Ensayo de nucleósidos trifosfato hidrolasas en Toxoplasma gondii y Neospora caninum para el cribado de alto rendimiento utilizando un brazo robótico

Resumen

Las infecciones por Toxoplasma gondii y Neospora caninum se encuentran en humanos y animales y provocan graves problemas de salud. Los dos parásitos comparten nucleósidos trifosfato hidrolasas similares y desempeñan un papel importante en la propagación y la supervivencia. Establecimos un ensayo de alto estándar de las enzimas que requieren el uso de brazos robóticos.

Resumen

Los parásitos protozoarios infectan a los humanos y a muchos animales de sangre caliente. El Toxoplasma gondii, uno de los principales parásitos protozoarios, se encuentra comúnmente en pacientes VIH positivos, receptores de trasplantes de órganos y mujeres embarazadas, lo que resulta en una condición de salud grave, Toxoplasmosis. Otro protozoo importante, Neospora caninum, que tiene muchas similitudes con el Toxoplasma gondii, causa enfermedades graves en los animales, al igual que la encefalomielitis y la miositis-polirradiculitis en perros y vacas, lo que da lugar a terneros nacidos muertos. Todos ellos presentaban nucleósidos trifosfato hidrolasas (NTPasa) similares. Neospora caninum tiene una NcNTPasa, mientras que Toxoplasma gondii tiene una TgNTPasa-I. Se cree que las enzimas desempeñan un papel crucial en la propagación y la supervivencia. Con el fin de establecer compuestos y/o extractos que previnieran la infección por protozoos, nos centramos en estas enzimas para el descubrimiento de fármacos. El siguiente paso fue establecer un ensayo novedoso, altamente sensible y altamente preciso mediante la combinación de un ensayo de enzima bioquímica convencional con un ensayo fluorescente para determinar el contenido de ADP. También validamos que el nuevo ensayo cumple con los criterios para llevar a cabo un cribado de alto rendimiento (HTS) en las dos enzimas protozoarias. Realizamos HTS, identificamos 19 compuestos y seis extractos de dos bibliotecas de compuestos sintéticos y una biblioteca de extractos derivados de bacterias marinas, respectivamente. En este estudio, se ha introducido una explicación detallada sobre cómo llevar a cabo el HTS, incluyendo información sobre la preparación de reactivos, dispositivos, brazo robótico, etc.

Introducción

La robótica se ha establecido como herramientas sofisticadas y poderosas para lograr avances significativos en varios campos más allá de la industria y la ingeniería de fabricación, como la bioquímica, la biología molecular y la investigación clínica, y en particular HTS ^1,2,3. Toxoplasma gondii es un parásito importante y un eucariota parásito unicelular⁴ que causa graves problemas de salud en los seres humanos⁵ y en muchos animales homeotermos⁴, lo que resulta en infecciones que conducen a la toxoplasmosis, una afección particularmente grave en pacientes con SIDA⁶, receptores de trasplantes de órganos⁷ y mujeres embarazadas⁸. Neospora caninum perteneciente al Filo Apicomplexa⁹ infecta principalmente a perros y vacas⁶, lo que resulta en Encefalomielitis y Miositis-Polirradiculitis en perros^10,11 y aborto en vacas ^12,13. Además, Neospora caninum exhibe similitudes morfológicas y filogenéticas cercanas con Toxoplasma gondii ^9,14. Además, tienen un nucleósido trifosfato hidrolasa (NTPasa; EC3.6.1.15)¹⁴. Las enzimas son bastante diferentes de la ecto-ATPasa¹⁴ convencional. Estos parásitos generan una cantidad considerable de proteínas NTPasa, entre el 2% y el 8% de la proteína total y desempeñan un papel importante como enzimas inactivas en su estadio de taquizoíto¹⁵. Cabe señalar que en los gránulos secretores densos, estos se condensan¹⁶ y se secretan en la vacuola parasitófora¹⁶. Como carácter enzimático bioquímico, la NTPasa es activada por el ditiotreitol¹⁷. Se predice que los inductores, como el compuesto ditiol, una enzima no identificada como la ditiol-disulfuro oxidorreductasa, y otra presentan la misma naturaleza. Todavía no se han identificado en los parásitos. Sin embargo, la enzima desempeña un papel importante en la liberación de taquizoíto de las células huésped infectadas¹⁷.

