente el 70% de los ratones alcanzarán el nivel basal objetivo.
   1. Antes de la estimulación dural, analice los datos de referencia para excluir a cualquier ratón que no haya alcanzado un valor basal de 0,5-0,6 gramos o superior.
   2. Después de la exclusión, asigne aleatoriamente cada ratón restante a un grupo de prueba. Logre esto sacando de una taza o escribiendo un guión en una hoja de cálculo para aleatorizar números a un grupo.

5. Análisis de los resultados de von Frey

1. Una vez obtenidas las series de respuestas, determinar el valor delta, k, el umbral del 50% y el umbral de retirada en gramos según los métodos publicados previamente²⁴.
2. Calcule el umbral de retirada utilizando esta fórmula WT = 10^(x*F+B),donde WT= umbral de retirada, F= umbral de retirada de pata calculado mediante el método de Chaplan, y B = regresión lineal de log (fuerza de flexión) = x*Número de filamento + B.
3. Trace los datos como umbral de retiro del 50% o umbral de retiro promedio en gramos.

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Resultados

Este método de inyección se utiliza para administrar estímulos en la duramadre de ratones para que puedan realizarse pruebas de comportamiento posteriores. La producción conductual más común medida con este modelo es la hipersensibilidad facial cutánea evaluada a través de von Frey 12,13,14. Aquí mostramos cómo se puede utilizar este modelo para evaluar las posibles contribuciones específicas del sexo a la patología ...

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Discusión

Los cambios desadaptativos en el sistema nociceptivo local en la duramadre se consideran un contribuyente clave a la fase de dolor de cabeza de los ataques de migraña a pesar de la falta de lesión tisular^25,26. Aquí el estudio presenta un método por el cual la estimulación mínimamente invasiva de la duramadre puede inducir hipersensibilidad táctil facial. La elucidación de los mecanismos y eventos involucrados en la activación del nociceptor dural sin ca...

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Materiales

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Stand with chicken wire	Custom		The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers	Custom		Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments	Touch test/Stoelting	58011	https://www.stoeltingco.com/touch-test.html