Enfoque genético inverso para identificar reguladores de pigmentación usando pez cebra

Resumen

Los reguladores de las funciones de los melanocitos gobiernan las diferencias visibles en el resultado de la pigmentación. Descifrar la función molecular del gen de pigmentación candidato plantea un desafío. Aquí, demostramos el uso de un sistema modelo de pez cebra para identificar candidatos y clasificarlos en reguladores del contenido de melanina y el número de melanocitos.

Resumen

Los melanocitos son células especializadas derivadas de la cresta neural presentes en la piel epidérmica. Estas células sintetizan pigmento de melanina que protege el genoma de las radiaciones ultravioletas dañinas. Las perturbaciones en el funcionamiento de los melanocitos conducen a trastornos pigmentarios como piebaldismo, albinismo, vitiligo, melasma y melanoma. El pez cebra es un excelente sistema modelo para comprender las funciones de los melanocitos. La presencia de melanocitos pigmentados conspicuos, la facilidad de manipulación genética y la disponibilidad de líneas fluorescentes transgénicas facilitan el estudio de la pigmentación. Este estudio emplea el uso de líneas de pez cebra transgénicas y de tipo salvaje que impulsan la expresión de proteínas fluorescentes verdes (GFP) bajo promotores mitfa y tyrp1 que marcan varias etapas de los melanocitos.

El silenciamiento basado en morfolino de genes candidatos se logra para evaluar el resultado fenotípico en la pigmentación larvaria y es aplicable a la detección de reguladores de pigmentación. Este protocolo demuestra el método desde la microinyección hasta la disección de fenotipos basada en imágenes y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando dos genes candidatos, anhidrasa carbónica 14 (Ca14) y una variante de histona (H2afv), para evaluar exhaustivamente el resultado de la pigmentación. Además, este protocolo demuestra la segregación de genes candidatos en especificadores y diferenciadores de melanocitos que alteran selectivamente el número de melanocitos y el contenido de melanina por célula, respectivamente.

Introducción

Si bien el uso de melanina para la fotoprotección ha evolucionado varias veces en todo el reino animal, los vertebrados aparentemente han perfeccionado el proceso. Las células dedicadas productoras de pigmento con una maquinaria elaborada para sintetizar y contener melanina se conservan desde los peces hasta los humanos¹. Sin embargo, el resultado de la pigmentación es dramáticamente variado, variando en el color a la recipiencia y se presenta como patrones vívidos en los tegumentos, la piel y el cabello². A pesar de la diversidad, el repertorio de genes implicados en la respuesta de pigmentación se conserva sorprendentemente. Los componentes centrales de la maquinaria sintetizadora de melanina, como las enzimas sintetizadoras de melanina clave, los componentes de los melanosomas y la conectividad aguas arriba a la vía de señalización, siguen siendo esencialmente idénticos en todos los organismos. Las diferencias genéticas sutiles provocan cambios dramáticos en los patrones de pigmentación observados en todas las especies³. Por lo tanto, un enfoque genético inverso en un organismo vertebrado inferior, el pez cebra (Danio rerio), ofrece una excelente oportunidad para descifrar la participación de los genes en la representación del estado pigmentado⁴.

Los embriones de pez cebra se desarrollan de un cigoto fertilizado unicelular a una larva en un lapso de ~ 24 h después de la fertilización (hpf) ⁵. Sorprendentemente, las células equivalentes a melanocitos, los melanóforos, son células grandes que están presentes en la dermis y son visibles debido al contenido de melanina oscura⁶. Estas células derivadas de la cresta neural emanan ~11 hpf y comienzan a pigmentar ~24 hpf ^6,7. Los módulos de expresión génica conservados han permitido la identificación de factores clave que orquestan las funciones de los melanocitos y han llevado al desarrollo de líneas reporteras fluorescentes transgénicas Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) y Tg(ftyrp1:GFP)8,9,10 que marcan etapas selectivas del desarrollo de melanocitos. El uso de estas líneas de peces transgénicos permite interrogar la biología celular de los melanocitos a nivel de organismo en el contexto del tejido con señales apropiadas de acuerdo con los plazos de desarrollo. Estos reporteros complementan la cuantificación basada en pigmentos de los melanocitos y permiten una evaluación distinta del número de melanocitos independientemente del contenido de melanina.