Toxoplasma gondii tiene dos isoformas de NTPasa¹⁸: la enzima tipo I TgNTPasa-I y la enzima tipo II TgNTPasa-II¹⁸. El primero utiliza preferentemente nucleósidos de trifosfato como sustrato¹⁸. Este último hidroliza nucleósidos de trifosfato y difosfato¹⁸. La homología es del 97% en los niveles de aminoácidos¹⁸. Neospora caninum también tiene un ortólogo de TgNTPasa-I llamado NcNTPasa¹⁹. La homología es del 73% en los niveles de aminoácidos¹⁹. El Prof. Asai y el Prof. Harada generaron recombinantes de ambas NTPasa utilizando E. coli y cambiaron los mutantes constitutivamente activos de estos como se informó anteriormente²⁰. Amablemente obsequiaron a los dos mutantes activos. Ambas enzimas pueden convertir ATP en ADP in vitro²⁰. Muy recientemente, medimos la actividad de la NTPasa utilizando el contenido de ADP hidrolizado por las enzimas. Finalmente, logramos establecer el ensayo de alto estándar a través del proceso de determinación del contenido de ADP con una combinación de fluorescencia y reacción enzimática como se informó anteriormente^21,22. También realizamos cribado de alto rendimiento (HTS)²².

Este estudio presenta procedimientos detallados de un nuevo ensayo de alta precisión y rango dinámico²¹ y una explicación detallada sobre cómo preparar reactivos para medir la actividad enzimática y desarrollar la intensidad fluorescente utilizando un brazo robótico para HTS.

Protocolo

1. Expresión y purificación de TgNTPasa-I y NcNTPasa recombinantes

1. Preparar el plásmido de expresión e introducirlo a la E. coli. cepa BL21.
   NOTA: En un informe anterior se muestra información detallada sobre constructos y procedimientos¹⁴. En este estudio, tanto los mutantes constitutivamente activos TgNTPasa-I como los mutantes constitutivamente activos de NcNTPasa fueron amablemente obsequiados por el Prof. Asai y el Prof. Harada.

2. Preparación y colocación de la solución de reacción biofluorescente en la placa

1. Prepare 2 soluciones de reacción biofluorescentes como se describe en la Tabla 1 para 2 mL de mezcla maestra para un ensayo de 400 pocillos en formato de 384 pocillos.
2. Prepare las soluciones madre utilizando agua destilada (DW) para cada concentración indicada, con la excepción de la resazurina y la N-etilmaleimida. Disuelva los dos reactivos restantes con DMSO en la concentración adecuada. A continuación, almacene los reactivos a -30 °C hasta el momento de realizar los experimentos.
3. Agregue 15 μL de solución de reacción biofluorescente 2x a cada uno de los 368 pocillos (formato de 384 pocillos).
   NOTA: La primera placa sirve como depósito para tener suficiente reactivo para realizar experimentos dos veces.

3. Coloque los compuestos o extractos de prueba en el fondo de cada pocillo en la placa de ensayo

1. Coloque 0,5 μL de cada compuesto en la parte inferior de la placa utilizando un brazo robótico de la placa madre de la biblioteca, incluidos los compuestos de prueba.
2. Añada 0,5 μL de DMSO tanto para el control negativo como para el positivo.

4. Preparación de la mezcla de reacción enzimática y comienzo de la reacción

1. Prepare la solución de reacción enzimática como se indica en la Tabla 2.
2. Agregue NTPasa (la concentración final es de 0,0002 μg/mL) a 50 mL de la mezcla de reacción enzimática, mezcle rápidamente y transfiera a un depósito de plástico.
3. Proceda a inyectar simultáneamente 4,5 μL en cada pocillo, excepto en la línea de control negativo, utilizando el brazo del robot.
4. Agregue la misma cantidad de la mezcla de reacción enzimática con PBS en lugar de la enzima precedida por la inyección simultánea.
5. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante 10 min.