Este artículo proporciona un protocolo detallado para descifrar la biología de los melanocitos mediante la evaluación de dos parámetros críticos, a saber, el contenido de melanina y el número de melanocitos. Mientras que el primero es una lectura funcional común que emana de una respuesta de hipopigmentación, el segundo se asocia con una reducción en la especificación o supervivencia de los melanocitos y a menudo se asocia con condiciones de despigmentación genética o adquirida. La estrategia general de esta prueba genética inversa es silenciar genes seleccionados usando un morfolino e investigar los resultados específicos de los melanocitos. El contenido de melanina se analiza utilizando la cuantificación basada en imágenes de los valores grises medios seguida de la confirmación mediante un ensayo de contenido de melanina. El número de melanocitos en diversas etapas de maduración se analiza mediante cuantificación basada en imágenes y se confirma mediante el análisis FACS. Aquí, el protocolo de detección se demuestra utilizando dos genes candidatos, a saber, la anhidrasa carbónica 14, involucrada en la melanogénesis, y una variante de histona H2AFZ.2 involucrada en la especificación de melanocitos de la población precursora de la cresta neural. Mientras que el primero altera el contenido de melanina y no el número de melanocitos, el segundo altera el número de melanocitos especificados y, en consecuencia, el contenido de melanina en el embrión. En general, este método proporciona un protocolo detallado para identificar el papel de un gen candidato en la pigmentación y distinguir su papel en el control del número de melanocitos frente al contenido de melanina.

Protocolo

Los experimentos con pez cebra se realizaron en estricta conformidad con la aprobación ética animal institucional (AICE) del CSIR-Instituto de Genómica y Biología Integrativa (IGIB), India (Propuesta n.º 45a). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.

1. Inyección de morfolino en embriones de pez cebra

1. Usando un extractor de agujas estándar, dibuje pipetas muy afiladas y de punta cerrada.
2. Cargue la solución que contiene morfolino en las micropipetas utilizando una punta de microcargador e insértela en el aparato microinyector. Apriete el tornillo correctamente para bloquear la micropipeta.
   NOTA: La estandarización de la dosis de morfolinos es necesaria. La dosis adecuada tiene una tasa de supervivencia del >70% y un fenotipo específico a 24 hpf.
3. Cortar la punta de la micropipeta con pinzas finas y calibrarla¹¹.
4. Para calibrar, inyecte 1 volumen de solución de morfolino en el tubo capilar desde la micropipeta, manteniendo el tiempo de inyección en 1 s. Repita esto cinco veces. Usando el estándar, 1 mm = 30 nL de volumen, encuentre el volumen inyectado en 5 s manteniendo el tubo capilar contra una escala de medición. Utilizando la información anterior, calcule el tiempo (en segundos) requerido para inyectar 1-3 nL por inyección¹².
   NOTA: El estándar, 1 mm = 30 nL, es específico para los ajustes de presión del microinyector y el diámetro del capilar utilizado para la calibración. Idealmente, la inyección debe hacerse en la interfaz yema-célula, que se forma dentro de los 15-20 minutos posteriores a la fertilización. Para facilitar las inyecciones múltiples, el desarrollo puede retrasarse ligeramente manteniendo los embriones a una temperatura más baja (18 °C). Sin embargo, esto debe mantenerse al mínimo y no extenderse más allá de 30 minutos debido al efecto compuesto de una temperatura más baja sobre los cambios en la expresión génica.
5. Monte los embriones en una placa de Petri fundida en agarosa (60 mm). Apila los embriones firmemente dentro de las crestas. Usando pipetas de vidrio pulido al fuego, alinéelas en la orientación adecuada para la inyección.
6. Bajo un microscopio, use manipuladores para acercar la micropipeta al embrión e inyecte dentro de la interfaz yema-célula presionando el interruptor de pie.
7. Inyecte todos los embriones de manera similar; recogerlos en una placa de Petri que contenga un medio acuoso de embrión fresco e incubar a 28 °C.
8. Compruebe los embriones inyectados después de 6-8 h. Retire todos los embriones muertos identificables debido a su alta opacidad y siga cambiando el agua del embrión al menos una vez al día para evitar infecciones.

2. Análisis de pigmentación

1. Preparación para contar melanóforos laterales de la línea media en embriones de pez cebra de 3 dpf
   1. Tratar los embriones con anestesia neuromuscular al 0,016% para inmovilizarlos.
   2. Para montar los embriones para la obtención de imágenes, agregue unos mililitros de metilcelulosa al 1,5-2% en la placa de Petri (60 mm) para que forme una capa delgada. Con una pipeta Pasteur, escoja embriones y colóquelos suavemente en metilcelulosa para restringir el movimiento adicional durante la obtención de imágenes.
   3. Ajuste su posición para obtener imágenes laterales (franja dorsal, franja ventral, raya vitemina y melanóforos de línea media) o dorsales (melanóforos en la parte dorsal de la cabeza) óptimas. Para una mejor resolución de los melanóforos adyacentes, imagen con mayor aumento (>5x)
2. Imágenes de campo claro
   NOTA: Las imágenes de campo claro se realizan utilizando un microscopio estereoscópico con un aumento de 8-10x.
   1. Coloque la placa de Petri que contiene los embriones de pez cebra bajo el microscopio. Usando un manipulador, ajuste el pez en tal orientación para que las cinco rayas embrionarias de melanocitos sean visibles (dorsal, ventral, dos laterales, yema) simultáneamente (Figura 1C). Capture imágenes rápidamente con el software de adquisición. En caso de que el animal recupere el movimiento antes de ser fotografiado, vuelva a sumergirlo en anestesia y proceda con la obtención de imágenes una vez que esté lo suficientemente inmovilizado.
   2. Repita esto con todos los peces y asegúrese de que la ampliación siga siendo la misma para cada imagen.
3. Cálculo del valor gris medio con el software ImageJ
   1. Tomar imágenes dorsales y laterales de embriones de pez cebra de 2 dpf.
   2. Abra la imagen que se va a cuantificar en ImageJ con la herramienta Abrir . Utilice la herramienta de forma a mano alzada para delinear el área para el análisis. Vaya a la opción Establecer medidas y seleccione Valor gris medio | área. Presione M (o Analizar | Medida) para calcular el valor gris medio para el área seleccionada.
   3. Manteniendo constante el área a analizar, calcule el área gris media para cada animal por separado.
   4. Trazar un gráfico de barras con los datos adquiridos (Figura 2F).
4. Ensayo de contenido de melanina
   1. A 2 dpf, use una pipeta Pasteur de vidrio para recolectar ~ 25 embriones de pez cebra.
   2. Realice la descorionación manual con agujas de insulina de 1 ml y agréguelas a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
   3. Deseche el medio embrionario con cuidado y agregue 1 ml de tampón de lisis helada (20 mM de fosfato de sodio (pH 6.8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) con cóctel inhibidor de proteasa y prepare lisados de proteínas por sonicación.
   4. Disolver los lisados en 1 ml de NaOH de 1 N e incubar las muestras a 100 °C durante 50 min en un baño maría. Vórtice intermitentemente para homogeneizar los lisados por completo.
   5. Tome lecturas de absorbancia de las muestras a 490 nm utilizando un espectrofotómetro.
   6. Calcule el contenido de melanina comparando la absorbancia de la muestra con una curva estándar de concentraciones conocidas de melanina sintética (Figura 2G).

3. Recuento de melanóforos

NOTA: El análisis de fluorescencia en embriones transgénicos de pez cebra se puede realizar por dos métodos: 1) contar células positivas para GFP; 2) medición de la intensidad de la fluorescencia.