5. Realizar mediciones en tiempo real de las actividades enzimáticas utilizando un lector de microplacas

1. Después de 10 minutos de incubación, agregue simultáneamente 5 μL de solución de reacción biofluorescente 2x a cada pocillo inmediatamente usando el brazo del robot.
2. Detenga temporalmente el brazo del robot para sostener la solución en cada punta sobre el lugar donde se colocará la placa.
3. Una vez que la placa de ensayo esté en su lugar, reinicie el brazo del robot.
   NOTA: Para evitar la saturación del ADP generado, mida inmediatamente la intensidad fluorescente.
4. Gire rápidamente hacia abajo (200 x g durante 1 min) el plato y colóquelo en el lector de platos.
5. Inicie la medición en tiempo real de la fluorescencia a 540 nm/590 nm (excitación/emisión) cada minuto durante 1 h.

6. Análisis de resultados

1. Calcular los valores como la media ± el error estándar de la media (SEM) a partir de las muestras indicadas y replicadas en cada grupo experimental; Replique los experimentos para garantizar la coherencia.
2. Realizar la significación estadística utilizando una prueba t de Student.
3. Calcule los valores como estadísticamente significativos si los valores P son P < 0,05.
4. Calcule la relación señal-fondo (S/B), la relación señal-ruido (S/N) y el factor Z' utilizando las siguientes fórmulas:
   S/B = Ligando promedio/Vehículo promedio
   S/N = (ligando promedio - vehículo promedio)/vehículo de desviación estándar
   Factor Z' = 1 - (3 x ligando de desviación estándar + vehículo de desviación estándar)/(ligando promedio - vehículo promedio)
5. Asegúrese de que los factores S/B, S/N y Z' sean superiores a 3, 10 y 0,5, respectivamente.
   NOTA: Confirme si cada experimento cumple con el criterio general suficiente para realizar HTS como se indicó en informes anteriores ^23,24.

Resultados

Un principio del ensayo se resume en la Figura Suplementaria 1 y se basa en un informe previo^12,18. El ensayo se diseñó en un formato de 384 pocillos, como se muestra en la Figura 1. Se evitaron las líneas de extrema derecha e izquierda en el plato. Las dos líneas junto a las líneas de extremo izquierdo y derecho se utilizaron como control negativo y control positivo con o sin l...

Discusión

Logramos establecer un nuevo ensayo de alto rango dinámico y precisión con una combinación de un ensayo de enzima clásico y un ensayo fluorescente para ADP, que es el producto final a través de la ATPasa, incluidas Tg y Nc ATPasa²². Para llevar a cabo la HTS, es importante que el ensayo tenga mejores valores de factor S/B, S/N y Z' que un ensayo enzimático clásico^15,22. Además, omitir el paso de de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 stage-workstation EDR-384 SX	Biotec Co., Ltd.	EDR-384SX	Robot arm Pippeting system
384 well tips	Biotech Co., Ltd.		Custom made
ADP-hexokinase	Asahi Kasei Pharma Co., Ltd.	T-92
ATP	Oriental Yeast, Co, Ltd.	45140000
BSA	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	011-15144
Diaphorase-I	Unitika Ltd.	Di-1
DMSO	Nacalai Tesch, Inc.	13406-55
G6P dehydrogenase	Oriental Yeast, Co, Ltd.	306-50143
Glucose	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	049-31165
Greiner 384 well micro-plate non-binding shallow well Black		#784900
HEPES	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	342-01375
Mg(CH3COO)2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	130-00095
NADP	Oriental Yeast, Co, Ltd.	44332000
N-ethylmaleimide	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	056-02062
PHERAstar FS	BMG LABTECH JAPAN L.t.d.	PHERAstar FS	Multimode microplate reader
Resazurin	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	191-07581
Seahorse Labware 384 Well Low profile reservoirs		S30022 25/CS
TrisHCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	W01COBQE-4120
Triton X-100	Nacalai Tesch, Inc.	35501-02