1. Preparación para el recuento basado en el sistema de control de los datos sobre el terreno de células positivas para GFP en embriones tempranos de pez cebra
   1. Recoja 200-250 embriones ftyrp:GFP y lávelos en un colador con agua de embriones simple. Como control negativo, procesar embriones de tipo salvaje (Assam Wildtype) negativos para GFP y emparejados en estadio¹².
   2. Según la etapa de interés, transfiera los embriones a una placa de Petri que contenga 0,6 mg / ml de pronasa. Después de 5-10 minutos, utilizando una pipeta Pasteur, transfiera los embriones descorionados a una placa de Petri fresca que contenga agua embrionaria. Con una pipeta de vidrio Pasteur, recoja ~100 embriones y transfiéralos a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
   3. Deseche el medio con cuidado y agregue 200 μL de solución de Ringer helada (tampón de desyolking). Manteniendo el tubo en hielo, pipetear el contenido hacia arriba y hacia abajo ~ 20 veces hasta que la yema se disuelva. Centrifugar los tubos a 100 × g durante 1 min en una centrífuga de sobremesa a 4 °C. Centrifugar de nuevo y desechar con cuidado el sobrenadante.
   4. Con una pipeta de 1 ml, transferir los embriones desyemados a una placa de Petri que contenga 10 ml de solución de tripsina (tampón de disociación celular). Realizarlo en múltiples placas de Petri para evitar el hacinamiento de los embriones y la tripsinización ineficiente. Use una pipeta de 1 ml, mezcle la solución que contiene los cuerpos embrionarios una o dos veces para disminuir la agregación.
   5. Incubar las placas de Petri a temperatura ambiente durante 15 min (embriones de <24 hpf) o 30 min (embriones de 24-30 hpf). Aspirar y dispensar la suspensión ocasionalmente usando una pipeta de 1 ml para ayudar a la desintegración de las células.
   6. Durante el período de incubación, inicialice la máquina del citómetro de flujo para el recuento de células.
   7. Coloque un filtro de células de 70 μm sobre un tubo cónico de 50 ml y pase la suspensión tripsinizada a través del filtro para obtener una suspensión de una sola célula. Lave las placas de Petri con la misma suspensión unas cuantas veces para eliminar las células adheridas a la superficie.
   8. Girar las muestras a 450 × g, 4 °C durante 5 min en un rotor de cangilón oscilante.
   9. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada.
   10. Girar de nuevo a 450 × g, 4 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante.
   11. Finalmente, resuspender el pellet en PBS + 5% de suero bovino fetal y mantenerlo en hielo hasta que se ejecute el FACS.
2. Preparación del citómetro de flujo
   1. Encienda el citómetro de flujo e inicie el arranque.
      NOTA: Antes de encender la máquina, vacíe el cubo de basura y llene el tanque de líquido de la vaina.
   2. Normalice el flujo de la corriente para una boquilla de 70 μm (u 85 μm). Déjelo sin perturbaciones durante 10-15 minutos si es inestable.
3. Recuento de células marcadas con fluorescencia con un citómetro de flujo
   1. Inicialice una nueva carpeta de experimentos y haga un diagrama de dispersión de dispersión hacia adelante versus dispersión lateral y un histograma de intensidad de isotiocianato de fluoresceína (FITC).
   2. Cargue primero las celdas de tipo comodín para establecer las puertas de dispersión delantera y lateral (para excluir dobletes y escombros) y el umbral FIFC.
   3. Después de establecer las puertas, retire la muestra y cargue las células aisladas de embriones Tg (ftyrp1: GFP) para contar los melanocitos.
      NOTA: Aquí, como ftyrp1:GFP etiqueta específicamente los melanocitos maduros, el número de células GFP positivas bajo la puerta FITC corresponderá al número de melanocitos.
   4. Repita el paso anterior con muestras inyectadas con morfolino para estimar y comparar el número de melanocitos con el control.
4. Medición de la intensidad de fluorescencia en embriones de pez cebra
   1. Usando una pipeta de vidrio Pasteur, recolectar 100-120 embriones y transferirlos a una placa de Petri que contenga agua de embriones simple.
   2. A ~10-12 hpf, transfiera los embriones a 0.003% 1-fenil-2-tiourea para inhibir la pigmentación.
   3. Realice la descorionación manual utilizando agujas de insulina para obtener imágenes de embriones de <48 hpf.
   4. Para inmovilizar embriones, trátelos con tricaína al 0,016%.
   5. Para montar embriones para imágenes, coloque unos pocos ml de metilcelulosa al 1,5-2% en la placa de Petri (60 mm) para que forme una capa delgada. Agregue los embriones a la metilcelulosa para restringir cualquier movimiento adicional durante la obtención de imágenes. Coloque la placa de Petri que contiene las muestras bajo el microscopio. Con la punta de una pipeta, ajuste el animal en la orientación deseada.
   6. Adquiera imágenes utilizando el software de adquisición. Para embriones <24 hpf, capture todo el embrión a la vez con un aumento de 10x. Para etapas de >24 hpf, adquiera múltiples campos de escaneo y posteriormente ensamble (cose) juntos.
   7. Repita esto con todos los peces y asegúrese de que el ajuste para la adquisición permanezca constante durante todo el experimento.
5. Cuantificación
   1. Analice la imagen más a fondo utilizando el software ImageJ.
   2. Abra la imagen que se va a cuantificar en ImageJ con la herramienta Abrir .
   3. Utilice la herramienta de forma a mano alzada para delinear el área para el análisis (Figura 3E).
   4. Presione M (o Analizar | Medida) para adquirir una medida de intensidad de área seleccionada.
   5. Manteniendo constante el área a analizar, calcule la intensidad media por área para cada animal por separado.

Resultados

El flujo de trabajo descrito en la Figura 1 se utilizó para realizar perturbaciones genéticas basadas en morfolinos en la etapa unicelular del pez cebra. El análisis de pigmentación se realizó utilizando varios métodos, como se menciona a continuación. Para ilustrar los resultados representativos, se inyectaron volúmenes estandarizados de morfolino antisentido dirigidos a los genes h2afv y ca14 en la etapa de yema o de una célula del embrión de pez cebra. El fenot...

Discusión

El fenotipo de pigmentación a menudo se manifiesta como alteraciones en el contenido de melanina o en el número de melanocitos que contienen pigmento. El método descrito en este documento permite la disección de esta dicotomía y permite una evaluación cualitativa y cuantitativa del contenido de melanina y del número de melanóforos por embrión, independientemente del contenido de melanina. La alta fecundidad del pez cebra, la naturaleza visible de los melanocitos pigmentados y la falta de transferencia de melanos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-A	For preparing MO solution
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C	For washing steps in FACS protocol
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	For microinjection
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	For cell sorting
Capillary tube	Drummond	1-000-0010
Corning cell strainer	Corning	CLS431751	For making single cell suspension
DMEM High Glucose Media	Sigma-Aldrich	D5648	FACS protocol
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	to immobilize ZF for imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	For cold lysis buffer
FACS tubes	BD-Biosciences	342065	FACS protocol
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	10270	FACS protocol
Graphpad prism Software	Graphstats Technologies	NA	For data representation
ImageJ Software	National Institute of health	NA	For image analysis
Insulin Syringes (1 mL)	DispoVan	NA	For manual dechorionation
Melanin, Synthetic	Sigma-Aldrich	M8631	For melanin content assay
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027-250G	to immobilize ZF for imaging
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	For microinjection
Morpholino	Gene-tools	NA	For knock-down experiments
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	to inhibit melanin formation
Needle puller	Sutter Instrument	P-97	For microinjection
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS protocol
Petridish (60 mm)	Tarsons	460090	For embryo plates
Phenylmethylsulphonyl fluoride	Sigma-Aldrich	10837091001	For cold lysis buffer
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	For washing cells
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	For dechorionation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For cold lysis buffer
Sheath fluid	BD FACSFlowTM	342003	FACS protocol
Sodium phosphate	Merck	7558-79-4	Cold lysis buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	For cold lysis buffer
TrypLE	Gibco	1677119	For trypsinization